二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化富含γ-氨基丁酸豆醬制曲工藝

李冬龍，李拂曉，葛艷靜，謝彩鋒，劉繼棟，杭方學(xué)*

1(廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西壯族自治區(qū) 南寧，530004)2(蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西大學(xué)， 廣西壯族自治區(qū) 南寧，530004)

豆醬是一類以豆類為主要原料，利用微生物發(fā)酵制得的調(diào)味品，具有適口的咸、鮮等滋味，廣泛流傳于中國、日本、韓國等東亞國家和地區(qū)[1]。豆醬生產(chǎn)可分為制曲及制醬兩部分，其中制曲階段主要通過微生物代謝活動產(chǎn)生蛋白酶[2]、淀粉酶[3]等以降解基質(zhì)，制醬階段通過長時間發(fā)酵形成豆醬的特有風(fēng)味[4]。當(dāng)前，豆醬生產(chǎn)多以自然發(fā)酵為主，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)所需的高效、快捷及品質(zhì)穩(wěn)定等要求。針對此問題，學(xué)者在豆醬發(fā)酵工藝控制[5]、發(fā)酵菌種選育[6]進(jìn)行了諸多研究。然而，對功能性豆醬制品的研發(fā)尚處于初級階段。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種中樞神經(jīng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓[7]、抗抑郁[8]、緩解體力疲勞[9]、防老年癡呆[10]、改善睡眠[11]等諸多作用，其食品安全性已得到廣泛驗證。在生物體內(nèi)，GABA主要由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶脫羧所得[12]，其產(chǎn)量受限于基質(zhì)中的游離氨基酸含量。而豆醬制曲通過醬曲中的米曲霉等微生物活動分泌蛋白酶降解醬曲中的蛋白質(zhì)，為微生物活動及產(chǎn)品提供氨基酸態(tài)氮，蛋白酶活性的高低很大程度決定了產(chǎn)品的品質(zhì)。在常規(guī)工藝條件下，豆醬中可檢測到痕量的GABA[13]，制曲工藝的差異也會導(dǎo)致GABA含量波動性變化。研究還表明，基質(zhì)中的碳源種類對豆醬風(fēng)味形成[5]和GABA積累[14]有一定影響，如HAJAR-AZHARI等[15]和WAN-MOHTAR等[16]發(fā)現(xiàn)添加外源天然糖對米曲霉富集GABA有促進(jìn)作用。因此，本實驗擬通過制曲工藝及基質(zhì)成分優(yōu)化實現(xiàn)GABA在豆醬制品中的參數(shù)可控調(diào)節(jié)。基于此，本研究擬通過豆醬制曲工藝及培養(yǎng)基質(zhì)中碳源優(yōu)化，考察對蛋白酶酶活、GABA含量及谷氨酸含量的影響。在此基礎(chǔ)上，使用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計分析各因素及其交互作用獲得最優(yōu)的制曲條件，實現(xiàn)高蛋白酶活力醬曲中GABA的過量積累。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆、糙米、香滿園特一級小麥粉,廣西南寧市冠超市；米曲霉孢子粉(Aspergillusoryzae3.042),上海佳民釀造食品有限公司。

L-酪氨酸、酪蛋白、Na2CO3、濃HCl、NaOH、三氯乙酸、蔗糖、NaH2PO4、Na2HPO4(均為分析純)；乙酸鈉、硼酸(優(yōu)級純)；福林酚試劑,北京索萊寶科技有限公司；谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品、鄰苯二甲醛、β-巰基乙醇(純度均>99%),上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、甲醇(色譜純),廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-82A水浴恒溫振蕩器，金壇市醫(yī)療儀器廠；UV-1000紫外分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；Cenlee 16R高速冷凍離心機，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；WK-800A高速藥物粉碎機，青州市精誠機械有限公司；安捷倫1100高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；BMJ-160C霉菌培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；STARTER-3100酸度計、PWN124ZH電子天平，奧豪斯儀器有限公司；KQ-數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 豆醬制曲工藝

將黃豆清凈，去除較差外觀黃豆，浸泡處理12 h去除豆腥味[17]。將浸泡后的黃豆蒸煮30 min，冷卻至40 ℃后與一定比例小麥粉混合，接種0.1%米曲霉孢子粉于霉菌培養(yǎng)箱制曲，濕度設(shè)置為95%，溫度控制為28～30 ℃，挑選最優(yōu)小麥粉與黃豆配比發(fā)酵基質(zhì)。優(yōu)化試驗則在最優(yōu)小麥粉配比醬坯的基礎(chǔ)上，依次添加不同比例糙米粉、蔗糖后制曲。

1.3.2 豆醬醬曲水分含量的測定

使用直接干燥法，參考GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》。

1.3.3 蛋白酶酶活測定

稱取醬曲5 g，充分研磨后使用pH 7.2的10 mmol/L H3PO4緩沖溶液稀釋至100 mL靜置30 min，各取1 mL上清液置于40 ℃水浴中預(yù)熱后測定酶活(以干曲重計算酶活)。蛋白酶活力測定依照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23527—2009 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 蛋白酶制劑》。蛋白酶活U定義：在40 ℃條件下，1 min水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸定義為一個U。

1.3.4 醬曲中GABA與谷氨酸提取及測定

稱取GABA、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各0.100 g，使用超純水溶解至100 mL得1.0 mg/mL的GABA、谷氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。使用標(biāo)準(zhǔn)儲備液依次配制0.005、0.010、0.020、0.040、0.080、0.160、0.320 mg/mL的GABA、谷氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。樣品中GABA與谷氨酸提取方法在任佳秀等[18]的研究上改進(jìn)，稱取醬曲0.5 g，加入5 mL三氯乙酸溶液，超聲提取30 min 2次，提取液經(jīng)離心(10 000 r/min、10 min、24 ℃)后，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾至進(jìn)樣瓶，置于4 ℃冰箱待測。

衍生化試劑與衍生條件在王嘉怡等[9]的研究上改進(jìn)，使用鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde，OPA)柱前在線衍生法。OPA衍生劑配制：稱取120.0 mg OPA，依次加入2 mL甲醇(色譜純)、300 μL β-巰基乙醇及4 mL硼酸溶液(0.4 mol/L，pH 9.5)后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾于樣品瓶中待用。使用安捷倫自動進(jìn)樣器實現(xiàn)在線衍生，程序進(jìn)樣在現(xiàn)有研究[19]上改進(jìn)：吸取樣品5 μL；不吸取清洗瓶超純水；吸取OPA衍生劑5 μL；吸取清洗瓶超純水；在空氣中最大速度混合10 μL，不混合10次；等待2 min；進(jìn)樣。

色譜條件：色譜柱Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A為25 mmol/L乙酸鈉溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序：0～5 min，流動相為90%A和10%B；5～20 min，B相由10%上升至35%；20～28 min，流動相保持65%A和35%B；在28～30 min，B相由35%降低至10%。檢測條件：安捷倫VWD檢測器，檢測波長338 nm；柱溫40 ℃；總進(jìn)樣量10 μL。

1.3.5 單因素試驗

按照1.3.1進(jìn)行制曲。糙米添加量對醬曲品質(zhì)的影響試驗為：蔗糖添加量固定為6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，制曲時間固定為60 h，糙米添加量設(shè)定為黃豆質(zhì)量的0%、8%、16%、24%和32%；蔗糖添加量對醬曲品質(zhì)的影響試驗：糙米添加量固定為16%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，制曲時間固定為60 h，蔗糖添加量設(shè)定為總質(zhì)量的0%、3%、6%、9%及12%；制曲時間對醬曲品質(zhì)的影響試驗：糙米添加量固定為16%，蔗糖添加量固定為6%，制曲時間設(shè)定為36、48、60、72、84 h。以蛋白酶酶活、GABA含量及谷氨酸含量為指標(biāo)，判定最佳單因素條件。

1.3.6 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗

根據(jù)單因素實驗研究結(jié)果確定糙米粉添加量、蔗糖添加量及制曲時間3個因素的水平編碼范圍，以蛋白酶酶活、GABA含量和谷氨酸含量為響應(yīng)值，試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Coded levels for independent variables

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均為3次平行，使用SPSS 26.0和Origin 9.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及顯著性分析，使用Design Expert 10設(shè)計二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗，使用Illustrator 23.0.2軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)發(fā)酵基質(zhì)選擇

醬坯提供了微生物增殖及產(chǎn)酶所需的營養(yǎng)成分，通常情況下，醬坯由黃豆與淀粉按一定比例復(fù)配而成。已有的報道證明，淀粉來源及其與黃豆的復(fù)配比例對制曲效果有較大的影響[3]。本研究選擇小麥粉為基礎(chǔ)碳源，結(jié)果表明，隨小麥粉添加量的增加，醬曲蛋白酶活性呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，且制曲時間表現(xiàn)出一定程度延長。如m(黃豆)∶m(小麥粉)=10∶2時，制曲48 h時達(dá)到最大酶活522.86 U/g，當(dāng)m(黃豆)∶m(小麥粉)=10∶6 時，制曲60 h時達(dá)到最大酶活僅為213.91 U/g (P=0.000 01<0.01)(圖1-a)。小麥粉持續(xù)補充導(dǎo)致蛋白酶活性下降可能是由于基質(zhì)中碳氮源比例失衡，影響微生物的繁殖代謝過程。同時，小麥粉的顆粒細(xì)小，較大比例加入可能使醬曲表面過于緊實而不易透氣，影響米曲霉的生長，從而導(dǎo)致蛋白酶分泌不足[20]。本研究同時跟蹤檢測了制曲過程中基質(zhì)的含水量變化，不同復(fù)配比例下，基質(zhì)含水量的變化差異較小。隨制曲時間的增加，基質(zhì)含水量因菌體利用和生物熱蒸發(fā)等原因而迅速下降，制曲至60～72 h時，醬曲水分含量均降低至25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))以下，此現(xiàn)象與劉穎等[21]制備高活性醬曲水分含量變化相似。此外，制曲后期蛋白酶活性呈現(xiàn)下降趨勢，可能為水分含量下降影響了菌體的生命活動所致。由于米曲霉產(chǎn)酶最適水分含量在40%～50%[22]，故綜合考慮后本研究選擇m(黃豆)∶m(小麥粉)=10∶2的坯制備基礎(chǔ)醬坯。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 糙米對醬曲中蛋白酶酶活、GABA含量及谷氨酸含量的影響

通常情況下，小麥粉是醬曲中的主要碳源，而碳氮源種類是影響米曲霉生長及富集GABA的重要因素。在本研究中，把富集GABA常用的糙米作為額外碳源，為制曲過程實現(xiàn)高GABA積累提供便利。研究結(jié)果表明，未添加糙米組醬曲酶活最高722.82 U/g，其余組酶活隨糙米添加量增加不斷降低，當(dāng)添加32%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))糙米時，制曲結(jié)束時醬曲酶活最低僅為386.45 U/g(P=0.000 1<0.01) (圖2-a)。糙米加入導(dǎo)致蛋白酶活性下降可能為糙米以粉末狀加入基質(zhì)，使醬曲表面不易透氣，抑制微生物生長導(dǎo)致酶活降低。同時對GABA含量的觀測發(fā)現(xiàn)，雖然未添加糙米組醬曲酶活較高，但GABA含量相對較低,為0.105 mg/g，當(dāng)添加8%、16%糙米時GABA含量差異較小，達(dá)到最大值0.146 mg/g (P<0.01)。本研究還發(fā)現(xiàn)，糙米添加量的改變對谷氨酸含量影響較小。故綜合考慮后選擇添加8%糙米為優(yōu)化試驗中心點。

a-蛋白酶酶活變化;b-水分含量變化圖1 不同黃豆與小麥粉比例醬坯制曲中蛋白酶酶活及水分變化Fig.1 Protease activity and water content changes in different proportion of soybean and wheat flour

a-蛋白酶酶活變化;b-GABA、谷氨酸含量變化圖2 糙米添加量對醬曲品質(zhì)的影響Fig.2 The effect of the amount of brown rice on the quality of soybean koji

2.2.2 蔗糖對醬曲中蛋白酶酶活、GABA及谷氨酸含量的影響

傳統(tǒng)制曲通常采用淀粉為碳源，米曲霉等制曲微生物需合成淀粉酶以降解淀粉為可利用糖，一定程度上增加了菌體負(fù)荷。在醬坯中添加適量蔗糖可為微生物生長提供速效碳源，方便微生物的快速增殖。研究結(jié)果顯示，醬曲酶活隨蔗糖添加量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在添加6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖時達(dá)到最大536.18 U/g (P<0.01) (圖3-a)。對GABA含量的檢測發(fā)現(xiàn)，在添加0～12%蔗糖，GABA含量隨蔗糖增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在添加6%蔗糖時GABA含量達(dá)到最大0.151 mg/g且酶活力最高(P<0.01) (圖3-b)。添加少量蔗糖促進(jìn)米曲霉生長使酶活上升，可能是增加了易代謝碳源，促進(jìn)了微生物生長，而添加高比例蔗糖后導(dǎo)致滲透壓上升，不利于微生物生長導(dǎo)致酶活降低。添加3%蔗糖時，出現(xiàn)酶活較低但GABA含量較高的原因可能為易代謝碳源的加入導(dǎo)致微生物過量增殖，菌體的氮代謝通路較旺盛但胞外酶分泌量減少。谷氨酸含量在添加3%蔗糖時達(dá)到最大，隨后隨蔗糖添加量的增加而不斷降低(P<0.01)。故綜合考慮后選擇添加6%蔗糖為優(yōu)化試驗中心點。

a-蛋白酶酶活變化;b-GABA、谷氨酸含量變化圖3 蔗糖添加量對醬曲品質(zhì)的影響Fig.3 The effect of the amount of sucrose on the quality of soybean koji

2.2.3 制曲時間對醬曲中蛋白酶酶活、GABA含量及谷氨酸含量的影響

制曲時間長短決定醬曲的品質(zhì)，通常醬曲的最大酶活出現(xiàn)在制曲48 h后[23]，同時，在最大酶活點后，因菌體數(shù)量增多且醬坯中營養(yǎng)物質(zhì)出現(xiàn)短缺，不利于微生物生長而導(dǎo)致酶活呈現(xiàn)下降趨勢。在本研究中，酶活隨著制曲時間延長呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在60 h達(dá)到最大酶活605.79 U/g，在36 h時最小僅為433.84 U/g (P=0.003 22<0.01) (圖4-a)。而制曲過程中醬曲的水分含量變化也與現(xiàn)有研究相似，呈現(xiàn)不斷下降趨勢[21]。此外，隨著制曲時間延長，GABA含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在制曲60 h時達(dá)到最大值0.165 mg/g (P<0.01)。GABA含量呈現(xiàn)與酶活相似的變化趨勢，可能是蛋白酶降解的部分游離氨基酸參與了GABA的代謝通路[24]。此時醬曲中的GABA含量與XU等[13]豆醬成品中0.260～3.010 mg/g相比仍較低。但與CAI等[14]發(fā)現(xiàn)利用米曲霉的制曲過程可提升發(fā)酵基質(zhì)的GABA含量相吻合。此外，制曲時間對谷氨酸含量影響相對較小，由36 h的0.130 mg/g上升至48 h的0.138 mg/g后降低至0.125 mg/g。在綜合考慮GABA含量及酶活后，選擇制曲時間60 h為優(yōu)化試驗中心點。

a-蛋白酶酶活變化;b-GABA、谷氨酸含量變化圖4 制曲時間對醬曲品質(zhì)的影響Fig.4 The effect of the amount of making koji time on the quality of soybean koji

2.3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗結(jié)果

2.3.1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗結(jié)果

根據(jù)圖2～圖4的單因素試驗結(jié)果，選取糙米添加量(A)、蔗糖添加量(B)、制曲時間(C)作為3因素，以蛋白酶酶活(Y1)、GABA含量(Y2)、谷氨酸含量(Y3)為響應(yīng)值，試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗Table 2 Quadratic regression orthogonal rotation combination design with experimental results

2.3.2 以蛋白酶酶活為指標(biāo)的回歸模型方差分析及交互作用影響

對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析得表3，擬合蛋白酶酶活(Y1)的二次回歸方程為：Y1=628.66-21.54A-12.96B+56.20C-12.72AB+2.05AC-13.16BC-32.71A2-67.30B2-46.57C2。表3表明該模型極顯著(P<0.01)，無失擬性因素存在(P=0.134 1>0.05)，方差分析顯示，C、A2、B2、C2對回歸方程影響較大(P<0.01)，A對回歸方程影響顯著(0.01

表3 以蛋白酶酶活為評價指標(biāo)的回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis results of regression model using protease activity as evaluation index

如圖5-a所示，隨著蔗糖添加量與糙米添加量的增加，酶活呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，通過二維等高線圖可知兩因素之間存在一定交互作用。如圖5-b所示，隨著糙米添加量與制曲時間的增加，酶活呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，通過二維等高線圖可知，兩因素之間不存在交互作用。由圖5-c可知，隨著蔗糖添加量與制曲時間的增加，酶活呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，通過二維等高線圖可知兩因素之間存在一定交互作用。綜合圖5和表3，3因素對酶活的影響力為：制曲時間>蔗糖添加量>糙米添加量。

a-蔗糖添加量與糙米添加量;b-糙米添加量與制曲時間; c-蔗糖添加量與制曲時間圖5 糙米添加量、蔗糖添加量及制曲時間交互作用對 豆醬曲蛋白酶酶活的影響Fig.5 Effects of brown rice content, sucrose content and koji-making time on protease activity of soybean koji

2.3.3 以GABA含量為指標(biāo)的回歸模型方差分析及交互作用影響

同理由表4可知，GABA含量(Y2)二次回歸方程為：Y2=-0.143+0.016A+0.016B+0.014C-0.005AB-0.004AC+0.006BC-0.005A2-0.019B2-0.014C2。由表4可知，該回歸模型極顯著(P=0.000 2<0.01)，無失擬性因素存在(P=0.053 3>0.05)，方差分析顯示，A、B、C、B2、C2對回歸方程影響十分顯著(P<0.01)，簡化回歸方程為：Y2=-0.143+0.016A+0.016B+0.014C-0.019B2-0.014C2。其中A、B、C、B2、C2的相關(guān)系數(shù)和與總系數(shù)和比例R=92.60%，其他因素影響系數(shù)占7.40%，簡化方程仍有較好擬合性。

表4 以GABA含量為評價指標(biāo)的回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis results of regression model using GABA content as evaluation index

如圖6-a所示，隨著蔗糖添加量與糙米添加量的增加，GABA含量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，通過二維等高線圖可知兩因素之間存在一定交互作用。如圖6-b所示，隨著糙米添加量與制曲時間的增加，GABA含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，通過二維等高線圖可知兩因素之間存在一定交互作用。如圖6-c所示，隨著蔗糖添加量與制曲時間的增加，GABA含量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，通過二維等高線圖可知兩因素之間存在一定交互作用。綜合圖6和表4，3因素對GABA含量的影響力為蔗糖添加量>糙米添加量>制曲時間。

a-蔗糖添加量與糙米添加量；b-糙米添加量與制曲時間； c-蔗糖添加量與制曲時間圖6 糙米添加量、蔗糖添加量及制曲時間交互作用 對豆醬曲GABA含量的影響Fig.6 Effects of brown rice content, sucrose content and koji-making time on GABA content of soybean koji

2.3.4 以谷氨酸含量為指標(biāo)的回歸模型性方差分析及交互作用影響

同理由表5可知，谷氨酸含量(Y3)二次回歸方程為：Y3=0.232+0.004A-0.003B-0.007C+0.003AB+0.008AC+0.007BC+0.002A2-0.014B2+0.002C2。由表5可知，該回歸方程模型不顯著(P=0.345 5>0.05)，其中有顯著性影響誤差來源B2的相關(guān)系數(shù)總和與總系數(shù)和的比例R=回歸平方和/總平方和=49.71%，回歸模型的擬合度較差，故不用此模型預(yù)測最佳工藝點。

表5 以谷氨酸含量為評價指標(biāo)的回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis results of regression model using Glutamate content as evaluation index

2.3.5 最佳工藝點驗證性實驗

根據(jù)蛋白酶酶活和GABA含量回歸模型分別可得出最優(yōu)組合：糙米添加量7.4%、蔗糖添加量5.9%及制曲時間66.2 h，預(yù)測酶活達(dá)最大649.86 U/g，預(yù)測GABA含量0.140 mg/g，谷氨酸含量0.226 mg/g；糙米添加量10.6%、蔗糖添加量6.3%及制曲時間63.7 h，GABA含量達(dá)最大0.159 mg/g，預(yù)測酶活542.50 U/g，谷氨酸含量0.242 mg/g。

綜合考慮后選擇糙米粉添加量9.0%、蔗糖添加量6.1%及制曲時間65 h為優(yōu)選條件，預(yù)測蛋白酶酶活622.08 U/g、GABA含量0.152 mg/g和谷氨酸含量0.233 mg/g。驗證性實驗得，蛋白酶酶活(592.13±25.01) U/g、GABA含量(0.148±0.012) mg/g及谷氨酸含量(0.241±0.010) mg/g，與回歸模型預(yù)測值基本一致。優(yōu)化后的豆醬曲與LEE等[6]使用米曲霉和芽孢桿菌混合制曲相比，與最低組蛋白酶酶活(458.5±18.0) U/g相比較高，略低于酶活最高組(627.8±17.9) U/g，證明此法制得的富含GABA醬曲有較高酶活。制曲結(jié)束時，醬曲表面菌絲生長均勻，外觀呈黃綠色且未出現(xiàn)燒曲現(xiàn)象，呈現(xiàn)濃郁曲香并無不良風(fēng)味，為豆醬的制醬工藝提供良好的風(fēng)味基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

通過實驗建立3種影響因素(糙米粉添加量、蔗糖添加量、制曲時間)與3個響應(yīng)值(蛋白酶酶活、GABA含量、谷氨酸含量)相互作用模型，得出添加9.0%糙米粉及6.1%蔗糖，制曲時間65 h時醬曲品質(zhì)最佳，蛋白酶酶活為(592.13±25.01) U/g、GABA含量為(0.148±0.012) mg/g、谷氨酸含量為(0.241±0.010) mg/g，與回歸模型預(yù)測值基本一致。通過本實驗開發(fā)出一種提供高酶活且有較高GABA含量的制曲方法，為后續(xù)開發(fā)富含GABA豆醬提供了一定的理論參考。