石子林,李軍喬,王雅瓊,馬新虎,侯 琴
(1.青海民族大學(xué)a.青藏高原蕨麻研究中心,b.生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院,c.經(jīng)濟(jì)與管理學(xué)院,中國(guó) 西寧 810000; 2.青海省特色經(jīng)濟(jì)植物高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó) 西寧 810000 )
密花香薷(ElsholtziadensaBenth.)為唇形科(Labiatae)香薷屬植物,又稱咳嗽草、蟋蟀巴等,民間常作為茶葉以及草藥使用,為藥食兩用植物[1]。其主要分布于甘肅、青海、四川、云南、西藏等海拔2 800~4 100 m 的地區(qū)[2]。密花香薷利水消腫,具有治療胃病、發(fā)熱無(wú)汗等功效,富含揮發(fā)油、黃酮、多糖等化學(xué)成分[3,4]。目前,對(duì)密花香薷揮發(fā)油類(lèi)研究較多,但總黃酮類(lèi)報(bào)道較少,尚無(wú)對(duì)密花香薷全草總黃酮分離純化的報(bào)道。
目前常用超臨界流體色譜(SFC)[5]、制備型高效液相色譜(HPLC)[6]、高速逆流色譜[7]、分子蒸餾技術(shù)[8]以及大孔樹(shù)脂吸附等來(lái)分離純化中藥材中的各類(lèi)化學(xué)成分。其中大孔樹(shù)脂吸附相較于其他幾種而言,有吸附時(shí)間較短、吸附樣品較多、純化效果較好、可再生、操作較為簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[9,10],被廣泛運(yùn)用于中藥材中黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、萜類(lèi)以及皂苷等物質(zhì)的分離純化[11-14]。
密花香薷在田間常被當(dāng)做雜草,但含有豐富的黃酮類(lèi)物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)基于包錦淵提出的密花香薷全草總黃酮提取的最優(yōu)工藝條件[15],對(duì)提取物進(jìn)行分離純化,以提高密花香薷全草提取液中總黃酮的含量,為密花香薷全草總黃酮類(lèi)成分的藥理活性的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
Neofuge23R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司)、UV-5500型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)、HZQ-X160恒溫震蕩培養(yǎng)箱(蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、BT102S微型蠕動(dòng)泵(保定雷弗流體科技有限公司)、EPED-20TH實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)、eppendorf移液槍(EPPENDORF)。
密花香薷于2019年7月采自青海省西寧市湟源縣牧場(chǎng)村蕨麻種植基地,經(jīng)青海民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院李軍喬教授鑒定為唇形科香薷屬植物密花香薷。B20771-蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%);乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、鹽酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠,均為分析純);D101,AB8-8,NKA-9,S-8,HPD-100及DM130型大孔樹(shù)脂(廊坊淼陽(yáng)化工有限公司);純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。
2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱量干燥到恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg,用70%乙醇(體積分?jǐn)?shù))溶解定容至50 mL,搖勻即得0.4 g·L-1蘆丁對(duì)照品溶液。
2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密移取1,2,4,6,8,10 mL對(duì)照品溶液于25 mL容量瓶中,分別加入70%乙醇6 mL及5%亞硝酸鈉溶液1 mL,搖勻,靜置6 min后加10%硝酸鋁溶液1 mL ,搖勻,靜置6 min后加4%氫氧化鈉溶液10 mL,用70%乙醇定容至刻度,搖勻靜置15 min。以空白樣做對(duì)照,于510 nm處測(cè)吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),吸光度(y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程為:y=0.007x+0.008 7,r2=0.999 6,線性范圍為0.016~0.160 g·L-1。
2.1.3 上樣液的制備 將密花香薷全草自然風(fēng)干至恒重,粉碎后過(guò)0.42 mm篩,精密稱取適量樣品粉末,轉(zhuǎn)移至250 mL燒瓶中,按照包錦淵的最佳提取工藝操作[15]。提取液冷卻后抽濾,濃縮,加純水溶解,離心后取上清液即得。冷藏放置,備用。
2.1.4 總黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定 用70%乙醇稀釋上樣液,并移取1 mL滴加于25 mL容量瓶?jī)?nèi),按2.1.2的方法顯色后,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線即得溶液中黃酮含有量。
2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密移取5份1.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按2.1.2的方法顯色后,測(cè)得溶液吸光度RSD值為1.18%,結(jié)果表明儀器精密度良好。
2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取1.0 mL上樣液,按2.1.2的方法顯色后,分別于0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 h測(cè)吸光度,測(cè)得其吸光度的RSD值為1.45%,表明上樣液在3.0 h內(nèi)保持穩(wěn)定。
2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密移取 5份1.0 mL上樣液,按2.1.2的方法顯色后測(cè)其吸光度,測(cè)得溶液吸光度的RSD值為1.54%,說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。
2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取 5份1.0 mL上樣液,加入1 mL對(duì)照品試液,搖勻,按2.1.2 的方法顯色,測(cè)完吸光度后得平均回收率為98.68%,RSD值為0.89%。
2.2.1 大孔樹(shù)脂預(yù)處理 將各型號(hào)的大孔樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24 h,待充分吸脹后,除去小顆粒上浮物,將樹(shù)脂倒入色譜柱(內(nèi)徑30 mm×600 mm)中,用純水淋洗至流出液與水混合無(wú)白色渾濁現(xiàn)象,繼續(xù)用大量純水洗至流出液無(wú)醇味;再分別用4%鹽酸和4%氫氧化鈉溶液洗脫浸泡5 h,用純水洗至中性,備用。
2.2.2 靜態(tài)吸附-解析試驗(yàn) 稱取2.0 g(濕重)已預(yù)處理好的6種型號(hào)大孔樹(shù)脂于150 mL錐形瓶中,加入3.80 g·L-1的上樣液15 mL,封口。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,于25 ℃,60 r·min-1下吸附24 h。抽濾,取濾液測(cè)其吸光度,計(jì)算吸附率和吸附量。濾出的樹(shù)脂用蒸餾水清洗掉表面殘留的未被吸附黃酮后,置于150 mL錐形瓶中,加25 mL 70%乙醇,封口,其余操作同吸附。測(cè)吸光度,計(jì)算其解吸量和解吸率:
吸附量=(c0-c1)Vy/Ws,吸附率=(c0-c1)/c0,
解吸量=c2·Vx/Ws, 解吸率=c2·Vx/(c0-c1)·Vy。
其中,c0和c1分別為吸附前后樣品溶液中總黃酮質(zhì)量濃度(g·L-1);c2為解吸后樣品溶液中總黃酮質(zhì)量濃度 (g·L-1);Vy為上樣液體積 (mL);Vx為解吸液體積(mL);Ws為樹(shù)脂質(zhì)量(g)。
2.2.3 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線 取2.0 g DM130型大孔樹(shù)脂于150 mL錐形瓶中,精密加入2.16 g·L-1上樣液50 mL,在25 ℃,60 r·min-1下吸附24 h,于1,2,3,4,5,6,12,18,24 h時(shí)分別取樣,測(cè)吸附率,平行實(shí)驗(yàn)3次,取平均值。
2.2.4 靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線 將2.2.3中吸附完全的樹(shù)脂抽濾,純水清洗至流出液無(wú)色后,置于150 mL錐形瓶?jī)?nèi),加入70%乙醇50 mL,震蕩吸附。后續(xù)操作同2.2.3。
2.3.1 上樣液濃度考察 稱取6份處理好的DM130型樹(shù)脂5 g濕法裝柱(色譜柱規(guī)格:內(nèi)徑20 mm×300 mm),吸取總黃酮質(zhì)量濃度分別為1.19,2.51,3.51,4.61,5.56,6.63 g·L-1且pH為7的上樣液2 BV(18 mL),流速為2 mL·min-1,測(cè)溶液吸附后吸光度,得最佳上樣液質(zhì)量濃度為3.51 g·L-1。
2.3.2 上樣液pH考察 固定上樣液質(zhì)量濃度3.51 g·L-1,流速2 mL·min-1,加入pH值分別為3,4,5,6,7,8的上樣液2 BV。上樣后,測(cè)溶液吸光度,得最佳上樣液pH值為4。
2.3.3 上樣液流速的考察 固定上樣液質(zhì)量濃度3.51 g·L-1,pH為4,分別以0.5,1,2,3,4,5 mL·min-1流速上樣2 BV后,測(cè)溶液吸光度并結(jié)合實(shí)際操作,取最佳上樣流速為1 mL·min-1。
2.3.4 上樣量的考察(泄露曲線的繪制) 固定上樣液質(zhì)量濃度3.51 g·L-1, pH為4,流速1 mL·min-1上樣7 BV,每1 BV收集一管,測(cè)定每管吸光度,計(jì)算樹(shù)脂吸附率,以流出液濃度達(dá)上樣液濃度的10%左右為泄漏點(diǎn)[16],得泄漏點(diǎn)為3 BV,從而得出最佳上樣量為3 BV。
2.4.1 洗脫劑濃度的考察 稱取5份在最佳上樣條件下已吸附完全的樹(shù)脂5 g,裝柱,先用純水洗滌樹(shù)脂上沾有的未被吸附的溶劑,待流出液至無(wú)色后,固定流速4 mL·min-1,洗脫量3 BV,分別以 50%,60%,70%,80%及90%的乙醇洗脫過(guò)柱,收集流出液測(cè)吸光度,計(jì)算其解吸率,得最佳洗脫劑為70%乙醇。
2.4.2 洗脫劑流速的考察 固定洗脫劑為70%乙醇3 BV,以0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL·min-1流速洗脫,收集流出液,測(cè)其吸光度,計(jì)算其解吸率,結(jié)合實(shí)際操作,從而得出最佳流速為1.0 mL·min-1。
2.4.3 洗脫量的考察(洗脫曲線的繪制) 取1份在最佳上樣條件下已吸附完全的樹(shù)脂5 g,裝柱(樹(shù)脂吸附的總黃酮為378.81 mg),固定洗脫劑為70%乙醇,流速1.0 mL·min-1,每1 BV收集一管,測(cè)其吸光度,計(jì)算洗脫率并繪制洗脫曲線,結(jié)合實(shí)際,確定最佳洗脫量為4 BV。
在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),以樹(shù)脂的吸附率為響應(yīng)值,分別選取上樣液濃度(A),上樣液流速(B),上樣液pH(C),3因素為自變量,進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)純化工藝進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)方案如表1。
表1 響應(yīng)面因素水平表
響應(yīng)面試驗(yàn)用Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì),圖形均用Origin 2017制作,表格用Excel 2013處理。
大孔樹(shù)脂不同的理化性質(zhì)可顯著影響其吸附、解吸效果,本實(shí)驗(yàn)選用6種不同性質(zhì)的大孔樹(shù)脂試驗(yàn)(吸附和解吸情況見(jiàn)表2)。其中DM130型大孔樹(shù)脂吸附率最高達(dá)87.02%,解吸率達(dá)87.50%,AB-8型大孔樹(shù)脂解吸率最高達(dá)90.06%,但其吸附率只有84.19%。結(jié)合實(shí)際,本實(shí)驗(yàn)選取DM130型大孔樹(shù)脂作為密花香薷全草總黃酮純化的最佳大孔樹(shù)脂。
表2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附/解吸能力
3.2.1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線 由圖1可知,加入樣品溶液后,樹(shù)脂在0~6 h吸附率上升較快,在6~24 h內(nèi)上升較平緩,結(jié)合實(shí)際操作,選擇最佳靜態(tài)吸附時(shí)間為6 h,此時(shí)吸附率為73.47%。
3.2.2 靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線 由圖2可知,解吸時(shí)間在0~5 h時(shí)樹(shù)脂解吸速率較快,在6~12 h時(shí)樹(shù)脂解吸速率較平緩,結(jié)合實(shí)際操作,靜態(tài)解吸選擇的最佳解吸時(shí)間為5 h,解吸率為80.70%。
圖1 DM130型大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 1 Static adsorption kinetics curve of DM130 macroporous resin
圖2 DM130型大孔樹(shù)脂靜態(tài)解析動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 2 DM130 macroporous resin static analytical kinetics curve
當(dāng)上樣液總黃酮濃度逐漸升高時(shí),吸附率也隨之升高;當(dāng)上樣液中總黃酮質(zhì)量濃度>3.51 g·L-1后,吸附率反而下降,結(jié)果如圖3。證明樹(shù)脂在3.51 g·L-1時(shí)已達(dá)其最大吸附率(88.85%)。
當(dāng)上樣液pH為4時(shí),樹(shù)脂的吸附率達(dá)最高值(89.36%),當(dāng)pH>4后,吸附率反而下降,結(jié)果如圖4。說(shuō)明上樣液酸性較強(qiáng)時(shí)有利于樹(shù)脂對(duì)密花香薷全草中總黃酮的吸附,當(dāng)酸性偏高或偏低以及偏堿性時(shí),吸附率也隨之降低。因此上樣液最佳pH值為4,此時(shí)吸附率為89.36%。
圖3 上樣液濃度對(duì)DM130型樹(shù)脂吸附率的影響Fig. 3 Effect of concentration on adsorption rate of DM130 resin
圖4 pH值對(duì)DM130型樹(shù)脂吸附率的影響Fig. 4 Effect of pH value on adsorption rate of DM130 resin
當(dāng)上樣液流速逐漸加快時(shí),吸附率也隨之降低,當(dāng)流速達(dá)0.5 mL·min-1,吸附率到最大值91.24%,考慮到實(shí)際操作,選擇最佳上樣流速為1 mL·min-1。結(jié)果見(jiàn)圖5。
由圖6可知,當(dāng)上樣量為1 BV時(shí)開(kāi)始泄露,當(dāng)上樣量為3 BV時(shí),泄露的總黃酮質(zhì)量濃度為0.33 g·L-1,即約達(dá)上樣液質(zhì)量濃度3.31 g·L-1的10%,可認(rèn)為此點(diǎn)即為上樣的泄漏點(diǎn),過(guò)此點(diǎn)后,上樣液泄漏量逐漸上升,結(jié)合實(shí)際操作等情況,選擇最佳上樣量為3 BV。
圖5 上樣液流速對(duì)DM130型樹(shù)脂吸附率的影響Fig. 5 Effect of loading velocity on adsorption rate of DM130 resin
圖6 DM130型大孔樹(shù)脂吸附泄露曲線Fig. 6 Adsorption leakage curve of DM130 macroporous resin
當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)由50%依次增加到90%時(shí),洗脫液中總黃酮濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)70%時(shí),出現(xiàn)最大值,即為88.04%,由此可見(jiàn),70%乙醇即為最佳的密花香薷全草中總黃酮洗脫劑。其結(jié)果見(jiàn)圖7。
當(dāng)洗脫劑流速逐漸加快時(shí),洗脫率逐漸降低,當(dāng)洗脫劑流速為0.5 mL·min-1時(shí),洗脫液中總黃酮達(dá)最大值為91.57%,但結(jié)合實(shí)際操作,選擇1 mL·min-1為最佳洗脫流速,此時(shí)解吸率為90.65%(圖8)。
圖7 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)DM130型樹(shù)脂解吸率的影響Fig. 7 Effect of eluent concentration on the resolution of DM130 resin
圖8 洗脫劑流速對(duì)DM130型大孔樹(shù)脂解吸率的影響Fig. 8 Effect of eluent velocity on the resolution of DM130 macroporous resin
由圖9可知,當(dāng)洗脫量為1 BV時(shí),洗脫液中總黃酮達(dá)5.669 g·L-1,為洗脫總量的40.41%;當(dāng)洗脫量為2 BV時(shí),此時(shí)樹(shù)脂已趨近淡黃色,大部分黃酮已被洗脫出,洗脫率為77.43%。出于回收率以及成本的考慮,本實(shí)驗(yàn)選擇洗脫劑用量為4 BV,此時(shí)的洗脫率為91.85%。
圖9 DM130型大孔樹(shù)脂洗脫曲線 Fig. 9 DM130 macroporous resin elution curve
通過(guò)軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析,得吸附率與各因素水平之間的二次多項(xiàng)式方程,吸附率=8.33+32.56A+6.20B+12.44C-0.39AB+0.07AC+0.94BC-4.80A2-5.63B2-1.71C2。
對(duì)上述回歸方程進(jìn)行方差分析,由表4可知,各因素對(duì)吸附率的影響從大到小為:B(上樣液流速)、A(上樣液濃度)、C(pH)?;貧w模型的P=0.003 9 (P<0.01),說(shuō)明該模型極顯著且響應(yīng)值與試驗(yàn)的各因素存在顯著的線性相關(guān)性,回歸決定系數(shù)R2=0.922 4,說(shuō)明響應(yīng)值的變化有92.24%來(lái)源于所選擇因素的變化。同時(shí)失擬差P=0.191 3 (P>0.05),影響不顯著,進(jìn)一步表明該回歸方程可較好地描述響應(yīng)值與各因素之間的關(guān)系。綜上,可確定該回歸方程為總黃酮的優(yōu)化提供了一個(gè)較為合適的模型。
通過(guò)響應(yīng)面分析得出,最佳吸附條件為:上樣液質(zhì)量濃度3.51 g·L-1, 流速0.76 mL·min-1,pH值3.92,此時(shí)吸附率為90.22%??紤]到實(shí)際操作的可行性,選取上樣液質(zhì)量濃度3.50 g·L-1,流速1 mL·min-1,pH為4。
根據(jù)上述響應(yīng)面吸附試驗(yàn)結(jié)果,確立最優(yōu)工藝條件,在此條件下進(jìn)行吸附-解吸,測(cè)完溶液吸光度后,再將洗脫液旋干至浸膏,烘干后稱定其質(zhì)量,計(jì)算總黃酮吸附率、解吸率、純度及回收率:
總黃酮純度=ca·Va/ma,總黃酮回收率=mb/mc。
式中,ca為洗脫液中總黃酮質(zhì)量濃度(g·L-1),Va為洗脫液體積(mL),ma為洗脫液干燥后的質(zhì)量(g),mb為洗脫液中總黃酮的質(zhì)量(g),mc為上樣液中總黃酮的質(zhì)量(g)。
上述實(shí)驗(yàn)平行3次。結(jié)果顯示,用上述方法吸附解吸后,吸附率達(dá)89.20%,解吸率達(dá)89.66%,純度由之前的40.96%增至87.94%,回收率為77.85%。
為了更好地反映各因素對(duì)提取率的影響,繪制三維曲面圖(圖10,彩圖見(jiàn)封三)。曲面圖坡度的陡峭程度說(shuō)明該因素對(duì)提取率影響的顯著性,越陡則越顯著。由圖10可知,B(流速)對(duì)提取率的影響最大,A(濃度)次之,C(pH)則最小。
表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果
表4 方差分析
黃酮類(lèi)化合物有諸多藥理及生理學(xué)活性,如抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗骨質(zhì)疏松、保肝護(hù)肝等。密花香薷全草中黃酮含量較高,具有良好的開(kāi)發(fā)價(jià)值,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)DM130型大孔樹(shù)脂對(duì)密花香薷全草總黃酮進(jìn)行純化,為后續(xù)對(duì)密花香薷深度加工和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
圖10 各因素相互作用對(duì)吸附率影響的響應(yīng)面圖Fig. 10 Response surface polts showing the mutual effects of different factor on the yield of adsorption
本實(shí)驗(yàn)考察了S-8,HPD-100,NKA-9,DM130,AB-8及D101共6種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)密花香薷全草中總黃酮的吸附-解吸性能,發(fā)現(xiàn)DM130型大孔樹(shù)脂具有較好的純化效果,最佳工藝參數(shù)為上樣液質(zhì)量濃度3.50 g·L-1,上樣液pH為4,體積為3 BV,流速為1 mL·min-1。洗脫前先用純水將殘留的黃酮洗除干凈,待流出液至無(wú)色時(shí)再加洗脫劑洗脫。洗脫劑為70%乙醇,體積為4 BV,流速為1 mL·min-1。在該工藝下,其純度由原先的40.96%提升至87.94%,回收率為77.85%,說(shuō)明該純化工藝行之有效,具有良好的分離純化密花香薷全草中總黃酮的效果。
湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)2020年6期