重組酶等溫擴增技術在分析檢測中的應用研究進展

孫曉紅，后來旺，李達容，趙勇，黃新新，何宇平，藍蔚青,3*

1(上海海洋大學 食品學院，上海, 201306)2(農業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海, 201306) 3(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心，上海, 210306)4(上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海, 200135)

微生物污染是引起食物中毒和動植物病疫的主因之一，國家標準檢測方法主要通過傳統(tǒng)培養(yǎng)結合生理生化鑒定，其檢測過程一般需要3～6 d，不但耗時耗力，且對技術條件要求較高，無法滿足政府與企業(yè)倡導的快速簡便需求，開發(fā)新型快速檢測技術成為當務之急?？焖贆z測技術相對傳統(tǒng)培養(yǎng)法和依賴儀器檢測而言，其最大特點是簡便快速，不依賴精密儀器的輔助，檢測時間短等。目前常用的快速檢測方法有化學比色法、酶抑制技術、分子生物學檢測技術與生物芯片技術等。其中，分子生物學檢測技術以其靈敏度高、漏檢率低、窗口期檢測時間短等優(yōu)點在常規(guī)快速檢測技術中占明顯優(yōu)勢，其主要通過“核酸提取-擴增-檢測”三步操作對核酸分子的精確鑒定，從而提供各類風險源以及疫病檢出的相關信息，為其預防、監(jiān)控和治療提供有效依據(jù)。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)自20世紀80年代引入以來，已作為分子生物學研究的重要手段，廣泛應用于生命科學和環(huán)境科學等領域中[1-2]。然而，由于PCR技術及其衍生技術均存在對溫控設備的依賴性高、熱循環(huán)過程耗時與操作專業(yè)化等特點，其應用范圍受限；而與之相比，重組酶等溫擴增技術只需溫度調控，無需特殊儀器輔助，易于實現(xiàn)擴增和現(xiàn)場檢測。

重組酶等溫擴增技術是一種新型的體外核酸等溫擴增技術，其擴增原理是各種酶在腺嘌呤核苷三磷酸(adenosione triphosphate，ATP)作用下，重組酶蛋白與寡核苷酸引物結合形成重組絲復合物，單鏈DNA結合蛋白通過鏈置換方式，將模板DNA解鏈，自身與單鏈DNA模板結合，防止在形成新鏈DNA之前母鏈聚集配對；隨后，重組絲復合物掃描模板DNA單鏈，當識別到與之引物相互配對的序列時，負責堿基配對的重組酶蛋白可通過與單鏈DNA結合蛋白結合，阻截細胞核內核酸酶降解單鏈DNA[3]；最后，DNA聚合酶在引物的3′端添加堿基進行DNA復制延伸。重組酶等溫擴增技術反應機制如圖1所示。

圖1 重組酶等溫擴增技術反應機制Fig.1 Reaction mechanism of isothermal recombinase amplification

目前，重組酶等溫擴增技術包括RPA(recombinase polymerase amplification)和RAA(recombinase aided amplification)2種技術[4-5]，其不同之處在于RAA是細菌或真菌中獲得的重組酶來替代RPA技術中較難獲得的噬菌體重組酶，兩者整個擴增過程一致，通過結合、鏈置換、延伸實現(xiàn)體外DNA擴增?，F(xiàn)有研究表明，RPA與RAA技術能在恒定或較寬溫度范圍內，通過30 min左右自動循環(huán)的動態(tài)環(huán)境，可實現(xiàn)微量核酸在體外高效快速擴增，再由端點檢測法對擴增產(chǎn)物進行檢測，即可得到理想檢測結果[6]。近年來，隨著研究人員對分析檢測效率與準確度要求的逐年提升，RPA與RAA技術在分析檢測領域中得到較廣泛的應用。本文在簡述RPA與RAA技術擴增原理的基礎上，重點闡述了重組酶等溫擴增技術在病毒與細菌檢測、動植物檢驗檢疫、食品安全等方面的應用研究進展，提出存在問題與解決辦法，展望了其未來發(fā)展前景，以期為后期RPA與RAA技術應用領域的拓展提供理論參考。

1 重組酶等溫擴增技術在分析檢測中的應用研究進展

RPA技術發(fā)展至今已有10余年，其應用領域比RAA技術廣泛，尤其在現(xiàn)場檢測方面中發(fā)揮著重要的作用。RAA作為一種新型的具有我國自主知識產(chǎn)權的等溫核酸擴增技術，其重組酶來源廣泛，使等溫擴增技術得以豐富，更充實了體外核酸擴增技術的發(fā)展。2項技術在病毒與細菌檢測、動物檢驗檢疫與食品安全等領域中得到廣泛應用。

1.1 病毒檢測

手足口病是嚴重公共衛(wèi)生問題引起的主要傳染病，主要特征表現(xiàn)為口腔黏膜皰疹或潰瘍和手、足部出疹等，其主要由20多種腸道病毒引起，以柯薩奇病毒CA16型和腸道病毒EV71型最常見，也有柯薩奇病毒CA6型和CA10型引起的癥狀[7]。采用RPA與RAA技術可實現(xiàn)該病毒的快速準確檢測。其中，YIN等[8]使用實時Real-time-RPA(RT-RPA)技術檢測EV71，在臨床樣品評估中得出該檢測技術與RT-qPCR差異不大，但檢測精度明顯提高，且時間短；LI等[9]通過RT-RAA技術可在42 ℃條件下，30 min高靈敏檢測到EV71與CA16，臨床診斷特異性高；WANG等[10]建立了RT-RPA技術快速檢測柯薩奇病毒CA-A6的方法；YAN等[11]建立RT-RAA技術檢測柯薩奇病毒CA-A6和CA-A10，檢測結果與RT-qPCR一致，特異性高達100%，在監(jiān)測感染與疫情控制中均具潛在價值。在其他病毒檢測方面，SHEN等[12]通過熱處理粗提基因組DNA，用RT-RAA法30 min內可檢測到乙型肝炎病毒，該病毒與人類免疫缺陷病毒和丙型肝炎病毒無交叉反應；BAI等[13]通過熱處理粗提基因組DNA，建立了RT-RAA法結合內部控制對照及RAA技術與側流層析試紙條(lateral-flow dipstick, LFD)雙重檢測，能有效消除假陽性結果；此外，呼吸道合胞病毒是一種能在全球范圍內引起嬰幼兒下呼吸道感染的病原體，有學者通過RT-RAA技術[14]和RT-RPA技術[15]提高靈敏度快速檢測到呼吸道合胞病毒，表現(xiàn)出很大的檢測應用潛力。

1.2 細菌檢測

由于傳統(tǒng)檢測方法存在費時、檢測精度不高等缺點，對細菌污染引起的傷口感染、食物污染、因動物攜帶造成的交叉感染等得不到及時控制，檢測部門對快速檢測技術的需求日益增多。RPA技術起初由PIEPENBURG等[3]提出，將其用于檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的特異基因，可檢測到低至10個拷貝模板；目前，RPA與RAA技術已廣泛應用于副溶血性弧菌、大腸桿菌與金黃色葡萄球菌等檢測中。其中，孫曉紅等[16]建立了RAA-LFD技術檢測副溶血性弧菌的方法，并對檢測條件進行了優(yōu)化，獲得反應溫度為37 ℃，擴增時間為20 min的最佳反應條件。該方法檢測靈敏度比常規(guī)PCR高10倍數(shù)量級，為現(xiàn)場或低資源環(huán)境中檢測副溶血性弧菌提供了一種簡便、快速、特異靈敏的方法；魏瑩等[17]對易引起人和動物感染性疾病的病原體A族乙型溶血性鏈球菌通過RAA技術在恒定溫度下，20 min內實現(xiàn)快速檢測；DU等[18]將RPA技術在37～42 ℃擴增單核細胞增生李斯特菌目的基因，擴增產(chǎn)物可直接用LFD肉眼觀察；周廣彪等[19]建立基于RPA的檢測方法特異性好，不需要任何儀器輔助，只在人體溫度的條件下特異性擴增就可得到擬態(tài)弧菌的特異性目的條帶，其靈敏度與常規(guī)PCR法一致。

1.3 動物檢驗檢疫

血吸蟲病是一種能引起人和動物共感染的寄生蟲病，衛(wèi)生部報告顯示，近年來國家在控制血吸蟲病方面進展緩慢[20]，原因在于缺乏有效的診斷方法來監(jiān)測低強度感染與評估干預效果。因此，開發(fā)有效的快速檢測手段勢在必行[21-22]。SONG等[23]建立了RAA檢測日本血吸蟲特異性基因片段的新方法，可在30 min內簡便快速檢測到最低檢測模板為20拷貝或0.5 ng基因組DNA；SUN等[24]通過RPA-LFD技術快速直觀檢測到日本血吸蟲，為評價其有效性，與酶聯(lián)免疫吸附試驗和間接血凝試驗進行比較，發(fā)現(xiàn)RPA-LFD技術的靈敏性和特異性均高于另外2種，在現(xiàn)場應用中潛力良好；唐慧驥等[25]通過建立的RAA方法檢測發(fā)現(xiàn)新菠蘿灰粉蚧帶來的危害，具有耗時短，特異性區(qū)分效果好，適于檢驗人員快速檢測篩查；周鴻讓等[26-27]根據(jù)多房棘球絳蟲線粒體基因序列設計特異性引物進行RAA擴增后，通過瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis,AGE)檢測，能快速高效區(qū)分多房棘球絳蟲與其他寄生蟲，并通過建立雙重RAA方法成功檢測多房棘球絳蟲的2種類型，為多房棘球絳蟲蟲種鑒定與棘球蚴病基因診斷提供有效的技術支撐。

1.4 食品安全

食品安全一直是消費者關注的焦點。2013年歐洲爆發(fā)的“馬肉風波”[28]，用豬肉制作假牛肉干和牛肉丸子[29]行為欺騙消費者，擾亂市場。早期有基于環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)和等溫擴增熒光(isothermal amplification fluorescent technology, IAFT)技術應用到動物源性摻假檢測中，但其所需引物復雜、操作繁瑣[30-32]。部分研究者將RPA技術應用于肉類和轉基因等方面檢測，在實際檢測中獲得了良好的效果。如郭燕華等[33]以牛源性線粒體細胞色素b基因建立了特異性RPA檢測方法，其靈敏度可達0.1 ng/μL，可用于市售生鮮肉制品及加工肉制品中牛源性成分鑒定；林霖等[34]基于細胞色素C氧化酶亞型I中的豬特異性DNA序列結合核酸快速提取方法，建立RT-RPA快速檢測法，可檢出低至1%(質量分數(shù))的豬肉含量，對牛肉中是否摻有豬肉成分達到較好的區(qū)分。

商業(yè)化種植轉基因作物會讓一些利益分子乘虛而入，將用作飼料和其他用途的轉基因作物摻入到消費者的食品中。因此，有必要在轉基因農作物檢測領域開發(fā)快速高效、易于攜帶的檢測裝備。其中，劉靜等[35]根據(jù)外源基因草丁膦乙酰轉移酶基因與載體骨架連接區(qū)序列設計引物建立RPA檢測轉基因玉米Bt11的方法，檢測限遠低于歐盟國家設定的轉基因最低限量0.9%，靈敏度高，可滿足相關行業(yè)的日常檢測需求；謝實龍[36]建立RT-RPA快速篩查體系，能高靈敏度地檢出最低48拷貝數(shù)的模板。該技術在實際樣品篩查中,能提供穩(wěn)定可靠結果，在轉基因成分檢測中具有廣泛的應用價值。

2 存在問題與解決辦法

重組酶等溫擴增技術具有不受場地限制與檢測時間短等優(yōu)點，是一種理想可推廣的快速檢測方法。RPA與RAA技術作為新型重組酶等溫擴增技術，仍存在部分缺點。如重組酶等溫擴增技術分析易受多種因素影響。內因主要包括酶活性、引物探針設計等，外因主要包括產(chǎn)物檢測前處理、反應溫度和假陰性問題等。此外，固定反應體系和較高試劑成本也影響其普適性。

2.1 酶促反應

重組酶等溫擴增技術主要借助重組酶、單鏈DNA結合蛋白與DNA聚合酶等3種核心酶的協(xié)同作用完成擴增反應，其對蛋白酶活性要求較高，一方面需要保證反應體系中酶活性，任何一種酶失活都會導致擴增失?。涣硪环矫嫘枰ＷC反應體系中各種酶接觸充分，有效反應才能促進產(chǎn)物形成，提高反應效率。反應后的產(chǎn)物檢測方法多樣，主要有AGE[29，37]、RT-RAA和RT-RPA[38-39]、LFD[40]與聯(lián)動CRISPR/Cas系統(tǒng)[41]等。但反應結束后的體系中存在大量蛋白酶，若在進行AGE前不做處理，電泳結束后成像觀察有抹帶現(xiàn)象，影響目的條帶觀察。因此，重組酶等溫擴增產(chǎn)物在進行AGE前需要通過高溫使蛋白變性失活，離心取上清液進行檢測[42]；同時，通過加入酚-氯仿-異戊醇進行純化處理，檢測其上清液[43]。

2.2 引物探針設計

一個良好的核酸擴增關鍵在于引物與探針設計，根據(jù)引物設計原則，設計引物長度應在30 bp左右，過長或過短均會影響擴增速度和檢測靈敏度；擴增片段應在80～500 bp，以保證擴增反應的快速靈敏且有效。若樣品需要定時定量，可在該反應體系中添加探針，探針位置應位于上下游引物中間，設計時盡量避免下游引物和探針的重疊，減少影響擴增效率與產(chǎn)生非特異性信號的二聚體形成。最新開發(fā)的一款基于Python的軟件包[44]能自動創(chuàng)建和過濾RPA引物和探針對，其對比幾個序列識別保守目標，并過濾與可能背景生物交叉反應區(qū)域。但其使用需要一定的程序編輯基礎，這無疑給工作人員在篩選優(yōu)化引物序列時增加技術難度，降低效率。因此，特異性引物設計需自行摸索，篩選合適引物對進行擴增。其中，MOHAMMAD等[45]針對園藝作物設計了18對長度為18～28 bp的引物，發(fā)現(xiàn)有4對引物能成功擴增7種園藝作物的DNA。因此，有必要加強引物選擇，開發(fā)能替代手動設計的軟件來篩選最佳核苷酸引物對與探針。

2.3 反應溫度

重組酶等溫擴增反應可在較寬的溫度范圍內高效完成(<40 min)。RAA與RPA技術主要借助酶的活性來完成擴增，選擇最佳溫度是快速得到擴增產(chǎn)物的前提。相關研究顯示[8,19,46]，RPA與RAA技術反應溫度接近人體溫度，不依賴溫控設備，其在未來將會成為一種行之有效的自測手段，快速檢測人體自身的一些樣本。

2.4 假陰性問題

核酸材料被污染是影響分析結果準確性的關鍵，采取有效措施加以預防、避免至關重要。因此，擴增前后的區(qū)域應分開、使用帶濾芯的槍頭、使用完的材料應收集到密閉容器與在通風櫥進行操作均能提高檢測準確度。擴增得到的產(chǎn)物若要進行AGE或LFD等的開蓋檢測，勢必會引起氣溶膠污染，影響檢測結果，給實驗帶來一定誤差。在實驗過程中進行高溫或酚/氯仿純化處理，仍會帶來一定影響。對此可將核酸擴增試劑管與檢測試劑管組裝，在一個密封的環(huán)境中完成檢測，避免了開蓋操作引起的氣溶膠污染問題，能提高現(xiàn)場即時檢測的準確性[47]。

抑制劑或食品基質的影響會使檢測結果出現(xiàn)假陰性，影響結果判斷，從而進一步限制該技術在現(xiàn)場中的應用。根據(jù)檢測對象添加一段看家基因序列作為擴增內標(internal amplification control，IAC)，與目標基因同步擴增。若檢測結果只有IAC條帶沒有目標基因條帶，可判定為陰性，若檢測結果都沒有IAC條帶和目標基因條帶，可判定反應受到干擾或污染，出現(xiàn)假陰性，需重新進行檢測，從而降低假陰性風險，提高檢測準確度[48-49]。

2.5 使用成本

目前，市售的RAA和RPA技術都使用試劑盒，其反應體系已固定，會使用戶使用靈活性明顯降低，體系更改必然會引起污染問題，影響其普適性；作為具有自主知識產(chǎn)權保護的技術，成本相對較高等問題需要進一步完善，通過研發(fā)出低廉、高效的酶制劑降低成本是行之有效的手段。

3 前景與展望

重組酶等溫擴增技術作為在恒定溫度條件下反應的新型核酸體外擴增技術，其具有凍干粉形式易于運輸、靈敏度高、特異性強、反應時間快、操作簡單等優(yōu)點，逐漸被人們認可為一種“可替代PCR的技術”。雖然RAA與RPA技術還存在一定局限性，但這種重組酶等溫擴增技術填補了傳統(tǒng)培養(yǎng)和依賴溫變設備技術外的空缺，這種新技術能在現(xiàn)場和非實驗室環(huán)境實現(xiàn)即時檢測，具有潛在優(yōu)勢。相比較RPA來說，RAA重組酶來源相對廣泛，且是我國自主研發(fā)的新型等溫核酸擴增技術，符合我國快速檢測的需求。相信在不久的將來，研究人員將能在了解和完善反應機制的同時，使RAA與RPA擴增技術在研究和現(xiàn)場檢測中發(fā)揮更大價值，實現(xiàn)“核酸提取-擴增-檢測”三步一體化的操作。未來重組酶等溫擴增技術的發(fā)展方向和研究熱點將在小型化、便攜式儀器的基礎上，會在數(shù)字RPA、數(shù)字RAA和多通道檢測方面實現(xiàn)新的突破，將在低資源環(huán)境、部分醫(yī)療點和需求點等疾病突發(fā)地得到廣泛的推廣應用。