羥基磷灰石基生物材料培養(yǎng)破骨細(xì)胞研究現(xiàn)狀

陳小波， 何 星

（上海理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093）

骨重建由激活、再吸收、逆轉(zhuǎn)、形成和終止5 個階段組成，此過程中成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）、OC、骨細(xì)胞（osteocyte）等基本的多細(xì)胞單元（basic multicellular unit，BMU）參與重建，另外巨噬細(xì)胞（macrophage，MP）、B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞也參與重建[1-2]。骨重建過程中OB 介導(dǎo)的骨形成過程和OC 介導(dǎo)的骨吸收過程緊密聯(lián)系，OB-OC 介導(dǎo)的再吸收-形成平衡系統(tǒng)是維持正常骨平衡過程的關(guān)鍵[2]。如圖1 所示。平衡系統(tǒng)中OB 分泌核因子κB 受體活化因子（RANKL）作為主要配體與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞（pre-osteoclasts，POC）的受體核因子κB 受體活化因子（RANK）結(jié)合，正向刺激POC 的分化及相應(yīng)骨吸收過程。來自O(shè)B、單核細(xì)胞以及T、B 淋巴細(xì)胞的骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG），可與RANK 競爭性結(jié)合RANKL 進(jìn)而抑制POC 的分化活性，抑制OC 吸收過程促進(jìn)骨吸收和骨形成[3]。RANKL/RANK/OPG 作為骨吸收過程中重要信號通路維持骨吸收平衡系統(tǒng)，OB-OC 過程因人體病變等因素干擾后，骨吸收-形成平衡過程即會失衡，從而造成骨質(zhì)疏松或骨質(zhì)增生等骨科疾病。

圖 1 骨重塑過程破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞相互作用[2]Fig.1 Interaction between osteoclasts and osteoblasts during bone remodeling[2]

OC 是骨修復(fù)過程中唯一多核巨細(xì)胞（內(nèi)含3-50 個緊密堆疊細(xì)胞核），主要來源于造血干細(xì)胞，也可由樹突狀細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化而來。OC 主要分布于骨質(zhì)表面、骨內(nèi)血管通道周圍等，重塑階段中負(fù)責(zé)脫鈣和骨基質(zhì)的吸收。如圖2 所示，參與骨吸收期間成熟OC 可劃分四種膜區(qū)：封閉區(qū)、皺褶邊緣區(qū)、基底外側(cè)區(qū)和功能性分泌區(qū)，皺褶的邊界進(jìn)一步劃分為外周融合區(qū)和中心區(qū)域，其中封閉區(qū)為環(huán)狀結(jié)構(gòu)。再吸收過程中密封區(qū)緊緊粘附在骨表面，褶皺緣細(xì)胞膜釋放H+、Cl-及多種蛋白水解酶（如組織蛋白酶K 和基質(zhì)金屬蛋白酶）等。OC 與骨表面間形成較高的酸性環(huán)境，骨中礦物質(zhì)經(jīng)OC 等骨吸收細(xì)胞溶解后溶解為Ca2+，等離子可被OC 吸收轉(zhuǎn)移。Ca2+為調(diào)節(jié)OC 分化、吸收重要信號，可被周圍OB 吸收利用實(shí)現(xiàn)骨形成即骨再吸收-骨形成循環(huán)系統(tǒng)。

圖 2 成熟OC 骨吸收反應(yīng)示意圖[2,4]Fig.2 Schematic diagram of bone resorption in mature osteoclasts[2,4]

如圖3 所示，骨主要由有機(jī)物、無機(jī)物及水3 部分組成，骨中70%左右為無機(jī)物-骨礦物質(zhì)，主要由HA（主要成分）、碳酸鈣、氟化鈣、氯化鈣及鋅等微量元素組成[5]。骨礦物質(zhì)中含有微量元素、碳酸鹽及硅等，骨礦物質(zhì)Ca/P 處于1.37～1.87 之間，HA、β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphat，β-TCP）、雙相磷酸鈣（biphase calcium phosphate，BCP）等與天然骨Ca/P 相近，具備優(yōu)異的生物相容性、骨誘導(dǎo)性、生物降解性、骨傳導(dǎo)性，因而廣泛應(yīng)用于生物骨修復(fù)材料。

圖 3 骨的主要成分[5]Fig.3 Main component of bone[5]

本文針對OC 與常用羥基磷灰石基磷酸鈣材料（HA-CaPs）體外試驗(yàn)研究結(jié)果，探討HA-CaPs 對POC增值分化及OC 吸收活性的影響，并總結(jié)HA-CaPs的體內(nèi)吸收降解機(jī)制和體內(nèi)Ca2+信號對OC 增殖分化吸收活性影響，從而為HA-CaPs 生物材料在骨修復(fù)中應(yīng)用和研究提供理論基礎(chǔ)。

1 羥基磷灰石基體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞分化和吸收活性

HA、β-TCP 和BCP 因其自身高穩(wěn)定性和較好的生物活性，相對于其他磷酸鈣材料較廣泛應(yīng)用于骨修復(fù)生物材料，現(xiàn)就3 種材料體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞研究作闡述與總結(jié)。

1.1 羥基磷灰石體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞活性

HA 作為骨無機(jī)物礦物質(zhì)主要物質(zhì)，是應(yīng)用最廣泛的骨再生生物材料之一?？衫貌煌噭ú煌}、磷源），利用不同合成方法諸如化學(xué)沉淀法、水熱法、固相研磨法、溶膠-凝膠法等制備和調(diào)控HA 的形貌、物化性能及結(jié)晶度等理化參數(shù)[6]。

Spence 等[7]利用酸堿中合法，設(shè)定Ca/P 為1.67，制備HA 前驅(qū)體，經(jīng)冷壓成型和高溫煅燒制備HA 陶瓷壓片，高溫消毒后培養(yǎng)人外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。利用細(xì)胞影像技術(shù)、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）及相關(guān)基因檢測技術(shù)觀察POC 分化和OC 吸收活性，試驗(yàn)結(jié)果表明HA 壓片材料組POC 分化活性較高并可大量觀察到成熟OC，壓片表面出現(xiàn)大量吸收陷窩，OC 吸收效應(yīng)明顯，說明HA 材料具有很好的促骨吸收效應(yīng)。Costa-Rodrigues等[8]利用HA 粉末經(jīng)冷壓成型和高溫煅燒技術(shù)制備陶瓷壓片，經(jīng)不同粗糙度SiC 砂紙組合成不同打磨工序獲得3 種不同表面粗糙度（Ra=0.582，0.187，0.043 μm）的壓片，經(jīng)高溫消毒處理后培養(yǎng)PBMCs，分化活性結(jié)果表明0.187 μm組支架培養(yǎng)OC 分化活性最高，說明支架一定的表面粗糙度有利于提高POC 分化活性；定量分析吸收陷窩總面積，粗糙度較高的壓片表面OC 吸收陷窩面積比光滑表面的高，說明具有一定粗糙度的陶瓷壓片有利于促進(jìn)OC 分化和吸收活性。

骨礦物質(zhì)中含有Si 等微量元素影響骨修復(fù)過程中OC 再吸收活性，Botelho 等[9]用適量Si(OH)4替代H3PO4與CaCO3反應(yīng)制備Si-HA，經(jīng)冷壓煅燒后制備陶瓷壓片培養(yǎng)PBMCs，分析發(fā)現(xiàn)1.5%Si-HA組細(xì)胞培養(yǎng)基中鈣和磷酸鹽最多，說明OC 吸收活性較高，因此，Si-HA 可被OC 吸收并且Si 促進(jìn)OC再吸收。Friederichs 等[10]研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)21 天后的OC 數(shù)量在HA、Si-HA（Si 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%）和Si-HA（Si 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%）上數(shù)量相當(dāng)，但Si-HA 上的肌動蛋白環(huán)封閉區(qū)形態(tài)與正常骨上的相似，在Si-HA（Si 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%）壓片表面觀察到OC 具有較大的尺寸，從而保證OC 具有更恒定的封閉區(qū)，進(jìn)而提高HA 溶解量，說明Si 在摻入HA 基骨水泥后可提高OC 吸收活性。

1.2 β-磷酸三鈣體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞活性

β-TCP 的Ca/P 為1.50，處于骨礦物質(zhì)的1.37～1.87 之間，也是一種常見骨修復(fù)材料。β-TCP 具有相對較高的溶解度，Mayr 等[11]比較HA/β-TCP 兩組材料培養(yǎng)POC，比較兩者降解速率并結(jié)合OC 分化再吸收試驗(yàn)結(jié)果表明，β-TCP 參與培養(yǎng)POC/OC 時，降解速度較快，導(dǎo)致Ca2+等離子濃度較高，相比HA、BCP 等材料而言抑制相關(guān)POC 分化和OC 吸收活性，如圖4 所示。添加微量元素可提高β-TCP 支架力學(xué)性能，Roy 等[12]采用β-TCP 粉末與高純度SrO和MgO 混合制備了3 種β-TCP 復(fù)合物：β-TCP，β-TCP/1.0%Mg（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），β-TCP/1.0%Sr（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。經(jīng)研磨冷壓成型后高溫煅燒制備光滑陶瓷圓片，培養(yǎng)RAW264.7 細(xì)胞，試驗(yàn)結(jié)果表明Mg 摻雜可能抑制RAW264.7 細(xì)胞分化活性，另有研究表明鋅摻雜β-TCP (Zn/0.25%)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），POC 分化活性相對會抑制但OC 吸收活性會相對增加[13]。

1.3 雙相磷酸鈣體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞活性

1.3.1 雙相磷酸鈣制備

雙相磷酸鈣（biphasic calcium phosphate，BCP）由HA 和β-TCP 2 種物相混合組成，可通過HA/β-TCP 比例物理復(fù)合，可精準(zhǔn)調(diào)控物相比。另可通過調(diào)節(jié)鈣、磷源的Ca/P 介于1.50～1.67 之間生成前驅(qū)體缺鈣磷灰石（calcium-deficient apatite，CDHA）高溫煅燒制備陶瓷支架[14]，制備過程中可通過改變反應(yīng)物Ca/P（1.50～1.67）調(diào)控CDHA 中x 值即BCP 中HA/β-TCP 物相比。反應(yīng)溶液pH 通過影響溶液離子決定產(chǎn)物主要物相β-TCP（pH～7）和BCP（pH≥9）；聶磊等[5]通過調(diào)控CDHA 煅燒溫度范圍650～1 300 ℃，利用X 射線衍射儀（X-Ray Diffraction, XRD）分析產(chǎn)物物相發(fā)溫度低于850 ℃時，β-TCP 的XRD 衍射峰較弱，溫度高于1 100 ℃則會出現(xiàn)α-TCP，考慮HA，β-TCP，α-TCP 三相相變溫度區(qū)間說明煅燒溫度對于BCP 物相影響較大。說明通過化學(xué)合成法制備BCP 要調(diào)控反應(yīng)物Ca/P（1.50～1.67），反應(yīng)溶液pH 保持在9～11 高堿性，煅燒溫度保持950～1 150 ℃為最佳制備條件[5]。目前關(guān)于BCP 支架制備方法多樣，針對不同制備方法有不同特點(diǎn)和不足，表1 詳細(xì)闡述各制備方法優(yōu)缺點(diǎn)。

圖 4 HA 和β-TCP 降解速度（上）和OC 吸收陷窩大小比較HA(下左)和β-TCP(下右)[11]Fig. 4 HA and β-TCP degradation rate (top) and OC absorption lacuna size comparison of HA (bottom left) and β-TCP (bottom right)[11]

表 1 BCP 支架制備工藝特點(diǎn)比較[5,16]Tab.1 Comparison of process characteristics of BCP scaffold[5,16]

1.3.2 雙相磷酸鈣體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞分化活性

Yamada 等[15]利用化學(xué)沉淀法制備不同Ca/P缺鈣磷灰石后調(diào)控煅燒溫度950 ℃高溫煅燒2 h后，制備4 種不同HA/β-TCP（100/0，75/25，25/75，0/100）BCP 后經(jīng)成型工藝制備厚度1 mm 陶瓷壓片進(jìn)行兔骨細(xì)胞體外培養(yǎng)。利用SEM 觀察比較細(xì)胞培養(yǎng)后壓片表面吸收陷窩的大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙相條件下細(xì)胞吸收活性高于任何一個單相的，相比β-TCP 組吸收活性相對最低，說明高溶解性Ca-P 陶瓷不利于OC 吸收，可能是材料在OC-基質(zhì)界面的微環(huán)境中產(chǎn)生了高濃度的Ca2+，從而抑制OC 等吸收活性。相對于化學(xué)合成的BCP，物理研磨混合可精確調(diào)控BCP 材料HA/β-TCP 比值，有利于觀察比較不同比例條件下對OC 等細(xì)胞分化吸收活性影響。Detsch等[16]利用噴霧干燥法制備HA、β-TCP 粉體后設(shè)定HA/β-TCP 為100/0，60/40，100/0 3 種比例制備漿料，利用3D 打印技術(shù)制備生坯支架后經(jīng)1 300 ℃高溫煅燒后制備成孔隙率體積分?jǐn)?shù)為52～56%的陶瓷支架，高溫消毒后培養(yǎng)小鼠RAW264.7 細(xì)胞，用細(xì)胞線粒體活性等基因檢測檢測OC 活性、SEM 觀察比較OC 形態(tài)及吸收陷窩形貌觀察。3 種材料對RAW264.7 細(xì)胞分化活性影響差別不大，但是，吸收陷窩孔隙尺寸比較結(jié)果說明BCP 材料相對提高OC 吸收活性。

1.3.3 雙相磷酸鈣體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞吸收活性

Schaefer 等[17]利用純HA/β-TCP 粉體后以HA/β-TCP 為100/0，60/40，100/0 3 種比例混合，分別利用單向壓制和聚氨酯復(fù)型技術(shù)制備2D，3D 生坯（孔徑密度為45 ppi）后1 300 ℃煅燒1 h 制備陶瓷支架經(jīng)高溫消毒后培養(yǎng)RAW264.7 細(xì)胞，觀察細(xì)胞分化吸收活性。研究發(fā)現(xiàn)2D 陶瓷壓片中BCP（60/40）有利于促進(jìn)RAW264.7 的破骨分化，HA 次之而β-TCP 則相對效果最差，相應(yīng)的OC 吸收活性BCP（60/40）組吸收陷窩尺寸較大較明顯說明OC 吸收活性較高，2D/3D同種材料細(xì)胞分化吸收試驗(yàn)結(jié)果表明2D 更有利于促進(jìn)細(xì)胞的分化和吸收活性。3D 的陶瓷支架較高的孔隙率加快BCP 材料自身降解速度，從而造成細(xì)胞周圍[Ca2+]等離子濃度較高影響細(xì)胞分化過程中信號通路進(jìn)而抑制細(xì)胞分化活性，弱化OC 吸收活性。Mayr 等[18]利用HA 和β-TCP 物質(zhì)混合研磨冷壓燒結(jié)制備HA/β-TCP 為100/0，80/20，60/40，40/60，20/80 和0/100，分析可得HA/β-TCP 為80/20，60/40兩種材料最有利于破骨前體細(xì)胞分化，因此，HA/β-TCP 比例為80/20 和60/40的BCP 被認(rèn)為是很有潛力的人工骨替代材料，對于OC 具有最佳的溶解和再吸收性能，如表2 所示。

表 2 HA/β-TCP 與OC 分化/吸收活性關(guān)系[17-18]Tab.2 Relationship between HA/β-TCP and OC differentiation/absorption activity[17-18]

表3 為HA，β-TCP 和BCP 體外培養(yǎng)OC 活性比較。HA、β-TCP 和BCP 3 種生物材料參與OC 培養(yǎng)過程和試驗(yàn)結(jié)果說明材料物相、支架形貌及粗糙度等對POC 分化及OC 吸收活性均有影響，POC 分化過程處于動態(tài)變化和不斷遷移過程并且細(xì)胞周圍Ca2+等離子均會影響OC 相關(guān)活性。生物體內(nèi)高度復(fù)雜的環(huán)境要求磷酸鈣生物材料必須能夠以適當(dāng)?shù)乃俣冉到?，以達(dá)到與新骨組織再生的平衡，同時為細(xì)胞生長和分化提供理想的場所。

表 3 HA，β-TCP 和BCP 體外培養(yǎng)OC 活性比較Tab.3 Comparison of OC activity in vitro cultured with HA, β-TCP and BCP

圖 5 HA-CaPs 生物體內(nèi)降解轉(zhuǎn)化與分化吸收相互作用示意圖[20]Fig. 5 Schematic diagram of the interaction of HA-CaPs in vivo degradation, transformation, differentiation and absorption[20]

2 破骨細(xì)胞對羥基磷灰石基生物材料的吸收作用

2.1 羥基磷灰石基生物材料體內(nèi)降解機(jī)制

圖5 為HA-CaPs 生物體內(nèi)降解轉(zhuǎn)化與分化吸收相互作用示意圖。HA-CaP 作為生物可降解材料參與OC 等骨吸收細(xì)胞進(jìn)行接觸后，材料自身可自然降解，降解產(chǎn)物主要有等組成。磷酸鈣的生物降解機(jī)制有2 種解釋：一種是將物質(zhì)分散成顆粒，植入的材料首先被分散成微小的顆?；蛩槠詈笏槠煌淌杉?xì)胞轉(zhuǎn)移；另一種是將物質(zhì)溶解成Ca2+和HPO42-離子然后被細(xì)胞吸收，進(jìn)行骨骼修復(fù)和重建形成新的骨骼[19]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，2 種降解溶蝕機(jī)制在參與細(xì)胞反應(yīng)中是同時發(fā)生的，Sheikh 等[20]將生物體內(nèi)植入材料的降解過程歸納為3 種反應(yīng)（物理、化學(xué)、生物反應(yīng)）和2 個階段（第1 階段：早期溶解；第2 階段：細(xì)胞介導(dǎo)吸收）。

HA-CaPs 因自身具有一定溶解度，植入體支架等材料首先會溶解，溶解過程中支架材料中結(jié)合較疏松處發(fā)生脫離等現(xiàn)象即出現(xiàn)小顆粒[21]。未成熟OC或巨噬細(xì)胞即會識別粒徑小于10 μm 粉體，細(xì)胞膜內(nèi)陷胞吞顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部經(jīng)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)溶解變?yōu)镃a2+，HPO42-等離子。對于較大的HA-CaPs 顆粒及支架材料細(xì)胞介導(dǎo)吸收即OC 吸收，成熟OC 經(jīng)識別和移動吸附后于HA-CaPs 表面之間形成封閉反應(yīng)環(huán)[22]。材料表面形成較高的酸性環(huán)境，多數(shù)HA-CaPs 穩(wěn)定存在的pH 范圍處于偏堿性范圍，在高強(qiáng)酸環(huán)境下極易發(fā)生溶解及溶蝕即會發(fā)生生物溶解過程[23]。

2.2 羥基磷灰石基生物材料性質(zhì)對破骨細(xì)胞分化、吸收活性的影響

HA-CaPs 經(jīng)相關(guān)細(xì)胞吸收溶解及自身物理降解后，對于細(xì)胞而言其生理環(huán)境周圍即出現(xiàn)Ca2+等離子。對于生物體而言Ca2+作為體內(nèi)第二信使，對于OC 的增值、分化及骨吸收過程均有較大的調(diào)控影響。OC 生長過程一般為巨噬細(xì)胞等POC 經(jīng)核因子κB 受體活化因子配體(RANKL)刺激后，單體細(xì)胞接觸融合而后形成多核OC。分化過程中已知RANKL 信號可誘導(dǎo)[Ca2+]振蕩變化，導(dǎo)致Ca2+/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶去磷酸化并且激活NFATc1，NFATc1移位至細(xì)胞核誘導(dǎo)OC 特異性基因轉(zhuǎn)錄使OC 得以分化。盡管少有遺傳學(xué)證據(jù)表明OC 分化需要[Ca2+]振蕩信號，但在幾乎所有沒有[Ca2+]振蕩的情況下，這一誘導(dǎo)分化過程都會受到損害[24]。這表明[Ca2+]振蕩對于NFATc1 誘導(dǎo)OC 形成至關(guān)重要。另研究表明，成熟OC 中[Ca2+]的變化可調(diào)控OC 的骨吸收活性，如細(xì)胞運(yùn)動、抑制酶的釋放、抑制核的形成[25]。

3 總 結(jié)

巨噬細(xì)胞在骨表面遷移融合形成多核OC，OC吸附于HA-CaPs 表面，經(jīng)物理降解和細(xì)胞化學(xué)溶解形成Ca2+等離子。相對OC 細(xì)胞而言，[Ca2+]作為重要生物信號反向調(diào)節(jié)OC 等相關(guān)細(xì)胞分化吸收活性，因此，HA-CaPs 研究重點(diǎn)即調(diào)控材料物相、陶瓷支架孔隙率（比表面積）等材料宏觀降解能力以期在參與細(xì)胞吸收過程中所產(chǎn)生的動態(tài)降解過程，符合OC 等骨吸收細(xì)胞所需的合適離子環(huán)境。良好生物活性HA-CaPs 植入或培養(yǎng)OC 過程中，其良好生物相容性以保證與OC 等細(xì)胞相互影響，構(gòu)成相對平衡穩(wěn)定的吸收-調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而保證骨修復(fù)系統(tǒng)的平衡與穩(wěn)定。隨著對離子、分子、藥物和生長因子功能化的HA-CaPs 的相關(guān)研究不斷增加，使得用于硬組織修復(fù)的HA-CaPs 生物材料的性能顯著提高。關(guān)于HA-CaPs 生物學(xué)特性及應(yīng)用的重要發(fā)現(xiàn)，對于在各種臨床應(yīng)用中尋找理想的骨替代物具有很高的價值。為了更好地理解HA-CaPs 及其植入骨缺損部位后的一系列反應(yīng)或生物學(xué)變化，需要作更多深入研究。