毛竹屑多糖分離純化及抗炎活性研究

許子競(jìng)，楊玉瓊，劉 茜

(1.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院天然產(chǎn)物協(xié)同創(chuàng)新中心，中國(guó) 畢節(jié) 551700；2.畢節(jié)市民族藥用植物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó) 畢節(jié) 551700；3.梧州學(xué)院化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院，中國(guó) 梧州 543000)

毛竹(Phyllostachysheterocycla(Carr.)Mitfordcv.Pubescens)，又叫楠竹，體形筆直修長(zhǎng),是我國(guó)長(zhǎng)江以南栽種的主要經(jīng)濟(jì)林之一。隨著工業(yè)化的發(fā)展，毛竹常被制作成各種竹板材，各地生產(chǎn)企業(yè)用量大；然而在竹材加工過(guò)程中，產(chǎn)生了大量的鋸屑和碎片，大多被當(dāng)做廢棄物而污染環(huán)境。隨著現(xiàn)代天然產(chǎn)物化工技術(shù)的發(fā)展，毛竹被發(fā)現(xiàn)全身是寶。竹葉中含有黃酮類、酚酸、內(nèi)酯、生物堿、生物活性多糖、氨基酸肽類、蒽醌類、萜類內(nèi)酯等[1-3]，大都有較強(qiáng)的生物活性作用[4-6]。目前，對(duì)竹葉的成分和開發(fā)應(yīng)用研究得較多，竹葉中一些黃酮類提取物在食品、藥品和化妝品中已得到了一定的應(yīng)用[7，8]；但對(duì)廢棄的竹屑化學(xué)成分研究較少，尤其是竹屑中含有的具有生物活性的多糖[9，10]，鮮見研究和報(bào)道。本試驗(yàn)利用微波水提竹屑中的多糖，然后進(jìn)行分離、純化、純度檢測(cè)及分子質(zhì)量測(cè)定[11，12]，并將精制的竹屑多糖(Polysachaide ofPhyllostachyspubescenschip, PPCP)對(duì)致炎小白鼠進(jìn)行抗炎癥試驗(yàn)[13-15]，為竹屑多糖在食品、保健、日化等行業(yè)的應(yīng)用提供理論依據(jù)，以期進(jìn)一步開發(fā)竹類資源。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

竹屑由貴州赤水赤化集團(tuán)提供。

乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇、氯化鈉、磷酸、磷酸氫鈉，均為分析純；D101 大孔樹脂 (河北翔藍(lán)化工公司)；透析袋(上海華美生物工程公司)；DEAE-纖維素(上海化學(xué)試劑一廠)；Sephadex G-15，Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia公司)；巴豆油合劑、昆明系小鼠(均購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué))，葡聚糖標(biāo)樣(美國(guó)Sigma公司)；吲哚美辛(Sigma-Aldrich)。

中速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);2102PCS 紫外-可見分光光度計(jì)(尤尼科(上海)儀器有限公司);冷凍真空干燥器(北京博醫(yī)康技術(shù)有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀系列(河南益華設(shè)備有限公司);微波提取設(shè)備(10 L)(天水華源微波設(shè)備有限公司);BSZ-100B 型自動(dòng)部分收集器(上海青浦瀘西儀器公司);Waters 515型凝膠色譜儀(美國(guó)Waters 公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 竹屑多糖PPCP的提取、分離、純化[16，17]

1.2.1.1 提取 取烘干恒重的竹屑粉末6 kg，用微波提取器分2批次，在80 ℃下提取3次，每次40 min；提取液離心去雜、減壓濃縮至原體積的1/10左右，加乙醇至含醇80%～85%，靜置過(guò)夜，離心，得PPCP沉淀物。PPCP冷凍干燥，得粗多糖干燥物，用索氏提取器，以乙酸乙酯回流提取PPCP干燥物，去除非糖脂溶性物質(zhì)。

1.2.1.2 脫色 將1.2.1.1所得PPCP配成水溶液，直至沉淀物不再溶解，過(guò)濾，取濾液過(guò)D101大孔樹脂，用純化水洗脫，收集水洗脫液，濃縮至稀流膏狀。

1.2.1.3 分離 將1.2.1.2稀流膏稀釋，DEAE-纖維素柱梯度洗脫，依次用純化水和NaCl溶液(0.16，0.26，0.36 mol·L-1)洗脫，用苯酚-硫酸顯色檢測(cè)，紫外檢測(cè)吸光度，收集水和NaCl溶液洗脫液，依次命名PPCP-0，PPCP-0.16，PPCP-0.26和PPCP-0.36。

1.2.1.4 脫蛋白 用水、NaCl溶液洗脫液，采用Sevage(V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)法脫蛋白，在紫外260～280 nm處檢測(cè)，無(wú)明顯吸收峰，表明脫蛋白已符合試驗(yàn)要求。

1.2.1.5 脫鹽 脫蛋白后的PPCP溶液過(guò)葡聚糖凝膠Sephadex G-15柱，脫鹽。

1.2.1.6 透析 將1.2.1.5的PPCP溶液濃縮，裝入精密透析袋(1.0 kDa)內(nèi)，活水透析3日以上，去除殘留鹽及色素。

1.2.1.7 凝膠純化 由于PPCP-0，PPCP-0.26和PPCP-0.36質(zhì)量過(guò)少，不足以支撐后續(xù)研究。將透析后質(zhì)量較多的PPCP-0.16溶液濃縮，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，經(jīng)瓊脂糖凝膠Sepharose 6 FF柱純化水洗脫，自動(dòng)收集器收集，收集管用苯酚-硫酸顯色檢測(cè)，依據(jù)吸光度強(qiáng)弱繪制洗脫曲線，根據(jù)曲線峰形收集合并試管收集液，得3個(gè)組分PPCP-0.16-1，PPCP-0.26-2和PPCP-0.36-3，冷凍干燥。

1.2.2 PPCP組分純度鑒定和相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 采用凝膠滲透色譜法，Waters 600型凝膠色譜儀，TOSOH BIOSEP G4000SWXL柱(7.8 mm×300 mm )，柱溫：40 ℃,檢測(cè)器溫度：40 ℃；流動(dòng)相：0.05 mol·L-1H3PO4-Na2HPO4緩沖液(pH6.7，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的NaN3)；流速:1.0 mL·min-1；示差折光檢測(cè)，進(jìn)樣體積20 μL；以平均分子量(Mp)為2.14×103，4.35×103，1.248×104，2.96×105，4.77×104，8.010×104，1.12×105和2.25×105的葡聚糖為對(duì)照品檢測(cè)。

1.3 精制多糖PPCP消炎活性研究

將精制多糖(脫蛋白后的多糖)，對(duì)昆明種小鼠做抗炎活性試驗(yàn)。小鼠50只，體重19～21 g，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為模型組(純化水10 mL·kg-1)，陽(yáng)性對(duì)照(吲哚美辛 5 mg·kg-1)組，按低(0.1 mg·kg-1)、中(0.5 mg·kg-1)、高(1.0 mg·kg-1)劑量藥給小鼠灌胃，連續(xù)3 d給藥，最后一次給藥后30 min于各鼠左耳用2%巴豆油合劑0.05 mL致炎，右耳作對(duì)照[18，19]，4 h后將小鼠拉斷頸椎處死，剪下兩耳，用直徑8 mm打孔器分別在同一部位打圓耳片，分析天平稱取小鼠左右耳質(zhì)量，以其差值作為炎性腫脹程度，并計(jì)算腫脹抑制率,計(jì)算公式為：腫脹率=(右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量)/左耳質(zhì)量；抑制率=(1-給藥組平均腫脹率/模型組平均腫脹率)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹屑多糖微波輔助提取及脫蛋白

6.0 kg竹屑在微波輔助下水提，得粗多糖PPCP 144.03 g,苯酚-硫酸檢測(cè)，粗多糖提取率為 2.04%，粗多糖PPCP經(jīng)脫色、脫蛋白，得精制PPCP 62.29 g。PPCP脫蛋白前后經(jīng)紫外線檢測(cè)，在250～280 nm處無(wú)吸收峰，如圖1所示，表明PPCP脫蛋白很好。

2.2 PPCP上DEAE-纖維素柱梯度洗脫

PPCP溶液上DEAE-纖維素柱洗脫分離，分別用純化水，NaCl溶液(0.16，0.26，0.36 mol·L-1)梯度洗脫，苯酚-硫酸顯色，依據(jù)紫外線吸收強(qiáng)度，繪制洗脫曲線。圖2為0.16 mol·L-1NaCl溶液洗脫P(yáng)PCP的吸光度曲線圖，其中1 BV=10 mL。

圖1 紫外檢測(cè)PPCP脫蛋白前后圖譜Fig. 1 UV spectra of PPCP before and after removing protein

圖2 0.16 mol·L-1 NaCl溶液在DEAE—纖維素柱上洗脫曲線Fig. 2 Elution curve of 0.16 mol·L-1 NaCl solution on DEAE-cellulose column

2.3 PPCP-0.16上瓊脂糖凝膠Sepharose 6 FF柱純化

將0.16 mol·L-1NaCl溶液洗脫DEAE-纖維素柱的收集液，用Sepharose 6 FF柱進(jìn)一步分離純化，純化水洗脫，依據(jù)紫外吸光度強(qiáng)弱與對(duì)應(yīng)收集的試管數(shù)(每支試管容量10 mL，計(jì)1 BV)，繪制吸光度與試管數(shù)的洗脫曲線，如圖3所示，依據(jù)曲線形狀從左至右依序分別命名為PPCP-0.16-1，PPCP-0.16-2和PPCP-0.16-3。

2.4 PPCP組分純度鑒定和相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用高效凝膠過(guò)濾色譜法進(jìn)行鑒定分析，同時(shí)測(cè)定PPCP-0.16-1，PPCP-0.16-2和PPCP-0.16-3相對(duì)分子質(zhì)量，由圖4可知，3個(gè)組分經(jīng)高效凝膠過(guò)濾色譜檢測(cè)，得相對(duì)對(duì)稱的單一洗脫峰型，表明竹屑粗多糖PPCP經(jīng)樹脂脫色、脫蛋白、DEAE-纖維素柱分離、Sephadex G-15和透析脫鹽、Sepharose 6 FF進(jìn)一步純化，得相對(duì)均一的多糖組分，其相對(duì)分子質(zhì)量及分布參數(shù)如表1所示。

圖3 0.16 mol·L-1NaCl洗脫液上Sepharose 6 FF柱分離組分曲線Fig. 3 Separation curve of 0.16 mol·L-1 NaCl eluent on Sepharose 6 FF column

表1 PPCP-0.16 純化3個(gè)組分的相對(duì)分子質(zhì)量和分布參數(shù)

圖4 PPCP-0.16-1，PPCP-0.16-2和PPCP-0.16-3 分子過(guò)凝膠的色譜檢測(cè)圖Fig. 4 Chart of PPCP-0.16-1，PPCP-0.16-2 and PPCP-0.16-3 through the chromatographic detection gel

2.5 精制多糖PPCP的抗消炎活性試驗(yàn)

精制多糖PPCP高、中劑量及陽(yáng)性對(duì)照藥(吲哚美辛)能降低巴豆油致小鼠耳廓腫脹，且與模型對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05),見表2.

表2 PPCP對(duì)小鼠耳片腫脹的影響

3 結(jié)論

竹屑在微波輔助下水提獲得粗多糖PPCP,粗多糖提取率為 2.04%，再經(jīng)樹脂D101脫色和Sevage法脫蛋白，得精制PPCP。用0.16 mol·L-1NaCl溶液洗脫DEAE-纖維素柱，洗脫液經(jīng)Sephadex G-15和透析脫鹽，再經(jīng)Sepharose 6 FF進(jìn)一步純化，得3個(gè)相對(duì)均一的多糖組分PPCP-0.16-1，PPCP-0.16-2和PPCP-0.16-3，其峰值分子量分別為5 782，5 845，4 731。精制多糖PPCP對(duì)致炎小白鼠進(jìn)行抗炎試驗(yàn)，結(jié)果表明，精制PPCP對(duì)炎癥有一定的抑制率。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)竹屑多糖的研究鮮有報(bào)道，本研究將為竹屑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。