基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析新生兒先天性巨細(xì)胞病毒感染的臨床特征

朱娟 李玲 易慧 劉淵 張琪 詹文麗

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 510010)

人類巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是發(fā)生母嬰垂直傳播疾病的常見(jiàn)原因，在發(fā)達(dá)國(guó)家，新生兒先天性HCMV感染率為0.2%～2.4%[1-3]，我國(guó)的新生兒先天性HCMV感染率為0.7%[4，5]。大約10%～15%的HCMV感染胎兒在出生時(shí)為有癥狀感染，臨床表現(xiàn)包括胎兒生長(zhǎng)受限、低出生體重和中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及多器官受累，導(dǎo)致大約90%的存活嬰兒出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。10%～15%的無(wú)癥狀先天性CMV感染的嬰兒會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)期后遺癥，包括進(jìn)行性感音神經(jīng)性聽(tīng)力障礙和智力發(fā)育遲緩[6]。在一項(xiàng)為新生兒篩查收集的干血樣本研究中，在早產(chǎn)兒和低出生體重兒中先天性HCMV感染的患病率明顯增高[7]，而在新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房住院的嬰兒中先天性HCMV感染的患病率也高于總體人口[8，9]。有研究表明，早期診斷和抗病毒藥物干預(yù)可以改善有癥狀感染兒童的神經(jīng)預(yù)后，對(duì)先天性感染高危新生兒進(jìn)行檢測(cè)可以準(zhǔn)確診斷和早期治療。

有研究報(bào)道使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可以準(zhǔn)確測(cè)量尿液中HCMV-DNA copies/ml，并與新生兒癥狀程度存在一定的相關(guān)性，對(duì)HCMV先天性感染新生兒是否有后遺癥風(fēng)險(xiǎn)是較好的評(píng)估指標(biāo)。當(dāng)HCMV-DNA拷貝數(shù)5×104copies/ml時(shí)約70%新生兒會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，當(dāng)HCMV-DNA拷貝數(shù)<3.5×103copies/ml時(shí)僅有4%新生兒會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常[10]，但與新生兒各系統(tǒng)損傷的關(guān)系尚未完全確定。本研究旨在通過(guò)對(duì)新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房(neonatal intensive care unit，NICU)住院的嬰兒進(jìn)行尿液HCMV-DNA檢測(cè)，分析先天性HCMV感染新生兒的臨床特征、治療及轉(zhuǎn)歸，并為后續(xù)的治療方案提供思路。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性研究2016年1月至2018年12月在廣東省婦幼保健院新生兒科收治出生14天內(nèi)的新生兒，根據(jù)新生兒先天性HCMV感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，對(duì)其進(jìn)行尿液HCMV-DNA檢測(cè)，其中75例新生兒診斷為先天性HCMV感染。排除其他先天性或圍產(chǎn)期感染(如單純皰疹病毒、梅毒)的新生兒。

1.2 研究方法

1.2.1 尿液標(biāo)本 收集使用無(wú)菌尿液收集袋收集尿液后，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌樣本管后，保存在-20℃以備檢測(cè)。

1.2.2 HCMV-DNA提取及檢測(cè) 取1ml新生兒尿液嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取步驟進(jìn)行DNA的提取后，取2μl嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)采用實(shí)時(shí)熒光定量法進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每次PCR擴(kuò)增反應(yīng)均設(shè)置陰性對(duì)照進(jìn)行質(zhì)控，試劑盒均由中山大學(xué)達(dá)安基因公司提供。

1.2.3 總結(jié)先天性感染HCMV新生兒 HCMV-DNA結(jié)果、臨床癥狀、住院天數(shù)及疾病轉(zhuǎn)歸。

1.2.4 聽(tīng)力篩查 采用耳聲發(fā)射篩查進(jìn)行聽(tīng)力篩查，如果聽(tīng)力篩查發(fā)現(xiàn)異常，新生兒將接受更精確的聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)、聽(tīng)覺(jué)穩(wěn)態(tài)反應(yīng)篩查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用描述性方法對(duì)計(jì)數(shù)資料使用頻數(shù)和率表示，對(duì)于計(jì)量資料以均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組定性資料間的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 共有75例HCMV-DNA檢測(cè)陽(yáng)性新生兒，男嬰43例，女?huà)?2例。體重810～3460g，平均體重(1620±96)g，年齡1～14d，平均年齡(8.0±0.4)d，其中20例為足月兒，55例為早產(chǎn)兒(28～36孕周)。

2.2 臨床診斷 根據(jù)國(guó)內(nèi)外指南對(duì)HCMV先天性感染新生兒癥狀進(jìn)行分類[12]，75例HCMV先天性感染新生兒常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)中黃疸占76%(57/75)、肺炎占74.7%(56/75)、貧血占42.6%(32/75)、顱內(nèi)出血占36%(27/75)。將足月兒及早產(chǎn)兒進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)貧血及室管膜下囊腫差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表1。

表1 75例新生兒先天性巨細(xì)胞感染的臨床特征

2.3 HCMV-DNA檢測(cè)結(jié)果75例感染新生兒尿中HCMV-DNA 平均數(shù)值(1.79×105)copies/ml[(5.1×102～2.5×107)copies/ml]，其中56%(42/75)的HCMV-DNA 在(5.0×102～9.9×102)copies/ml之間，18.6%(14/75)的HCMV-DNA在(1.0×103～9.9×103)copies/ml之間，25.3%(19/75)>9.9×103copies/ml，根據(jù)結(jié)果及時(shí)使用更昔洛韋抗病毒治療。將HCMV-DNA 數(shù)值與臨床癥狀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)24例貧血新生兒HCMV-DNA[≥(1.0×103)copies/ml]明顯高于18例非貧血新生兒[<(1.0×103)copies/ml]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體見(jiàn)表2。

表2 75例新生兒HCMV-DNA Copies/ml數(shù)值與臨床癥狀相關(guān)性分析

2.4 聽(tīng)力測(cè)試 通過(guò)耳聲發(fā)射篩查聽(tīng)力，共計(jì)13例未通過(guò)聽(tīng)力測(cè)試，其中3例為單側(cè)聽(tīng)力測(cè)試未過(guò)，1例為足月兒，12例為早產(chǎn)兒，HCMV-DNA數(shù)值高低與聽(tīng)力測(cè)試異常沒(méi)有顯著性差異。

2.5 HCMV先天性感染 新生兒預(yù)后新生兒平均住院天數(shù)39d(3～116)d，其中早產(chǎn)兒平均住院天數(shù)(41±5)d，足月兒平均住院天數(shù)(25±3)d。1例死亡，17例自動(dòng)出院，均存在3及3個(gè)系統(tǒng)以上的損害。76%(57/75)新生兒痊愈出院。

3 討論

新生兒巨細(xì)胞感染主要由宮內(nèi)感染(先天性感染)、分娩期產(chǎn)道接觸感染、產(chǎn)后母乳喂養(yǎng)感染等途徑獲得感染[13]，約5%～10%的先天性HCMV感染新生兒有臨床癥狀，臨床表現(xiàn)為宮內(nèi)發(fā)育遲緩、肝脾腫大、黃疸、皮疹、血小板減少、紫癜、小頭畸形、顱內(nèi)鈣化[6]。有17%～20%將有異常的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，主要是先天性感音神經(jīng)性耳聾(congenital sensorineural hearing loss，SNHL)、認(rèn)知延遲、神經(jīng)運(yùn)動(dòng)損傷、智力精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、視神經(jīng)萎縮、患有脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎和廣泛中央病變的嬰兒可能有視覺(jué)障礙[14，15]。在本研究中，75例HCMV先天性感染新生兒常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)中黃疸占76%(57/75)、肺炎占74.7%(56/75)、貧血占42.6%(32/75)、顱內(nèi)出血占36%(27/75)，本研究將足月兒及早產(chǎn)兒進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)貧血及室管膜下囊腫差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與HCMV先天性感染報(bào)道癥狀相似。由于HCMV感染臨床表現(xiàn)為常為多系統(tǒng)損害，可能為HCMV感染可導(dǎo)致促炎性變化，對(duì)胎盤發(fā)育和功能、病毒傳播和胎兒存活率有重要影響[16，17]。

對(duì)疑似HCMV感染新生兒進(jìn)行HCMV篩查是有必要的，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)尿液中的CMV-DNA進(jìn)行普遍篩查及早期檢測(cè)，可識(shí)別有聽(tīng)力損失和認(rèn)知延遲風(fēng)險(xiǎn)的嬰兒,通過(guò)早期使用抗病毒藥物干預(yù)可能會(huì)改善癥狀性感染的神經(jīng)系統(tǒng)損害及預(yù)后[18，19]。在本研究中，共計(jì)17.3%(13/75)未通過(guò)聽(tīng)力測(cè)試，1例為足月兒，12例為早產(chǎn)兒，尿HCMV-DNA平均數(shù)值為平均數(shù)值(1.79×105)copies/ml[(5.1×102～2.5×107)copies/ml]，數(shù)值高低與聽(tīng)力測(cè)試異常沒(méi)有顯著性差異。Yamaguchi[10]在60例HCMV感染的新生兒中，發(fā)現(xiàn)尿HCMV- DNA最高者的拷貝數(shù)是最低者的(4.6×105)倍，HCMV感染和感音神經(jīng)性耳聾(sensorineural hearing loss，SNHL)的新生兒尿HCMV-DNA copies/ml明顯高于HCMV感染但沒(méi)有SNHL的新生兒，由于HCMV感染而導(dǎo)致的SNHL表現(xiàn)為一種晚期聽(tīng)覺(jué)功能障礙，建議對(duì)于HCMV感染特別是拷貝數(shù)高的嬰兒，需要仔細(xì)監(jiān)測(cè)晚發(fā)性SNHL的發(fā)展并進(jìn)行聽(tīng)力隨訪[10，20]。本研究將HCMV-DNA拷貝數(shù)與臨床癥狀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)24例貧血新生兒HCMV-DNA[≥(1.0×103)copies/ml]明顯高于18例非貧血新生兒[<(1.0×103)copies/ml]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與HCMV損害血液系統(tǒng)有關(guān)，但與神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、眼部系統(tǒng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有學(xué)者報(bào)道高HCMV- DNA血癥可預(yù)測(cè)無(wú)癥狀HCMV感染新生兒感染后遺癥[21]，尿HCMV- DNA拷貝數(shù)高也可預(yù)測(cè)晚期神經(jīng)系統(tǒng)損害[10]，建議尿HCMV-DNA拷貝數(shù)高的新生兒應(yīng)進(jìn)行MRI隨訪以便及時(shí)監(jiān)測(cè)到神經(jīng)系統(tǒng)異常。

HCMV感染新生兒的預(yù)后與其臨床癥狀及多系統(tǒng)損害情況相關(guān)。在本研究中，1例足月新生兒死亡，17例自動(dòng)出院，均存在3及3個(gè)系統(tǒng)以上的損害，76%(57/75)新生兒痊愈出院。有研究報(bào)道HCMV感染新生兒期有神經(jīng)系統(tǒng)損害的嬰兒的預(yù)后比肝大、脾大或紫癜的預(yù)后差，分別有73%和30%的嬰兒有嚴(yán)重的永久性后遺癥[22]。雖然先天性HCMV感染的新生兒表現(xiàn)在類型和頻率上與有癥狀的嬰兒相似，但總體預(yù)后較好。

綜上所述，新生兒先天性HCMV感染時(shí)的主要臨床表現(xiàn)為黃疸、肺炎、貧血、肺炎及顱內(nèi)出血，通過(guò)檢測(cè)尿HCMV-DNA可為早期使用抗病毒藥物干預(yù)提供診療依據(jù)，HCMV感染新生兒的預(yù)后與及多系統(tǒng)損害有關(guān)。