結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的對(duì)比分析

王彧超

【摘要】目的：對(duì)比與分析結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的效果。方法：研究對(duì)象為2018年8月至2020年12月在南通瑞慈醫(yī)院住院診治的肺結(jié)核患者84例，以及同期確診患其他肺部疾病住院病例且無活動(dòng)性結(jié)核病變征象的患者84例。取所有患者的痰液標(biāo)本，都給予三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）發(fā)光法、涂片、PCR 檢測(cè)，記錄檢測(cè)時(shí)間與判斷檢測(cè)效果。結(jié)果：在168例患者中，痰涂片檢測(cè)與 ATP 發(fā)光法檢測(cè)的時(shí)間少于 PCR 檢測(cè)（P <0.05），痰涂片檢測(cè)時(shí)間少于 ATP 發(fā)光法檢測(cè)（P <0.05）。以痰培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，痰涂片檢測(cè)、ATP 發(fā)光法檢測(cè)、PCR 檢測(cè)的敏感性分別為79.76%（67/84）、91.67%（77/84）、98.81%（83/84），特異性分別為88.10%（74/84）、89.29%（75/84）和100.00%（84/84），對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。結(jié)論：相對(duì)于痰涂片檢查、ATP 發(fā)光法檢測(cè)， PCR 技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中耗費(fèi)時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)，但是檢測(cè)的敏感性與特異性更高，有很好的應(yīng)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】肺結(jié)核;結(jié)核分枝桿菌;實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù); PCR 技術(shù);三磷酸腺苷發(fā)光法;痰涂片法

【中圖分類號(hào)】R521 R446.5【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-5249（2021）22-0181-02

當(dāng)前結(jié)核病依然為一種嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題疾病，如果結(jié)核患者能夠得到早期的診斷及接受正確的治療，就可以有效改善患者預(yù)后，也可有效預(yù)防和控制結(jié)核病造成的傷害[1]。結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起結(jié)核病的重要病原體，其可導(dǎo)致全身各個(gè)器官的慢性病理性改變，包括肺內(nèi)器官與肺外器官等[2]。痰培養(yǎng)法為結(jié)核分枝桿菌的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，也可在改良羅氏固體培養(yǎng)及在其基礎(chǔ)上進(jìn)行菌種鑒定與藥敏時(shí)間。但是其耗費(fèi)時(shí)間比較長(zhǎng)，也很難區(qū)分活菌與死菌，有時(shí)候可延誤患者獲取正確治療的最佳時(shí)機(jī)而錯(cuò)失改善預(yù)后的機(jī)會(huì)。痰涂片鏡檢對(duì)于技術(shù)人員的要求比較高，有一定的主觀性，診斷的特異性有待提高。抗原檢測(cè)具有操作方便、檢測(cè)快速等特點(diǎn)，其中三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）發(fā)光法是依據(jù)活細(xì)菌體內(nèi)均含有一定量的ATP，利用 ATP與熒光素酶的反應(yīng)，通過熒光強(qiáng)度來間接反映判斷ATP 的含量，從而可以判斷細(xì)菌活力[3-4]。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，當(dāng)前PCR技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，特別是 qPCR 技術(shù)的熒光信號(hào)可由熒光檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)捕獲，直觀反映擴(kuò)增循環(huán)情況[5]。本文對(duì)比了上述三種實(shí)驗(yàn)室方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的效果，希望為臨床上合理選擇檢測(cè)技術(shù)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

研究對(duì)象為2018年8月到2020年12月在南通瑞慈醫(yī)院住院診治的肺結(jié)核患者84例，以及同期確診患其他肺部疾病住院病例且無活動(dòng)性結(jié)核病變征象的患者84例。168例患者中，男性86例，女性82例，年齡（49.27±2.58）歲，體重指數(shù)（24.77±1.86）kg/m2，心率（85.20±3.75）次/分，空腹血糖（5.14±0.46）mmol/L。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～80歲;肺結(jié)核患者都明確診斷為活動(dòng)性肺結(jié)核（痰液改良羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性）;其他肺部疾病患者X線胸片檢查無活動(dòng)性結(jié)核病變（痰液改良羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)陰性）;臨床資料完整;患者簽署了知情同意書;采樣檢測(cè)前所有患者都給未予任何治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠與哺乳期婦女;合并非肺部惡性腫瘤者;臨床資料缺乏者;合并其他呼吸道傳染性疾病者;具有新型冠狀病毒肺炎密切接觸史的患者。

1.2檢測(cè)方法

（1）痰涂片檢測(cè)。取所有患者深喉痰液，取標(biāo)本中的干酪樣、膿樣與可逆部分，于干凈脫脂玻片涂抹成卵圓形痰膜，然后進(jìn)行痰涂片鏡檢，取×300視野，出現(xiàn)≥2條桿菌數(shù)量判斷為結(jié)核分枝桿菌陽性。

（2）ATP發(fā)光法檢測(cè)。取患者的痰液樣本，在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行漩渦振蕩混勻，混合ATP蟲熒光素酶凍干粉與裂解液，制成ATP酶液。吸入20μL樣本中于ATP小試管中，加入100μLATP酶液進(jìn)行發(fā)光值測(cè)量，熒光讀數(shù)比初始讀數(shù)≥2倍判定為陽性，嚴(yán)格按照操作羅氏公司的操作說明書進(jìn)行操作。

（3）PCR檢測(cè)。取患者的痰液標(biāo)本后，充分勻化使痰液，2000 rpm離心5 min，取下層沉淀提取基因組，采用 qPCR 檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌保守序列16sRNA 的表達(dá)情況，檢測(cè)體系為25μL，其中樣本基因組量為5μL。正向引物為5‘-CCCTAGACCGGAACTCGGGAATTTT-3’，反向引物為5 ‘-AAGCCTGGACCACAAGACATTAGGGCC-3’， Ct 值≥35判斷為陽性， Ct值<40為陰性，檢測(cè)結(jié)果處于兩者之間的痰標(biāo)本需重新檢測(cè)，重檢后若Ct值<40判定為陽性。

1.3觀察指標(biāo)

（1）觀察與記錄所有患者的檢測(cè)時(shí)間。（2）以痰培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，觀察與記錄所有患者的檢測(cè)敏感性與特異性，計(jì)算方式為敏感性=真陽例數(shù)/（真陽例數(shù)+假陰例數(shù)）×100%，特異性=真陰例數(shù)/（真陰例數(shù)+假陽例數(shù)）×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 19.0，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用 t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2結(jié)果

2.1檢測(cè)時(shí)間對(duì)比

在168例患者中，痰涂片檢測(cè)與ATP 發(fā)光法檢測(cè)的時(shí)間少于 PCR 檢測(cè)（P<0.05），痰涂片檢測(cè)時(shí)間少于ATP 發(fā)光法檢測(cè)（P<0.05），見表1。

2.2檢測(cè)效果對(duì)比

以痰培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，痰涂片檢測(cè)、 ATP 發(fā)光法檢測(cè)、 PCR檢測(cè)的敏感性分別為79.76%（67/84）、91.67%（77/84）、98.81%（83/84），特異性分別為88.10%（74/84）、89.29%（75/84）和100.00%（84/84），對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

3討論

結(jié)核分枝桿菌為聚集成分枝狀排列繁殖，無菌毛、鞭毛和莢膜，菌體細(xì)長(zhǎng)略彎曲，抗酸染色陽性，不形成芽孢。結(jié)核分枝桿菌為導(dǎo)致肺結(jié)核的主要病原體，也可侵犯全身各器官[6]。同時(shí)是由于各種因素的影響，當(dāng)前耐藥肺結(jié)核患者越來越多，一些患者經(jīng)過長(zhǎng)期正規(guī)治療后結(jié)核病灶沒有吸收甚至病灶播散、痰菌量沒有減少，為此加強(qiáng)早期診斷具有重要價(jià)值[7]。痰培養(yǎng)不僅是臨床確診肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，也是判斷結(jié)核分枝桿菌陽性的重要標(biāo)準(zhǔn)。但是結(jié)核分枝桿菌的增殖比較緩慢，在臨床檢測(cè)中常無法及時(shí)提供檢測(cè)報(bào)告。痰涂片檢查具有操作簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，但是其檢出陽性率低，不能鑒定細(xì)菌的活力，容易造成誤診與漏診。ATP發(fā)光法是采用免疫層析原理進(jìn)行測(cè)定，可為活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷提供直接的證據(jù)，也具有操作方便、快速有效等優(yōu)勢(shì)。有研究顯示，熒光檢測(cè)的強(qiáng)度與被測(cè)樣品中結(jié)核分枝桿菌增殖產(chǎn)生的ATP 含量成正比，為此可判斷結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)情況[8]。本研究顯示，在168例患者中，痰涂片檢測(cè)與ATP 發(fā)光法檢測(cè)的時(shí)間少于 PCR 檢測(cè)（P<0.05），痰涂片檢測(cè)時(shí)間少于ATP 發(fā)光法檢測(cè)（P<0.05），但是都少于1d。從機(jī)制上分析， qPCR 方法采用的熒光探針序列是針對(duì)結(jié)核分枝桿菌菌群特異性核酸序列而設(shè)計(jì)，采用了熒光標(biāo)記的探針實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過程中的熒光信號(hào)，能夠有效的控制污染問題及有效減少假陰性結(jié)果。

肺結(jié)核的臨床診斷是建立在臨床癥狀、影像學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、病理檢測(cè)等多方面綜合診斷的基礎(chǔ)之上，痰培養(yǎng)檢測(cè)為金標(biāo)準(zhǔn)，但是檢測(cè)的時(shí)間比較長(zhǎng)。ATP發(fā)光法是當(dāng)前比較常見微生物檢測(cè)技術(shù)之一，也能判斷結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況，有利于臨床用藥的及時(shí)調(diào)整。不過自然界中所有微生物體內(nèi)均含有一定量的ATP，ATP與熒光素酶混合后能產(chǎn)生熒光，會(huì)產(chǎn)生一定的漏診情況。本研究采用的PCR檢測(cè)融入了熒光標(biāo)記的檢測(cè)探針，實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)增過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可使RNA擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)與擴(kuò)增過程同步化，簡(jiǎn)化了操作過程，有利于提高診斷的效果與質(zhì)量[9-11]。本研究顯示，以痰培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，痰涂片檢測(cè)、 ATP 發(fā)光法檢測(cè)、PCR檢測(cè)的敏感性分別為79.76%、91.67%、98.81%，特異性分別為88.10%、89.29%和100.00%，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明 PCR檢測(cè)具有更高的檢測(cè)敏感性與特異性。本研究也存在一定的不足，沒有納入正常健康人群，涉及對(duì)比的檢測(cè)方法也比較少，將在后續(xù)研究中進(jìn)行探討。

綜上所述，相對(duì)于痰涂片檢查、 ATP發(fā)光法檢測(cè)， PCR 技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中耗費(fèi)時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)，但是檢測(cè)的敏感性與特異性更高，有很好的應(yīng)用價(jià)值。

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（收稿日期：2021-03-27）