廚余垃圾堆肥腐熟降解菌株的篩選與鑒定

王小兵 王海潮 汪曉麗 陳悅 程通 付寬寬

摘要：本研究旨在篩選廚余垃圾高效腐熟降解菌。采用秸稈平板培養(yǎng)基、剛果紅培養(yǎng)基進行菌株的初篩，利用秸稈降解試驗、濾紙崩解試驗以及酶活性的指標進行復篩。結果表明，通過初篩獲得了5株降解菌，其中菌株Y1、Y3的水解圈直徑（H）與菌落直徑（D）的比值（H/D）較大，分別為4.4、3.8，秸稈降解率分別達到42.50%、40.94%，而且2株菌株纖維素酶活性協(xié)同性較高。通過形態(tài)學和16S rDNA序列分析進行菌株種屬的鑒定，菌株Y1、Y3均屬于芽孢桿菌菌屬（Bacillus），其中菌株Y1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），菌株Y3為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

關鍵詞：腐熟降解菌;纖維素酶活性;序列分析;芽孢桿菌

中圖分類號：S182;S141.4?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）23-0213-06

收稿日期：2021-07-02

基金項目：國家自然科學基金面上項目（編號：41471236）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（20）3082、CX（17）3043];蘇州市科技計劃（編號：SNG2018088）。

作者簡介：王小兵（1976—），男，江蘇東臺人，博士，副教授，主要從事有機固廢廢棄物資源化利用等研究。E-mail：xbwang@yzu.edu.cn。

廚余垃圾是指家庭、飯店以及各種餐飲機構拋棄的剩菜剩飯的統(tǒng)稱[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國在“十三五”末廚余垃圾產(chǎn)生量達到1.5×105 t/d，預計“十四五”期間將達到2.0×105 t/d[2]。目前，廚余垃圾的處理方式主要有焚燒、填埋、粉碎直排、肥料制作[3]。其中，肥料制作是廚余垃圾資源化利用的主要方式之一。而好氧堆肥又是肥料化處理廚余垃圾的主要方法[4]。由于廚余垃圾含有大量纖維素，而纖維素具有復雜的分子結構，很難被自然降解[5-6]，制約了堆肥腐熟的周期。相關研究結果表明，通過在堆肥中添加纖維素降解菌可以有效縮短堆肥腐熟的周期[7-8]。李雯等通過在玉米秸稈中加入纖維素降解菌使堆肥腐熟時間縮短3～5 d[7]。吳慶珊從羊糞中篩選出纖維素降解菌，將其加入羊糞中，縮短了堆肥腐熟周期[8]。目前，關于篩選廚余垃圾腐熟降解菌的報道較少。

本研究旨在篩選廚余垃圾腐熟降解菌，以提高廚余垃圾腐熟效率，為廚余垃圾資源化利用提供技術支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株來源：樣品取自蘇州市傲龍環(huán)保有限公司廚余垃圾處理廠，取回的樣品放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要培養(yǎng)基

赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)液[9]：KH2PO4 0.5 g，NaCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，NaNO3 1.25 g，F(xiàn)eCl3 0.005 g，CaCl2 0.05 g，蒸餾水500 mL，pH值7.2左右。

秸稈平板粉培養(yǎng)基：瓊脂粉9 g，小麥秸稈粉 5 g，赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)液500 mL。

秸稈產(chǎn)酶培養(yǎng)基：水稻秸稈粉10 g，赫奇遜氏無機鹽培養(yǎng)液500 mL。

濾紙崩解培養(yǎng)基[10]：1 cm×6 cm的濾紙條3條，KH2PO4 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，（NH4）2SO4 0.3 g，酵母粉0.01 g，蒸餾水100 mL。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，NaCl 5 g，酵母浸膏2.5 g，蒸餾水500 mL，pH值7.2。

以上培養(yǎng)基都在120 ℃下高溫滅菌30 min。

1.3 菌株初篩

取10 g低溫保存的堆肥于90 mL的無菌水中，放在（30 ℃，200 r/min）的恒溫振蕩箱中振蕩 30 min，取下后靜置10 min，取懸浮液1 mL，用無菌水稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 5個梯度濃度，吸取100 μL 10-5梯度的稀釋液，均勻涂布于以秸稈為唯一碳源的秸稈平板培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)基放在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，選取菌落直徑較大的5株菌株進行分離與純化，采用劃線法純化單菌落。將純化好的菌株涂布在斜面培養(yǎng)基中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，放于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將純化好的菌株分別接種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基，放置于恒溫培養(yǎng)箱（30 ℃）中培養(yǎng)5 d，用 1 g/L 的剛果紅溶液染色20 min后棄去染液，再用1 mol/L的氯化鈉溶液洗滌30 min，根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值（H/D）初篩出產(chǎn)纖維素酶能力較強的菌株。

1.4 秸稈降解試驗

將篩選出的產(chǎn)纖維素酶較強的菌株制成菌懸液，分別取10 mL菌懸液轉接至秸稈降解培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱（30 ℃、160 r/min）中培養(yǎng)12 d后取出秸稈。用蒸餾水反復沖洗5次，80 ℃烘至恒質量，每個處理做3個平行。秸稈的降解率按照減質量法計算[11]：秸稈降解率=[原秸稈質量（g）-烘干秸稈質量（g）]/原秸稈質量（g）×100%。

1.5 濾紙條崩解試驗

將篩選得到的菌株制成菌懸液，分別將5 mL菌懸液轉接至濾紙條崩解培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中（40 ℃，160 r/min）培養(yǎng)10 d，以未接種菌株的培養(yǎng)液做空白對照，觀察濾紙的崩解情況。

1.6 纖維素酶活性測定

1.6.1 粗酶液制備 選取秸稈降解能力較強的幾株菌株制成菌懸液，分別取10 mL菌懸液轉接至液體產(chǎn)酶培養(yǎng)液中，在恒溫培養(yǎng)箱（30 ℃，120 r/min）中連續(xù)培養(yǎng)15 d，每隔24 h取培養(yǎng)液8～10 mL，取出的培養(yǎng)液用0.45 μm的水系濾頭過濾，過濾液即為粗酶液。

1.6.2 酶活力測定 葡萄糖標準曲線參照張冬雪等的方法[12]進行繪制。

纖維素酶是多酶復合物，包含3種主要成分，即內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，這3種酶活性的測定方法參考于慧娟等方法[13]。酶活力定義為1 mL原酶液每分鐘催化底物產(chǎn)生1 μg對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位（μmol/mL）[14]。

1.7 菌株種屬鑒定

參照《伯杰氏菌株鑒定手冊（第8版）》《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和革蘭氏染色法，對菌株進行形態(tài)學鑒定[15-16]。

參考Yu等的方法[17-18]提取細菌總DNA。正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應體系為20 μL，反應條件為：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共28個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送至上海凌恩生物科技有限公司進行測序。將測序得到的菌株DNA序列在NCBI中進行Blast序列比較分析。用MEGA 7.0構建菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 堆肥中纖維素降解菌的初篩

從秸稈培養(yǎng)基中篩選出菌落直徑較大的5株菌株，分別命名為Y1、Y2、Y3、S1、C1。5株菌株在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中的透明圈直徑與菌落直徑的比值（H/D）見圖1、表1。其中菌株Y1的透明圈直徑與菌落直徑的比值（H/D）最大，二者之比達到了4.4，菌株Y2的透明圈直徑與菌落直徑的比值（H/D）最小，僅為1.8。通過對比選取透明圈直徑與菌落直徑比值（H/D）較大的4株菌株Y1、Y3、S1、C1進行下一步研究。

2.2 秸稈降解試驗

將初篩選出的4株菌株制成菌懸液，分別取 5 mL 的菌懸液接種到秸稈降解培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 10 d，通過降解前后秸稈的質量比，比較不同菌株對秸稈的降解效果。結果顯示，接種過菌株Y1、Y3的秸稈培養(yǎng)基中秸稈的降解效果最好，秸稈降解率分別達42.50%、40.94%。秸稈降解率較低的是菌株S1、C1，秸稈降解率分別為19.69%、16.31%（圖2）。

2.3 濾紙崩解試驗

濾紙的降解情況可以體現(xiàn)出菌株產(chǎn)酶能力的強弱。從表2可以看出，培養(yǎng)10 d后，在接種了菌株Y1的培養(yǎng)基中，濾紙基本上被完全分解形成糊狀（++++），在接種了菌株Y3的培養(yǎng)基中濾紙崩解形成近似糊狀（+++），而接種了菌株S1、C1的培養(yǎng)基中，濾紙的崩解效果稍差，形成了若干不同大小的塊狀（++），作為對照的培養(yǎng)基中，濾紙基本上無任何變化（+）。通過對比發(fā)現(xiàn)，篩選出的4株菌株都具有使濾紙崩解的能力，其中菌株Y1對濾紙的崩解效果最好，菌株Y3對濾紙的崩解效果次之，菌株S1、C1對濾紙的崩解效果較差。該結果與秸稈降解試驗的結果完全符合，驗證了秸稈降解結果的可靠性。

2.4 不同菌株纖維素酶活性測定

纖維素酶是多酶復合物，包含3種主要成分，即內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[13]。將菌株Y1、Y3 、S1、C1制成菌懸液，分別接種至液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15 d。分別測量4株菌株每天的外切葡聚糖酶活性、內切葡聚糖酶活性和 β-葡萄糖苷酶活性。

從圖3可以看出，在連續(xù)15 d的培養(yǎng)過程中，4株菌株的外切葡聚糖酶活性在整體上都呈現(xiàn)出先增后降的趨勢， 在6 d時達到最大， 其中菌株Y1的

最大外切葡聚糖酶活性強于其他3株菌株，達到了21.54 μmol/mL，菌株Y3的最大外切葡聚糖酶活性僅低于菌株Y1，為 20.53 μmol/mL，較差的是菌株C1、菌株S1，它們的最大外切葡聚糖酶活性分別為13.31、10.80 μmol/mL。

從圖4可以看出，菌株Y1、菌株Y3的內切葡聚糖酶活性在前6 d呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，在6 d時達到峰值，分別為25.63、23.69 μmol/mL，隨后出現(xiàn)下降趨勢，這與它們的內切葡聚糖酶活的變化趨勢相似。菌株S1在前13 d內外切葡聚糖酶活呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，在13 d時達到最大，為33.41 μmol/mL，隨后快速下降，在達到最大值的2 d內切葡聚糖酶活降為10.99 μmol/mL。菌株C1的內切葡聚糖酶活在3 d達到最大，最大值為26.36 μmol/mL，隨后出現(xiàn)緩慢下降的趨勢。

從圖5可以看出，菌株Y1的β-葡萄糖苷酶活性的變化趨勢與它的內、外葡聚糖酶活性的變化趨勢相似，即先增后降。在6 d時菌株Y1的β-葡萄糖苷酶活性達到最大，最大值為18.41 μmol/mL。菌株S1的β-葡萄糖苷酶活性在前6 d呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，7 d 時達到最大值，最大值為10.70 μmol/mL，隨后開始下降。在1～5 d，菌株C1的β-葡萄糖苷酶活性呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，6 d時酶活性相較于 5 d 時有了大幅度提高，在7 d時達到最大，最大值為 16.67 μmol/mL。相較于其他3株菌株，菌株Y3在整個試驗周期中β-葡萄糖苷酶活性一直處于較低水平，但它的整個變化趨勢與它的內、外葡聚糖酶活性相似，即先增后降，在6 d時達到最大，最大值為8.84 μmol/mL。

2.5 菌株形態(tài)學鑒定

通過秸稈降解試驗、濾紙崩解試驗和菌株酶活性的測定最終選出菌株Y1、菌株Y3進行下一步形態(tài)學的鑒定。

對2種菌株進行形態(tài)學鑒定，鑒定結果：菌株Y1為白色、表面粗糙不規(guī)則、邊緣不平整、不透明、難以挑取;菌株Y3近似圓形，白色、不透明、邊緣較平整、表面光滑、中間凸起、易挑取。革蘭氏染色結果全呈藍紫色，為革蘭氏陽性菌。

2.6 菌株種屬鑒定

為了確定菌株Y1、Y3的分類學地位，將2株菌株測序得到的16S rDNA序列提交到NCBI進行Blast比對，利用MEGA 7.O軟件中的鄰接法構建2株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。進化樹構建時使用嗜堿甲烷桿菌（Methanobacterium alcaliphilum，AB496639.1）作為外類群，其他近源物種的選擇通過Blast以及NCBI Taxonomy數(shù)據(jù)庫確定。從進化樹來看，菌株Y1、Y3均屬于芽孢桿菌（Bacillus），其中菌株Y1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis strain YEBN5，MT372156.1）聚在同一支（圖6），菌株Y3 與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis strain FZB42，NR_075005.2）進化距離最近，聚在同一支（圖7）。在NCBI上提交菌株序列后獲得2株菌株的登錄號，分別為MW767002和MW757344。

3 討論與結論

目前，大部分纖維素降解菌在初篩過程中使用剛果紅染色法進行初篩，這樣會造成菌落間的混雜以及假陽性現(xiàn)象。本研究先用秸稈培養(yǎng)基進行篩選，再用剛果紅染色法進一步篩選可以避免這一情況[13]。秸稈培養(yǎng)基初篩出的3株菌株透明圈直徑（H）與菌落直徑（D）的比值（H/D）都大于3，高于高雙喜等的研究結果[19-20]，表明腐熟的廚余垃圾有機肥中存在纖維素降解能力強的菌株。

通過初篩選出的4株菌株對秸稈的降解結果與對濾紙的崩解結果一致，說明各菌株對濾紙的崩解效果可以反應出各菌株的纖維素降解能力，其中效果較好的是菌株Y1、Y3。在纖維素酶活性測定中，菌株Y1的內、外葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活峰值均處于較高水平，分別為25.63、21.54、18.41 μmol/mL，本結果高于眾多已有報道[5，9]，王洪媛等篩選出2株纖維素降解菌W3和98MJ，它們的纖維素酶活性分別在4.17～9.46、 2.95～5.78 μmol/mL之間[9]。 張海艷等從土壤中篩選出2株菌株WL1、WL2，它們的纖維素酶活力分別為0.005 3、0.005 9 μmol/mL[5]。

在連續(xù)15 d的產(chǎn)酶試驗周期中，可以發(fā)現(xiàn)4株菌株都具有內切葡聚糖酶活性、外切葡聚糖酶活性和 β-葡萄糖苷酶活性，且4株菌株纖維素酶活性的變化趨勢相同，即先增后降。菌株Y1、菌株Y3的3種酶活性都在6 d時達到最大，而菌株S1、C1的3種酶活性峰值出現(xiàn)在不同的時間。菌株Y3的外切葡聚糖酶活性和β-葡萄糖苷酶活性小于菌株S1和C1，但它的秸稈降解結果和濾紙崩解結果都要強于菌株S1和C1，可能的原因是菌株Y3的3種酶活性峰值都出現(xiàn)在同一天，表明3種纖維素酶具有很強的協(xié)同作用，協(xié)同性越高菌株的纖維素降解能力越強[21]。

經(jīng)鑒定，菌株Y1、Y3都屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。其中，菌株Y1屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），具有較好的降解效果，這與周東興等的研究結果[22-23]一致;菌株Y3屬于貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），該菌株是芽孢桿菌中的一個新種，屬于革蘭氏陽性好氧細菌，菌體成桿狀，內生孢子，具有廣普抗菌活性[24-25]。目前關于貝萊斯芽孢桿菌的研究主要集中在誘導系統(tǒng)抗性、抑菌物質及其基因簇鑒定、拮抗機制等方面[25-27]，在纖維素降解能力方面的研究報道較少。Chen等采用基因組學分析了24株貝萊斯芽孢桿菌，表明其對纖維素具有潛在的降解能力[28]。本次試驗的研究結果進一步證實貝萊斯芽孢桿菌與其他降解菌株相比較具有較強的纖維素降解效果。

本研究篩選出的菌株Y1、菌株Y3均具有較強的纖維素降解能力，后期將研制以菌株Y1、菌株Y3為主的廚余垃圾腐熟降解復合菌劑，以提高廚余垃圾腐熟降解效率，為廚余垃圾無害化、資源化利用提供技術支持和理論依據(jù)。

本研究從腐熟的廚余垃圾堆肥中初篩選出5株纖維素降解菌，經(jīng)過秸稈降解試驗、濾紙崩解試驗以及3種酶活性的測定，確定菌株Y1、菌株Y3在篩選出的5株菌株中具有較強的纖維素降解能力。通過對菌株Y1、菌株Y3進行形態(tài)學以及菌株種屬的鑒定，鑒定結果表明，2株菌株均屬于芽孢桿菌（Bacillus），其中菌株Y1屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、菌株Y3屬于貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis） 。

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