脊髓性肌萎縮癥攜帶者產(chǎn)前篩查的幾種實(shí)用技術(shù)

李吉明 邢清和

(上海市婦幼保健中心，上海 200062)

脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophy，SMA)是發(fā)病率居于第二位的嚴(yán)重染色體隱性遺傳病，僅次于囊性纖維病，屬于遺傳運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病，病理機(jī)制主要是通過脊髓前角細(xì)胞的變性，導(dǎo)致對(duì)稱性近端肌肉無(wú)力[1]。

SMA由Guido Werdnig首次報(bào)道于1891 年，具有明顯的表型異質(zhì)性，根據(jù)發(fā)病年齡不同，SMA被分為5種亞型[2]，其中O型為嬰兒型，呼吸衰竭是早期關(guān)注點(diǎn)，一般存活不超過6個(gè)月。Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型均為兒童型，Ⅰ型為嚴(yán)重型，也最常見，占SMA患者45%，多數(shù)由于SMN1基因同源缺失引起，一般患兒在出生后6個(gè)月內(nèi)發(fā)病，2歲前因呼吸衰竭死亡。Ⅱ型為中度型，約占患者中20%，Ⅱ型患者6～18個(gè)月內(nèi)患病，存活在2年以上；大約30%患者為Ⅲ型，輕度型，18歲內(nèi)患病，預(yù)后良好，可長(zhǎng)期存活。Ⅱ、Ⅲ型SMA幾乎是由于SMN1至SMN2的基因轉(zhuǎn)化所致，故輕型SMA患者攜帶有較多的SMN2拷貝[3，4]。Ⅳ型為成人型，發(fā)病年齡多在18歲及以上，約占5% ，發(fā)病緩慢、肢體近端無(wú)力逐漸加重、肌肉萎縮，可伴肌束震顫，本型預(yù)后良好，基本不影響壽命。

遺傳流行病學(xué)研究顯示，人群中SMA致病突變的攜帶者頻率高達(dá)1/54[5]～1/40[6]?；谖覈?guó)人群的大樣本量研究顯示，我國(guó)人群中SMA致病突變的攜帶者頻率和世界平均水平近似，介于1/54[7]和1/84[8]之間，以此估算，每10 000～25 000新生兒中就有1人患病。由于遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，各種SMA的檢測(cè)方法也快速涌現(xiàn)，基于人群的SMA致病突變篩查已在多個(gè)國(guó)家開展，本文僅對(duì)常用的脊髓性肌萎縮癥攜帶者篩查方法，希望為后續(xù)大規(guī)模做篩查提供借鑒。

1 SMA的遺傳學(xué)機(jī)制

1995年，Lefebvre等[9]確定運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因(SMN)是SMA的致病基因，SMN位于染色體5q11.2-q13.3，編碼全長(zhǎng)294個(gè)氨基酸、分子量為38kDa的蛋白質(zhì)，物種間高度保守，全身組織普遍表達(dá),在脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中SMN表達(dá)豐度最高[10]。SMN基因包含2個(gè)高度同源的反向基因：近端粒的SMN1或SMNt(OMIM#600354)和近著絲粒的SMN2或SMNc(OMIM#601627)。SMN1和SMN2序列只有5個(gè)核苷酸差異，一個(gè)在內(nèi)含子6，一個(gè)在外顯子7，內(nèi)含子7中有2個(gè)，外顯子8中有1個(gè)[11]。7號(hào)外顯子840位置的轉(zhuǎn)換(C→T)是一個(gè)重要功能突變，該突變是SMN1和SMN2編碼序列唯一的突變，攜帶該突變的SMN2只能產(chǎn)生野生型水平的約10%的完整蛋白，且穩(wěn)定性較差，功能下調(diào)，而SMN1是產(chǎn)生SMN完整功能蛋白的主要基因[12]。SMN1突變可導(dǎo)致SMA表型，突變的主要形式是SMN1部分外顯子缺失或是基因全長(zhǎng)缺失，而SMN2拷貝數(shù)數(shù)量則和SMA的嚴(yán)重程度有關(guān)[13]。NAIP的拷貝數(shù)與SMA嚴(yán)重性也有一定關(guān)聯(lián)，NAIP基因拷貝數(shù)變化可以影響SMA病情嚴(yán)重程度[14]。

SMN1基因第7、8 外顯子(E7、E8)是突變熱點(diǎn)，目前認(rèn)為在超過95%的Ⅰ～Ⅲ型[15]SMA 患者中存在SMN1基因純合缺失，具體表現(xiàn)為SMN1 E7、E8 序列同時(shí)缺失，或僅有SMN1 E7序列缺失，只有約5%的患者是由SMN1發(fā)生其他微小突變、雜合缺失或SMN1向SMN2轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的SMN1缺失[16，17]。

2 攜帶者類型

SMN1野生型為雙拷貝，但也有人為不同程度的拷貝數(shù)重復(fù)，拷貝數(shù)可從重復(fù)一次到幾次不等[18]。SMA純合缺失的患者SMN1拷貝數(shù)為0。

SMA攜帶者主要有4種基因型：SMN1 基因在一條染色體上的順式重復(fù)和反式缺失的復(fù)合體“2+0”型[19]；2條同源染色體上，1條染色體上有1拷貝野生型的SMN1基因，另1條缺失SMN1基因的為“1+0”型；1條染色體上有1拷貝SMN1基因，另1條SMN2基因發(fā)生微小突變的“1+1m”型；1條染色體上有2拷貝SMN1基因，另1條SMN1基因發(fā)生突變的“2+1m”型；“1+0”型攜帶者最常見，約占95%，其他約占5%[20]。因而對(duì)SMN1拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，就可以篩查出大部分SMN1拷貝數(shù)為1的攜帶者和拷貝數(shù)為2以上的健康人。因而通過檢測(cè)SMN1拷貝數(shù)可篩查區(qū)分健康者和攜帶者。

SMA攜帶者沒有任何臨床表現(xiàn)，如果父親和母親均是攜帶者，則后代有25%的概率獲得2個(gè)有缺陷的基因拷貝而顯示SMA表型。

3 脊髓性肌萎縮癥攜帶者常用篩查方法

3.1 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA) MLPA是Schouten等于2002年發(fā)明的一項(xiàng)基因診斷新技術(shù)，主要用于基因片段缺失/重復(fù)、染色體非整倍體等的檢測(cè)，可檢測(cè)出基因純合缺失、雜合缺失和拷貝數(shù)增加等基因拷貝數(shù)量的變化[21]。

MLPA檢測(cè)包含靶向SMA基因關(guān)鍵區(qū)域的多個(gè)探針，特異性探針與SMN1、SMN2基因雜交后進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物和參照序列的比值，評(píng)價(jià)SMN1和SMN2的拷貝數(shù)。無(wú)論是SMN1純合或雜合缺失還是向SMN2的轉(zhuǎn)化都可檢測(cè)，篩查結(jié)果可靠，已被許多國(guó)家管理部門批準(zhǔn)用于臨床檢測(cè)。MLPA檢測(cè)基本步驟如下，經(jīng)過DNA變性、探針雜交、連接和熒光引物 PCR 擴(kuò)增，進(jìn)行片段分離和數(shù)據(jù)分析，整個(gè)過程耗時(shí)24h左右。

丁宇等[22]通過對(duì)3名疑似患者和其父母外周血標(biāo)本，提取基因組DNA，應(yīng)用MLPA試劑盒進(jìn)行分析，MLPA圖譜可直觀顯示SMN1基因與SMN2基因信號(hào)峰值的變化。將每個(gè)樣本中每對(duì)探針產(chǎn)物峰的相對(duì)峰面積，再除以標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣本中相對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物峰的中位值，即得到比值，也就是該序列的相對(duì)拷貝數(shù)，最后校正后得到絕對(duì)拷貝數(shù)。結(jié)果不僅診斷出患兒SMN1基因的7號(hào)和8號(hào)外顯子的拷貝數(shù)皆為0，為純合缺失，同時(shí)也檢測(cè)出3例患兒父母SMN1基因的7號(hào)和8號(hào)外顯子的拷貝數(shù)屬于1拷貝范圍，屬于雜合缺失的攜帶者。

羅福薇等[23]使用MLPA方法對(duì)15 例患者的父母都檢測(cè)出外顯子7 和外顯子8 雜合缺失，同時(shí)檢測(cè)的44 例無(wú)SMA家族史的健康成人，未發(fā)現(xiàn)SMN1基因外顯子7 和8 的缺失，很好地證實(shí)了MLPA對(duì)SMA攜帶者的篩查作用。

但MLPA對(duì)雜質(zhì)污染極其敏感，在制備樣品和操作該技術(shù)時(shí)需要非常小心，雖然最低20ng DNA可用于檢測(cè)，但是100～200ng DNA模板是臨床檢測(cè)推薦的模板量[24]。

3.2 PCR-變性高效液相色譜(PCR-denaturing high performanceliqu id chromatography, PCR-DHPLC) DHPLC是一種新的高通量篩選DNA序列變異的新技術(shù)，這一技術(shù)最先由美國(guó)Stanford大學(xué)Oefner及Underhill等于1995年報(bào)道，其特點(diǎn)是高通量、自動(dòng)化程度高、靈敏度及特異度均較高，更適合大片段DNA的篩查，檢測(cè)快速，價(jià)格相對(duì)低廉，檢測(cè)結(jié)果以圖表顯示，方便判斷[25]。

PCR-DHPLC已經(jīng)成為了SMA篩查的主流方法，龔波等[26]和譚建強(qiáng)等[8]都用此方法做了大規(guī)模攜帶者篩查。主要都是應(yīng)用多重PCR結(jié)合DHPLC進(jìn)行SMN1和SMN2基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，首先通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，再采用DHPLC半定量方法檢測(cè)。 PCR-DHPLC圖形前2個(gè)峰是內(nèi)參峰，后2個(gè)峰是SMN2、SMN1，待測(cè)樣本SMN1、SMN2拷貝數(shù)通過和正常對(duì)照結(jié)果的比較計(jì)算得出，篩查出SMN1拷貝數(shù)為1的脊髓性肌萎縮癥攜帶者。

3.3 熒光定量PCR 熒光定量PCR又稱qPCR，是一項(xiàng)常見分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。對(duì)核酸進(jìn)行定量分析，應(yīng)用廣泛，用于檢測(cè)基因的表達(dá)量?？蓪?duì)片段的拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)進(jìn)行分析，對(duì)基因進(jìn)行分型，對(duì)DNA要求低，適用于組織、新鮮血液DNA樣本和干血斑DNA樣本[27]。其原理為通過監(jiān)控反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度的變化，記錄檢測(cè)熒光達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)(Ct值)。理論上說(shuō)，起始模板量和Ct值密切相關(guān)，因此我們通過判讀Ct值對(duì)樣本進(jìn)行定量。

任晨春等[28]對(duì)臨床確診為SMA的5例患兒及其父母同時(shí)用定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative fluorescence polymerase chain reaction，QF-PCR)方法檢測(cè)，4例患兒SMN1的E7、E8均表現(xiàn)為純合缺失，其父母都表現(xiàn)為SMN1 E7、E8均雜合缺失的攜帶者。1例檢測(cè)出SMN1 E7純合缺失，E8雜合缺失的患者，其母親檢測(cè)出基因型為SMN1 E7、E8的雜合缺失，父親僅表現(xiàn)為SMN1基因E7的雜合缺失，E8無(wú)缺失改變。QF-PCR方法與MLPA法檢測(cè)的結(jié)果比對(duì)，完全一致。

熒光定量PCR對(duì)于SMN1基因的檢測(cè)，主要是比較標(biāo)本中SMN1基因與健康對(duì)照的相對(duì)量以推定其拷貝數(shù)，所以采用無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)定量方法。由于缺失1個(gè)SMN1基因模板與野生型之間基因的拷貝數(shù)差異僅為1倍，體現(xiàn)在Ct值上的變化非常小，所以每次檢測(cè)標(biāo)本時(shí)一般同時(shí)檢測(cè)3例健康對(duì)照標(biāo)本，通過公式計(jì)算得到目的基因相對(duì)參比基因的拷貝數(shù)。這種目的基因相對(duì)定量模式，無(wú)需制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，可靈敏地檢測(cè)出基因拷貝數(shù)的差異[29]。

目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)有幾家公司的熒光定量檢測(cè)試劑盒已經(jīng)取得了CFDA的證書，檢測(cè)方便，通過熒光定量PCR 擴(kuò)增就可檢測(cè)，通過標(biāo)準(zhǔn)化判讀，總共2～3h內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)，得到結(jié)果。

3.4 微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR) 數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)是新型分子診斷技術(shù)，通過有限稀釋將樣本分到許多獨(dú)立的區(qū)室，每個(gè)區(qū)室最多包含1個(gè)拷貝的PCR模板，大多數(shù)區(qū)室并不包含PCR模板分子。PCR反應(yīng)時(shí)，多個(gè)區(qū)室同時(shí)平行獨(dú)立擴(kuò)增。擴(kuò)增完成，通過熒光信號(hào)的有無(wú)，計(jì)數(shù)陰性和陽(yáng)性區(qū)室的數(shù)量，可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量?，F(xiàn)已在遺傳病分子診斷中使用，可準(zhǔn)確檢測(cè)0～3拷貝的SMN1基因和0～5拷貝的SMN2基因。dPCR方法非特異性擴(kuò)增少，檢測(cè)SMN1和SMN2基因拷貝數(shù)CV值優(yōu)于TaqMan探針法qPCR技術(shù)檢測(cè)的CV值[30]。

Vidal-Folch等[4]用ddPCR方法檢測(cè)干血斑樣本，通過特殊設(shè)計(jì)的引物和探針，不僅能篩查SMA攜帶者，還能篩查出一定的SMN1“2+0”基因型。

dPCR對(duì)DNA要求低，干血斑就能檢測(cè)，拷貝數(shù)檢測(cè)準(zhǔn)確，不易被PCR反應(yīng)抑制劑所干擾。同時(shí)檢測(cè)成本和其他方法相當(dāng)。

4 總結(jié)

脊髓性肌萎縮作為常染色體隱性遺傳病，人群攜帶率較高，父母雙方都是攜帶者，生育患兒的概率有25%，50%可能會(huì)生育攜帶SMA致病基因的子女。臨床上還沒有行之有效的治療方法，支具或矯形器進(jìn)行干預(yù)可延緩疾病進(jìn)展，相關(guān)藥物直到2019年2月底，用于治療5q SMA的反義寡核苷酸藥物諾西那生鈉注射液(Nusinersen，曾用名 IONIS-SMNRX，商品名Spinraza)在我國(guó)獲批，雖然上市后國(guó)內(nèi)SMA患者無(wú)藥可用的局面被打破，但普通患者家庭能否承擔(dān)藥物費(fèi)用仍存疑問，且需反復(fù)鞘內(nèi)注射，終身用藥且費(fèi)用昂貴[31]。

產(chǎn)前篩查利用分子遺傳篩查技術(shù)，可以從源頭降低脊髓性肌萎縮的患兒出生，是一種經(jīng)濟(jì)有效的出生缺陷控制方法?？尚械暮Y查方式是對(duì)備孕婦女進(jìn)行攜帶者篩查，如判斷為攜帶者，則對(duì)其配偶進(jìn)行攜帶者篩查，如果夫妻雙方均為攜帶者，則需在妊娠時(shí)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，根據(jù)診斷結(jié)果配合遺傳咨詢采取臨床干預(yù)措施，防止受檢者生出SMA患兒。

MLPA分析作為SMA分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，診斷性高，但是儀器大型，實(shí)驗(yàn)室配置不普遍，且運(yùn)行易受雜質(zhì)干擾、操作復(fù)雜且耗時(shí)長(zhǎng)。PCR-DHPLC技術(shù)敏感度高，特異性好，成本低廉，是目前大規(guī)模人群樣本篩查常用的技術(shù)。熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，所需熒光定量PCR儀器，實(shí)驗(yàn)室配置比較普遍，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)判別方便，同時(shí)試劑有CFDA證書。熒光定量PCR技術(shù)成本低、靈敏度高、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，同時(shí)操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)步驟少，無(wú)需開蓋檢測(cè)等特點(diǎn)，可作為新型大規(guī)模篩查方法。ddPCR屬于絕對(duì)定量，擁有高靈敏度、高準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)過程不易被PCR反應(yīng)抑制劑干擾，對(duì)DNA要求低，干血斑就能檢測(cè)，作為攜帶者篩查，未來(lái)有很大的利用空間。

對(duì)于不同樣本類型檢測(cè)方面，熒光定量PCR和ddPCR可以使用干燥血斑DNA進(jìn)行檢查，但是有發(fā)現(xiàn)干燥血斑DNA是單鏈的、高度碎片化的，并且容易被RNA污染，不太可能支持精確測(cè)定拷貝數(shù)。所以有條件建議用新鮮血液DNA進(jìn)行攜帶者篩查，以得到更準(zhǔn)確的結(jié)果[32]。

上述的這些篩查技術(shù)還存在一些弊端，會(huì)漏檢約5%的特殊突變攜帶者，如“2+0”型、“2+1m”型、“1+1m”基因型。后續(xù)提高篩查準(zhǔn)確率，進(jìn)一步全部篩查出所有攜帶者還是需要解決的問題。

另外如何宣傳和推廣SMA基因篩查也是個(gè)社會(huì)問題。只有多方努力，加強(qiáng)宣傳力度，提高認(rèn)知率，同時(shí)篩查做到檢出率高，結(jié)果準(zhǔn)確，價(jià)格合適，大眾才能更好地接受檢測(cè)，從而讓SMA攜帶者篩查得到更大的普及，降低SMA的患病率。