人精子線粒體基因突變與弱精癥的相關(guān)性研究

黃文波 范舒舒 馬占忠 汪成 李文麗 張思

(1. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 韶關(guān) 512026；2. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科、產(chǎn)前診斷中心，廣東 韶關(guān) 512026)

不孕不育嚴(yán)重影響人類的生殖健康和家庭、社會(huì)的穩(wěn)定，成為全球關(guān)注的問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約20%的育齡夫婦患有生育障礙，其中男方因素占50%，而弱精癥是影響男性生育力的常見(jiàn)病因[1]。精子活力是衡量精液質(zhì)量和男性生育力的重要指標(biāo)。根據(jù)WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，將精子活力分為3個(gè)等級(jí)：PR為前向運(yùn)動(dòng)精子，NP為非前向運(yùn)動(dòng)精子，IM為靜止精子。若PR+NP<40%或PR<32%診斷為弱精癥[2]。從分子水平分析，精子活力與線粒體有關(guān)，因?yàn)榫€粒體作為細(xì)胞的“能量工廠”，通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，為精子的生成、分化和運(yùn)動(dòng)提供能量，一旦精子線粒體基因突變就有可能使精子活力下降，導(dǎo)致男性不育[3]。本研究采用高通量基因測(cè)序技術(shù)對(duì)弱精癥患者的精子進(jìn)行線粒體基因組測(cè)序，探討線粒體基因突變與弱精癥的相關(guān)性，為弱精癥的基因診斷和選擇輔助生殖方式提供新的途徑和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年3月至2020年10月在粵北人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的46例弱精癥患者和精液常規(guī)正常的健康男性40例。弱精癥患者排除性腺功能低下、睪丸炎史、輸精管梗阻、精索靜脈曲張后，根據(jù)WHO關(guān)于弱精癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng) CASA 軟件分析，PR+NP<40%或PR<32%的弱精癥患者為研究組，平均年齡(33.07±6.14)歲；精液參數(shù)正常的40名健康男性為對(duì)照組，平均年齡(32.33±6.00)歲。兩組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本試驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)討論通過(guò)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器 CFT-9201 CASA精子分析系統(tǒng)(江蘇瑞祺生命科學(xué)儀器有限公司)、德國(guó)IMPLEN N50 Touch超微量分光光度儀、GeneTouch TC-EA基因擴(kuò)增儀、BIORAD CFX96熒光定量PCR儀、Nextseq 500測(cè)序儀(Illumina)、DYY-8C電泳儀(北京六一儀器廠)和Q800R 超聲破碎儀(Qsonica)等。

1.2.2 樣本采集 受檢者禁欲 3～7d，通過(guò)手淫法采集精液樣本不少于 1.5ml，用無(wú)菌杯收集，送檢過(guò)程保持容器溫度 20℃～37℃。樣本 37℃水浴60min內(nèi)液化后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 提取精子線粒體DNA 將液化后的精液緩慢加入45%和 90%的SpermGrad(vitilife公司)梯度分離液中，300g離心20min；棄上清，精子沉淀用3ml SpermRinse洗滌，300g離心5min，棄上清液；將精子沉淀物用德國(guó)QIAamp DNA Mini Kit試劑提取精子線粒體DNA；用德國(guó)IMPLEN N50 Touch超微量分光光度儀測(cè)定DNA濃度。

1.2.4 構(gòu)建文庫(kù)、高通量基因測(cè)序 將提取的線粒體DNA經(jīng)過(guò)長(zhǎng)片段擴(kuò)增后得到16.6kb PCR產(chǎn)物；用Q800R超聲破碎儀進(jìn)行打斷，電泳質(zhì)檢峰值在350bp左右；然后進(jìn)行末端修復(fù)，3’端加A，兩端加上特定序列的接頭，不同樣本連接不同序列的barcode；經(jīng)PCR擴(kuò)增構(gòu)建文庫(kù)，Qubit 3.0測(cè)定文庫(kù)的濃度，瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定文庫(kù)的大小，熒光定量PCR測(cè)定文庫(kù)的質(zhì)量。質(zhì)檢通過(guò)后文庫(kù)稀釋至上機(jī)測(cè)序濃度，使用Illumina Nextseq 500測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序平均覆蓋深度5000×以上。

1.2.5 測(cè)序結(jié)果分析 測(cè)序結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。高通量測(cè)序原始數(shù)據(jù)注釋范圍為：線粒體基因組每個(gè)變異以及變異的突變比例。變異類型包括錯(cuò)義、無(wú)義、同義、移碼、倒位、單重缺失、多重缺失等。檢索HmtDB、mitomap等人群數(shù)據(jù)庫(kù)，標(biāo)注單核苷酸多態(tài)性和低頻良性變異。應(yīng)用HmtVar等軟件對(duì)變異的保守性/致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)。檢索mitomap、pubmed等數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索變異相關(guān)文獻(xiàn)，分析文獻(xiàn)內(nèi)容。參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)分類指南以及《Interpretation of mitochondrial tRNA variants》文獻(xiàn)，對(duì)變異進(jìn)行分類。

2 結(jié)果

研究組共檢出5例線粒體DNA突變，包括TP基因(m.15995G>A)突變2例，ND4基因(m.11981C>T)、CYB基因(m.15002G>A)和TF基因(m.586G>A)突變各1例。對(duì)照組檢出TF基因(m.586G>A)突變1例。兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 研究組和對(duì)照組中線粒體DNA變異位點(diǎn)比較

3 討論

人類線粒體DNA 突變已被證實(shí)與多種疾病密切相關(guān)。線粒體的遺傳物質(zhì)改變將直接影響線粒體參與氧化磷酸化的功能。近些年，有學(xué)者對(duì)男性弱精癥與線粒體DNA變異的相關(guān)性進(jìn)行研究，Holyoake等[4]發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重少弱精患者中存在線粒體ATPase6基因T8821A位點(diǎn)變異。弱精癥的病因復(fù)雜，包括染色體異常、線粒體基因突變、微生物感染和內(nèi)分泌紊亂等因素[5]。精子的運(yùn)動(dòng)主要依靠尾部鞭毛的擺動(dòng)，位于尾部中段的線粒體產(chǎn)生ATP為精子運(yùn)動(dòng)提供能量[6]。人類線粒體DNA具有排列緊密、復(fù)制速度快、缺少組蛋白保護(hù)及有效修復(fù)機(jī)制的特點(diǎn)，因此，線粒體基因變異率約為核基因變異率的20倍[7]。受精過(guò)程中精子只有獲得足夠的能量才能到達(dá)輸卵管受精，線粒體DNA上基因突變會(huì)使ATP生成減少，男性精子活力減弱，從而導(dǎo)致受精失敗。

本研究中發(fā)現(xiàn)ND4基因(m.11981C>T)和CYB基因(m.15002G>A)兩個(gè)變異類型在HmtDB、mitomap、pubmed和中國(guó)知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫(kù)均未見(jiàn)報(bào)道。其中線粒體基因組ND4基因11981位點(diǎn)C>T突變，密碼子由亮氨酸變?yōu)楸奖彼幔籆YB基因15002位點(diǎn)G>A突變，密碼子由甘氨酸變?yōu)榻z氨酸。對(duì)氨基酸的變化進(jìn)行了進(jìn)化保守性和計(jì)算機(jī)輔助的預(yù)測(cè)，但不能基于這些算法來(lái)決定或預(yù)測(cè)臨床的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)的兩處罕見(jiàn)變異均導(dǎo)致了氨基酸的改變，有可能使翻譯出蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及其功能發(fā)生損害，使精子的受精能力受損，雖然線粒體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mitomap.org)里已收錄了線粒體基因多態(tài)性和突變位點(diǎn)與疾病相關(guān)性的報(bào)道，但與弱精癥的報(bào)道較少，因此，我們現(xiàn)在仍無(wú)足夠數(shù)據(jù)確定這些變異與臨床表現(xiàn)是否相關(guān)。

此外，線粒體TF基因586位點(diǎn)G>A突變，突變負(fù)荷為3.3%。TP基因15995位點(diǎn)G>A突變，突變負(fù)荷為2.9%。以上兩個(gè)變異均為同義突變。線粒體基因變異只有少數(shù)會(huì)引起編碼氨基酸的改變，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，更為常見(jiàn)的是同義突變[8]。雖然同義突變不改變氨基酸的序列，但并不表示同義突變是完全“沉默”的，它有可能會(huì)影響mRNA 的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性，進(jìn)一步影響到蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程[9]。同義突變可能會(huì)通過(guò)改變基因的密碼子使用偏性、翻譯效率、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性等，調(diào)節(jié)翻譯效率，改變質(zhì)子通道的數(shù)量，從而影響精子發(fā)生、精子形成及精子的受精能力。而且，轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白相結(jié)合時(shí)，基因突變可能會(huì)引起相關(guān)蛋白的結(jié)合能力或效率降低[10]。

目前，我們對(duì)堿基改變的解讀認(rèn)識(shí)有限，隨著深入研究，我們會(huì)獲得更多關(guān)于這些基因的信息，解讀更精準(zhǔn)。另外，高通量測(cè)序覆蓋深度在5000×左右，檢測(cè)突變負(fù)荷的敏感度大于 2%，還有低突變負(fù)荷和大片段的缺失重復(fù)可能存在漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。加上本研究收集的病例數(shù)較少，尚不能明確線粒體DNA突變和弱精癥的相關(guān)性，仍需要更多樣本進(jìn)行進(jìn)一步的研究。