基于CoMFA研究培氟沙星均三唑硫醚衍生物抗增殖活性與分子設(shè)計(jì)

馮 惠，秦正龍，李 靖，馮長君

(1. 徐州工程學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，中國 徐州 221018；2.江蘇師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，中國 徐州 221116)

因拓?fù)洚悩?gòu)酶既是抗菌作用靶標(biāo)，也是抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)，由此可通過結(jié)構(gòu)修飾將以喹啉-4-酮-3-羧酸為優(yōu)勢(shì)藥效團(tuán)的氟喹諾酮藥物的抗菌活性轉(zhuǎn)化為抗腫瘤活性[1,2]。值得關(guān)注的是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(Topo II)可能是一些雜環(huán)縮氨基硫脲類化合物的抗腫瘤作用靶點(diǎn)，而該靶點(diǎn)也是抗腫瘤藥物研究的重要靶點(diǎn)[3]。胡國強(qiáng)等[4,5]發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮中C-3羧基并非是抗腫瘤活性所必要的藥效團(tuán)，被其等排體如酰腙、唑雜環(huán)等替代可提高其抗腫瘤活性。因此，謝玉鎖等[6]利用藥效團(tuán)拼合原理，用均三唑雜環(huán)作為抗菌培氟沙星(Pefloxacin)C-3羧基的等排體，并引入縮氨基硫脲，成功合成24個(gè)培氟沙星均三唑硫醚衍生物。他們采用MTT法測(cè)定上述化合物對(duì)小鼠白血病細(xì)胞(L1210)的體外抗增殖活性(IC50)，其半數(shù)抑制濃度明顯低于前體藥培氟沙星。馮惠等[7]采用半經(jīng)驗(yàn)計(jì)算法 MOPAC-AM1研究15種氟喹諾酮均三唑稠雜環(huán)類衍生物( FQTHs)體外抗腫瘤活性，獲得良好的擬合性。趙曉輝等[8]釆用 Sybyl-X 2.0軟件中的比較分子力場(chǎng)分析(CoMFA)、比較分子相似性指數(shù)分析(CoMSIA)方法研究12種氟喹諾酮(FQs)同系物光降解半衰期(t1/2)，預(yù)測(cè)能力令人滿意。目前尚未見到有關(guān)培氟沙星(Pefloxacin)同系物的定量結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)(Quantitative Structure-Activity Relationship, QSAR)研究[9-12]的報(bào)道。

徐光憲曾稱定量結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)為21世紀(jì)化學(xué)的4個(gè)“世紀(jì)難題”之一，因它涉及化學(xué)的根本問題。QSAR是基于數(shù)理及統(tǒng)計(jì)方法研究分子結(jié)構(gòu)與性能之間定量關(guān)系的學(xué)科，已在預(yù)測(cè)化合物理化性質(zhì)與生物活性方面成為化學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)境等學(xué)科的熱門領(lǐng)域。目前，QSAR主要分為二維(2D)和三維(3D)兩類[13]。后者由于引入分子結(jié)構(gòu)的三維構(gòu)象信息，通常能夠獲得質(zhì)量更佳的QSAR模型。在3D-QSAR方法中最為常用的是1988年Crameretal提出的比較分子力場(chǎng)分析(comparative molecular field analysis，CoMFA)[14-21]。本文基于CoMFA方法建立培氟沙星均三唑硫醚衍生物對(duì)小鼠白血病細(xì)胞(L1210)體外抗增殖活性(pIC)[6]的3D-QSAR模型，以揭示影響pIC的分子結(jié)構(gòu)因素，探討抑制小鼠白血病細(xì)胞(L1210)作用的微觀機(jī)理。

1 數(shù)據(jù)來源

24種培氟沙星均三唑硫醚衍生物的分子基本結(jié)構(gòu)[6]見圖1，其中取代基R和X見表1。在表1中的“IC50”是上述化合物對(duì)小鼠白血病細(xì)胞(L1210)的半數(shù)抑制濃度，其單位為μmol·L-1。

根據(jù)化學(xué)平衡理論，化學(xué)反應(yīng)自由能變(ΔG)與體系平衡濃度為對(duì)數(shù)關(guān)系。故令：

pIC= -lg[IC50/(mol·L-1)]。

(1)

它們的pIC數(shù)據(jù)見表1。

2 建模方法

培氟沙星均三唑硫醚衍生物對(duì)小鼠白血病細(xì)胞體外抗增殖活性[6]的3D-QSAR模型，采用Tripos公司Sybyl-x2.1.1藥物分子模擬軟件予以建立。

2.1 化合物分子藥效構(gòu)象的確定及分子疊合

使用Sketch molecule模塊構(gòu)建24個(gè)培氟沙星均三唑硫醚衍生物分子[6]和新設(shè)計(jì)3個(gè)分子的初始三維結(jié)構(gòu)；對(duì)上述分子進(jìn)行分子力學(xué)能量優(yōu)化的程序?yàn)镸inimize模塊，以獲得它們能量最低構(gòu)象，即藥效構(gòu)象(亦稱生物活性構(gòu)象)，用于分子疊合。

圖2 訓(xùn)練集(a)、測(cè)試集(b)的疊合圖 Fig. 2 The plots of all the aligned molecules in training set(a) and test set(b)

隨機(jī)抽取第3，9，16，22及23號(hào)分子以及新設(shè)計(jì)的3個(gè)分子(25～27號(hào)分子)為測(cè)試集(Test set)，余下20個(gè)分子作為訓(xùn)練集(Training set)。在Align database中采用原子契合的公共骨架疊合方式，其公共骨架為樣本中生物活性最強(qiáng)的分子(即模板分子)所提供。該疊合方式能夠盡量使分子間相互重疊時(shí)取向相同，疊合誤差最小。Align database模塊以對(duì)L1210細(xì)胞體外抗增殖活性最強(qiáng)的22號(hào)分子提供疊合的公共骨架，Align database模塊給出的訓(xùn)練集、測(cè)試集疊合圖見圖2，圖中顯示各個(gè)分子間密切疊合。

表1 培氟沙星均三唑硫醚衍生物分子結(jié)構(gòu)與抗增殖活性(pIC)

2.2 CoMFA模型的建立

采用CoMFA計(jì)算訓(xùn)練集中每個(gè)疊合分子周圍所有網(wǎng)格點(diǎn)上的立體場(chǎng)(Steric，St)及靜電場(chǎng)(Electrostatic，El)的場(chǎng)能值。以對(duì)小鼠白血病細(xì)胞(L1210)體外抗增殖活性pIC為因變量，場(chǎng)能值為自變量，用偏最小二乘法(Partial least squares，PLS)進(jìn)行建模。一是以交叉驗(yàn)證系數(shù)Rcv2衡量模型的預(yù)測(cè)能力，要求模型Rcv2>0.5，其可信度優(yōu)于95%，統(tǒng)計(jì)意義十分顯著[22]；二是進(jìn)行回歸分析，即以最佳主成分?jǐn)?shù)N建立非交叉QSAR模型，獲得相關(guān)系數(shù)R2、統(tǒng)計(jì)方差比F、估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)誤差SD；最后通過View CoMFA模塊呈現(xiàn)三維等勢(shì)圖，以直觀反映立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)對(duì)培氟沙星均三唑硫醚衍生物pIC的貢獻(xiàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 pIC的CoMFA模型

培氟沙星均三唑硫醚衍生物對(duì)小鼠白血病細(xì)胞(L1210)體外抗增殖活性pIC的3D-QSAR模型見表2。

表2 訓(xùn)練集pIC的CoMFA模型

模型質(zhì)量檢驗(yàn)如下：

(1)交叉驗(yàn)證部分：Rcv2>0.5，表明模型的或然性很低，具有良好的預(yù)測(cè)能力與穩(wěn)健性。

(2)非交叉驗(yàn)證部分：①判定系數(shù)檢驗(yàn)：具有良好擬合性的QSAR模型，其R2≥0.80[23]。R2=0.926>0.8，顯示良好的相關(guān)性。由于判定系數(shù)R2又稱為削減誤差比例，說明該模型包含了影響pIC的92.6%以上因素，未被揭示的因素所占份額不足7.4%，因此可用于pIC的估算與預(yù)測(cè)。②顯著性檢驗(yàn)：在95%顯著水平下，訓(xùn)練集CoMFA模型的F臨界值為：F0.05(4,15) =3.06。所建模型的F是其15倍之多，表明模型規(guī)定的因果關(guān)系顯著，有95%以上的可信度。

(3)外部預(yù)測(cè)能力：利用訓(xùn)練集的3D-QSAR模型對(duì)測(cè)試集中分子的pIC進(jìn)行預(yù)測(cè)，以檢驗(yàn)其外部預(yù)測(cè)能力。由表1可見，對(duì)pIC預(yù)測(cè)的平均絕對(duì)預(yù)測(cè)誤差僅為0.139，與相應(yīng)實(shí)驗(yàn)值非常吻合，顯示很好的外部預(yù)測(cè)能力。

3.2 CoMFA等勢(shì)圖

CoMFA模型的三維等勢(shì)圖分為立體作用分布圖和靜電作用分布圖。

圖3 CoMFA模型的立體場(chǎng)(a)與靜電場(chǎng)(b)等勢(shì)圖Fig. 3 CoMFA contour maps (a) steric field; (b) electrostatic field

以化合物22為模板分子的pIC的三維立體場(chǎng)等勢(shì)圖見圖3(a)(彩圖見封三)。在縮氨基硫脲部位有2個(gè)綠色區(qū)域，該區(qū)域引入體積較大的取代基有助于提高化合物的抗增殖活性。因此，1～12號(hào)化合物沒有縮氨基硫脲部分，其抗增殖活性都弱于相應(yīng)13～24化合物。另外，在苯環(huán)的3,4-位之間(偏4-位)有個(gè)黃色區(qū)域，該區(qū)域引入體積小的基團(tuán)會(huì)使化合物的生物活性增強(qiáng)。例如6和18號(hào)化合物的3,4-位基團(tuán)為—OCH2—，7和19號(hào)化合物的3,4-位為MeO—，它們的體積均比2～5及14～17號(hào)化合物的取代基大，因此，化合物6，7，18及19的抗增殖活性較弱。

以化合物22為模板分子的pIC的三維靜電場(chǎng)等勢(shì)圖見圖3(b)。在縮氨基硫脲部位有個(gè)靠近氨基中氫原子較大的藍(lán)色區(qū)域，在此區(qū)域引入正電性基團(tuán)利于生物活性增強(qiáng)。后12個(gè)化合物具有縮氨基硫脲，因此，它們的抗增殖活性都強(qiáng)于(相應(yīng))前12個(gè)化合物。在苯環(huán)的4-位有個(gè)紅色區(qū)域(忽略較遠(yuǎn)處的一個(gè)小紅色區(qū)域)，此區(qū)域引入負(fù)電性取代基有助于增強(qiáng)化合物的抗增殖活性。例如4-位上氟原子是最強(qiáng)的負(fù)電性基團(tuán)，故10號(hào)在前12個(gè)化合物中、22號(hào)在后12個(gè)化合物均有最強(qiáng)的抗增殖活性。尚需指出，12號(hào)和24號(hào)化合物中苯環(huán)的4-位為硝基(—NO2)，雖然—NO2中存在2個(gè)電負(fù)性僅次于氟原子的氧原子，但其抗增殖活性均為前12和后12中最弱(4.246與4.629)。因這2個(gè)負(fù)電性氧原子均部分處于紅色區(qū)域，而正電性的氮原子(其電負(fù)性低于氧原子)卻處于紅色區(qū)域，導(dǎo)致抗增殖活性急劇下降。

表2給出立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)對(duì)pIC的貢獻(xiàn)分別為72.8%和27.2%，顯示取代基的立體作用2.6倍于靜電作用。立體場(chǎng)通常含有疏水作用和空間位阻，庫侖力、氫鍵及配位歸于靜電場(chǎng)。因此，影響pIC主要取決于取代基的疏水作用和空間位阻，其次是與靶標(biāo)形成庫侖力、氫鍵及配位作用。

3.3 分子設(shè)計(jì)

由3.2分析可知，在苯環(huán)的4-位上引入小體積的負(fù)電性基團(tuán)，能夠增加培氟沙星均三唑硫醚衍生物對(duì)小鼠白血病細(xì)胞(L1210)體外抗增殖活性pIC。據(jù)此設(shè)計(jì)3個(gè)化合物(見表1中第25～27號(hào)化合物)，CoMFA模型給出的pIC預(yù)測(cè)值為5.224～5.332，均優(yōu)于22號(hào)分子預(yù)測(cè)值(5.130)。

4 結(jié)論

(1)基于CoMFA建立培氟沙星均三唑硫醚衍生物對(duì)小鼠白血病細(xì)胞(L1210)體外抗增殖活性的3D-QSAR模型：Rcv2=0.659，R2=0.926，F(xiàn)=47.21，顯示優(yōu)良的魯棒性、擬合性和預(yù)測(cè)能力。

(2)CoMFA模型的立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)對(duì)pIC的貢獻(xiàn)分別為72.8%和27.2%，顯示立體作用近3倍于靜電作用。

(3) CoMFA模型三維等勢(shì)圖顯示在苯環(huán)的4-位上引入小體積的負(fù)電性基團(tuán)，使培氟沙星均三唑硫醚衍生物對(duì)小鼠白血病細(xì)胞(L1210)的體外抗增殖活性增強(qiáng)。據(jù)此設(shè)計(jì)的3個(gè)化合物，顯示較大的pIC預(yù)測(cè)值，有待生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。