多重實時聚合酶鏈式反應熔解曲線法同步鑒別藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖

許隨根，李家鵬，李金春，陳 曦，楊君娜，熊蘇玥，黃 鑫，喬曉玲，曲 超，王守偉

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學研究院，國家肉類加工工程技術研究中心，肉類加工技術北京市重點實驗室，北京 100068）

近年來，隨著經濟發(fā)展，水產類食品越來越受消費者青睞，特別是營養(yǎng)價值較高的金槍魚和鱈魚的消費需求在不斷增長。同時，魚肉制品的摻假事件被多次報道，造成消費者的恐慌，摻假行為不僅威脅消費者的健康和造成經濟利益受損，還損害漁業(yè)及其國際貿易，而且也對監(jiān)管部門的執(zhí)法提出了更高技術要求[1]。魚肉產品摻假或稱為標簽錯誤標示是一個全球性的問題[2]，在亞洲、非洲[3]、歐洲[4]、南美洲[5]、大洋洲和北美洲[6-7]等地多國均有報道。銀鱈魚（裸蓋魚，Anoplopoma fimbria）含有大量的不飽和脂肪酸、多種必須氨基酸、多種維生素、鈣、鎂、硒等營養(yǎng)元素[8]，營養(yǎng)豐富，肉味甘美，易于消化，深受嬰幼兒喜愛，常作為輔食食用，市場上具有很高售價。關于裸蓋魚產品摻偽的報道很多，其中油魚（異鱗蛇鯖，Lepidocybium flavobrunneum）在摻偽魚類中最引起社會和消費者廣泛關注，因異鱗蛇鯖外形酷似裸蓋魚，但其肌肉及內臟富含蠟質油脂，多吃會導致腹瀉，嚴重危害消費者健康[9]。藍鰭金槍魚富含二十二碳六烯酸、二十碳五稀酸、酪胺酸、牛磺酸、核酸、鐵、鈣、鉀、多種必須氨基酸和VB12等營養(yǎng)成分[10]，營養(yǎng)價值極高，其肉質細嫩，口感滑膩，有“金槍魚之王”的雅稱[11]，由于每種金槍魚具有不同的品質和價格，藍鰭金槍魚在市場上稀缺，具有很高售價，造成不法商販以其他近似魚類以次充好售賣[12]。消費者在購買魚類產品時多基于魚鰭、魚須、體型、鰓耙數(shù)、脊骨數(shù)等外部形態(tài)特征判別魚種類，而裸蓋魚和金槍魚產品多以真空包裝的切塊、切片、腰肉或罐頭產品交易，因此監(jiān)管者和消費者不易通過形態(tài)特征判斷其所用的原料。針對這類摻假造假的判定，傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒別法已經不能滿足，必須基于更確切、精準的物種鑒別基礎上，因此，行業(yè)急需一種靈敏、特異的藍鰭金槍魚和裸蓋魚及其制品的物種鑒定方法。

現(xiàn)今鱈魚與金槍魚的鑒定標準方法國內僅有 SN/T 3589.6—2013《出口食品中常見魚類及其制品的鑒偽方法 第6部分：金槍魚成分檢測 實時熒光PCR法》和SN/T 3589.7—2013《出口食品中常見魚類及其制品的鑒偽方法 第7部分：鱈魚成分檢實時熒光PCR法》，金槍魚、鱈魚成分檢測實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）法，而藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖沒有快速的鑒定方法。目前，已經報道的有關金槍魚、異鱗蛇鯖、鱈魚的分子鑒定方法有多重PCR瓊脂糖電泳法[13-14]、多重PCR聯(lián)合酶聯(lián)吸附法[15]、核苷酸測序（forensically informative nucleotide sequencing，F(xiàn)INS）法[16]、DNA條形碼法[17-18]、PCR限制性片段長度多態(tài)性法（PCR restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）[19]和單物種熒光定量 PCR法[20-21]。多重PCR瓊脂糖電泳法靈敏度較低，近物種鑒定易出現(xiàn)假陽性，F(xiàn)INS和DNA條形碼法需要測序[22]，鑒定周期長，操作繁瑣；此外，DNA條形碼法還存在依賴參考的數(shù)據(jù)庫建設不夠完善、核內DNA條形碼[23]和混合物種樣品單一條形碼獲取困難等不確定因素[24]；多重PCR聯(lián)合酶聯(lián)吸附法操作繁瑣，成本較高；單物種PCR法檢測速度較快，但是檢測物種較少，每次只能檢測一個物種，而且目前建立的單物種特異性PCR多集中在大西洋鱈魚[25]、太平洋鱈魚[26]、細鱗壯鱈[27]等鱈形目鱈魚。開發(fā)滿足行業(yè)快速檢測藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的分子鑒定方法成為迫切需求。

本研究針對藍鰭金槍魚、裸蓋魚和異鱗蛇鯖的市場檢測需求，利用SYBR Green real-time PCR的熔解曲線法，開發(fā)同時檢測藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖3 個物種的多重real-time PCR檢測方法，以期實現(xiàn)多物種的快速檢測，同時降低檢測成本，能夠滿足多樣品的快速檢測需求，具有很好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

建立多重real-time PCR方法體系所用魚類和畜禽肉：4 種金槍魚、劍旗魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖由北京水產公司遠洋捕撈隊提供；燕鲅魚、鮐鲅魚、青魚、草魚、鳙魚、鰱魚各1 種，來源于北京岳各莊水產批發(fā)市場；豬肉采購于北京二商大紅門肉類食品有限公司；牛、綿羊、山羊肉來源于北京月盛齋清真食品有限公司；雞、鴨肉購于北京永輝超市。

1.1.2 試劑

動物組織基因組D N A 提取試劑盒 天根生物 （北京）技術有限公司；LightCycler?480 real-time PCR反應管、SYBR Green酶體系預混液 羅氏診斷產品（上海）有限公司；無水乙醇 北京化工集團；DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取試劑盒 凱杰企業(yè)管理 （上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

多樣品剪切均質勻漿儀 美國歐姆尼公司；ME104分析天平 梅特勒-托利多（北京）公司；Vortex-Genie2渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司；NanoDROP one超微量分光光度計 賽默飛世爾科技有限公司；RocheLight Cycler 480 PCR儀 羅氏診斷產品（上海）有限公司；T100TMThermal Cycler型PCR儀 美國伯樂公司；Eppendorf Centrifuge 5417R離心機 艾本德中國有限公司；Cascada BIO超純水系統(tǒng) 美國頗爾公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的處理及基因組DNA的提取

將魚去鱗片，畜禽肉去筋膜，取肌肉剪碎，準確稱取3 g肉，加水12 mL，調整均質儀10 000 r/min勻質10 min，取1.5 mL離心管吸取150 μL勻漿液于其中，8 000 r/min離心1 min，去上清液，然后按照試劑盒說明書操作提取DNA，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 目標物種的引物設計

在NCBI網(wǎng)站獲取6 種金槍魚、8 種鱈魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖、刺鱗蛇鯖等26 種魚類線粒體DNA序列，利用Mega 7.1軟件進行序列比對，選擇序列差異大的區(qū)域利用軟件Oligo 7.56設計特異性引物。設計的引物在NCBI網(wǎng)站通過BLAST程序進行擴增產物同源性及特異性比對，比較不同引物對擴增產物Tm值并選取擴增產物Tm值差異顯著的引物用于實驗。最終，藍鰭金槍魚的特異性引物設計在線粒體DNA的D-loop區(qū)，裸蓋魚的特異性引物設計在線粒體DNA的16S rRNA基因，異鱗蛇鯖的特異性引物設計在線粒體DNA的ND4L基因，所有引物由賽默飛世爾科技中國合成（表1）。

表1 目標物種的引物信息Table 1 Information about primers for target species used in this study

1.3.3 設計引物的特異性驗證

利用提取的各物種基因組DNA作為模板，進行real-time PCR擴增。采用10 μL的PCR體系，其中SYBR Green酶體系預混液5 μL，上下游引物（5 μmol/L）各1.0 μL，模板DNA 2 μL，加無菌重蒸水補足至10 μL。 real-time PCR程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸共計45 s，重復35 個循環(huán)；熔解峰圖制作：95 ℃變性1 min，降溫至70 ℃、1 min，之后均勻速率（0.02 ℃/s）升溫至95 ℃，并連續(xù)采集各溫度下的熒光值；然后，60 s內降溫至40 ℃。以溫度為橫坐標，熒光值對溫度的一階負導數(shù)為縱坐標，制作熔解峰值圖[28]。

1.3.4 多重real-time PCR體系建立

選取藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的特異性引物，首先優(yōu)化退火溫度、循環(huán)數(shù)等擴增條件，已往文獻報道多重PCR擴增過程中各引物對存在相互競爭的關系，引物濃度對多重real-time PCR能否擴增目標物種起重要作用，在多重PCR體系中調配合適的引物濃度能夠有效避免個別物種漏檢情況的發(fā)生[29]，據(jù)此設計系列不同濃度梯度的引物組合體系，根據(jù)各組合系統(tǒng)所產生的峰圖高度調整不同物種引物濃度，以出現(xiàn)平滑、基本等高且特異的峰值圖為標準，選定最優(yōu)組合體系。如表2所示，采用25 μL的PCR體系，其中SYBR Green酶體系預混液12.5 μL，上下游引物（5 μmol/L）各4.2 μL（上下游引物為藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖特異性引物按比例混合組成），模板DNA 2 μL，加無菌重蒸水補足至25 μL。real-time PCR程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火和延伸共計45 s，重復35 個循環(huán)；熔解峰圖制作：95 ℃變性1 min，降溫至70 ℃保持1 min，之后均勻速率（0.02 ℃/s）升溫至95 ℃，并連續(xù)采集各溫度下的熒光值；然后，60 s內降溫至40 ℃。以溫度為橫坐標，熒光值對溫度的一階負導數(shù)為縱坐標，制作熔解峰值圖。

表2 引物配比及各組分添加量（總體積25 μL）Table 2 Ingridents and formulation of PCR reaction system (total volume 25 μL)

1.3.5 多重real-time PCR檢測的靈敏度

將藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的DNA溶液梯度稀釋，分別配制5、0.5、0.05、0.005、0.000 5 ng/μL DNA溶液，開展靈敏度檢測；制備藍鰭金槍魚、裸蓋魚與異鱗蛇鯖的肉粉，按比例混合分別配制成含藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖成分50%、10%、5%、1%、0.5%、0.10%的混合肉樣，提取DNA開展相對檢出限靈敏度檢測。

1.3.6 多重real-time PCR體系實際應用效果驗證

采購金槍魚、鱈魚的鮮品切片、切塊以及罐頭制品，購置金槍魚鮮品13 份，裸蓋魚切塊9 份，烤鱈魚片8 份，金槍魚罐頭5 份，鱈魚類罐頭5 份。利用所建立的多重real-time PCR檢測方法測定其藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖成分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗重復3 次，每次做2 個平行。所有數(shù)據(jù)采用±s表示。

2 結果與分析

2.1 設計引物的特異性驗證

分別使用藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的特異性引物對藍鰭金槍魚、黃鰭金槍魚、馬蘇金槍魚、大目金槍魚、三文魚、黃魚、草魚、鰱魚、鳙魚、鯉魚、青魚、異鱗蛇鯖、燕鲅魚、鮐鲅魚、劍旗魚、豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨的DNA（5 ng/μL）進行 real-time PCR擴增，結果顯示3 對特異性引物只對各自陽性物種DNA產生特異性擴增，而對其他物種DNA無典型擴增曲線出現(xiàn)，表明藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的特異性引物具有很好特異性。將3 對引物混合后對22 個物種DNA進行多重real-time PCR檢測驗證，擴增結果見 圖1，檢測結果與單一引物檢測結果相同，表明3 對引物在多物種擴增中也具有很好的特異性，不同物種源性成分的Tm值相差顯著。擴增產物的GC含量和片段長度的差異是造成這種差異的主要因素，為利用多重real-time PCR熔解曲線分析法建立摻假檢測方法提供理論基礎。DNA的Tm大小與其均一性、GC含量及介質中的離子強度等因素有關，所以離子濃度固定的溶液中，短鏈DNA的Tm值受其濃度、片段長度和GC含量的影響[30]。而長片段DNA則在變性過程中主要發(fā)生局部解鏈，首先解鏈低GC含量的部分，通常40～100 bp被認定為一個熔解單元[31]。片段大小超過100 bp后，GC含量和溶液濃度是影響DNATm值的主要因素。另外，種內個體變異只會發(fā)生幾個堿基的突變，相應造成Tm值的變化也較?。ㄍ锓N內不同個體DNA的PCR擴增產物的Tm測定誤差范圍為0～0.3 ℃）。因此，基于熔解曲線分析法不需判定片段內堿基序列的變異，只考慮特異性引物是否設計在的種內保守區(qū)，相比PCR-RFLP、熒光探針法和DNA條形碼技術，本方法的優(yōu)點也在此處[32-34]。

多重real-time PCR方法檢測物種源性成分的能力與其反應重數(shù)密切相關。real-time PCR反應重數(shù)越多，各引物對的相互競爭就越激烈，real-time PCR體系的檢測能力越容易受到限制。目前，已報道的研究中real-time PCR重數(shù)在5 重及以下，因此，研究者為了利用盡量少的引物對同步檢測盡可能多的物種源性成分，往往將特異性引物設計在屬特異種保守的序列處，從而提高所開發(fā)方法的檢測靈敏度和通量，本實驗設計的異鱗蛇鯖引物采用此策略，使其能檢測異鱗蛇鯖和刺鱗蛇鯖。引物特異性驗證的結果見表3。

圖1 real-time PCR體系的特異性Fig. 1 Specificity of the established real-time PCR system

表3 引物特異性驗證結果Table 3 Statistical results of specificity verification of primers

2.2 多重real-time PCR特異性檢測結果

配制藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的混合肉樣（各物種源性成分含量比例相同，物種組合見表4）， 提取各樣品D N A，以提取的D N A 為模板進行多重 real-time PCR擴增，并分析熔解曲線，再次驗證所建多重real-time PCR體系的特異性，同時確定各物種成分熔解溫度（Tm）分布范圍。分析各樣品熔解曲線圖，結果如圖2、3所示，所檢樣品的熔解曲線峰位置、峰個數(shù)均與樣品的物種源性成分組成相對應，均沒有非特異性峰出現(xiàn)的現(xiàn)象，進一步表明建立的多重real-time PCR體系具有很好的特異性。3 次重復實驗并計算各物種源性成分的Tm值，計算結果見表4。實驗并統(tǒng)計不同引物濃度體系、不同模板濃度中3 種魚類的Tm值分布情況，由統(tǒng)計結果可知3 種魚類源性成分的熔解溫度分布段分別為藍鰭金槍魚源性成分Tm值（74.98±0.60）℃、裸蓋魚源性成分Tm值（78.65±0.71）℃、異鱗蛇鯖源性成分Tm值（82.38±0.25）℃，各物種源性成分的Tm值均有偏移，異鱗蛇鯖源性成分的Tm值漂移范圍最小，為0.5 ℃，裸蓋魚源性成分的Tm值漂移范圍最大，為1.42 ℃，整體看來各物種源性成分的Tm值偏移跨度較小，表明所建方法穩(wěn)定性較好；各物種源性成分Tm值范圍之間相互不交叉，因此，分析所檢測樣品熔解曲線，根據(jù)譜圖中溶解峰數(shù)和溫度范圍（即峰的位置）能準確判定所檢樣品中含有的物種。

表4 混合魚肉樣品中各魚類成分熔解溫度值Table 4 Melting temperature values of fish components in mixed fish samples

圖2 多重real-time PCR檢測各混合樣DNA的熔解曲線Fig. 2 Melting curves of DNA in mixed samples detected by multiplex real-time PCR

圖3 所建real-time PCR體系檢測3 種魚類混合DNA的熔解曲線Fig. 3 Melting curves of mixed DNA of three fishes detected by real-time PCR

2.3 多重real-time PCR檢測方法的靈敏度

以制備成5、0.5、0.05、0.005、0.000 5 ng/μL的藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的質量濃度梯度DNA樣品和3 魚類混合DNA溶液為模板，進行多重real-time PCR擴增及熔解曲線分析，測試多重real-time PCR的DNA濃度靈敏度；由圖4A可知，藍鰭金槍魚各質量濃度梯度樣品的Tm分別為（75.37±0）、（75.47±0.20）、（75.38±0.04）、（75.88±0.01）、（76.24±0.11）℃； 由圖4 B 可知，裸蓋魚各濃度梯度樣品的Tm分別為（78.45±0）、（78.47±0.01）、（78.64±0.01）、（79.20±0.08）、（79.27±0.01）℃；由圖4C可知，異鱗蛇鯖各濃度梯度樣品的Tm分別為（82.1±0.01）、（82.07±0.01）、（82.11±0.04）、（82.26±0.01）、（82.47±0.01）℃。三者的Tm值均在各自的溫度范分布圍內，由此可知采用本方法多重real-time PCR體系檢測單物種DNA，藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖成分的檢出限均為0.001 ng。由圖4D可知，采用本方法多重real-time PCR體系測定混合樣DNA溶液，10 ng混合DNA為模板，藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的Tm分別為（74.49±0.04）、（78.09±0.05）、82.23±0.02）℃， 1 ng混合DNA為模板，藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的Tm分別為（74.90±0.04）、（78.46±0.05）、（82.30±0.02）℃，0.1 ng混合DNA為模板，藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的Tm分別為（75.61±0.01）、（79.0±0.02）、（82.46±0.01）℃，三者的Tm值均在各自的溫度分布范圍內，可知本方法檢測多物種時，藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖源性成分的檢出限為0.1 ng。

以含藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖成分50%、10%、5%、1%、0.5%、0.10%的質量分數(shù)梯度混合樣品的DNA為模板，開展多重real-time PCR擴增，并分析熔解曲線，測試所建多重real-time PCR體系的相對檢出限，測試結果顯示采用所建多重real-time PCR體系檢測混合樣品DNA，藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖源性成分的檢出限分別為0.5%、1%、0.5%。

本研究開發(fā)的多重real-time PCR檢測方法的檢出限與周彤等[35]開發(fā)的多重real-time PCR檢出肉制品中動物源性的檢出限相當，均能做到多物種檢出限0.1 ng。已有 文獻[36]報道0.1 ng DNA的檢出限能充分滿足魚制品摻假檢測的需求。

圖4 所建多重real-time PCR的靈敏度檢測Fig. 4 Sensitivity evaluation of multiplex real-time PCR

2.4 多重real-time PCR體系實際應用效果驗證

為檢驗所建方法在實際樣品中的應用效果，并更進一步驗證所建多重real-time PCR的準確性。用本方法對采集的市售金槍魚切塊、裸蓋魚切塊、烤鱈魚片、鱈魚罐頭類、金槍魚罐頭類樣品進行檢測，結果表明，Tm值在（74.98±0.60）℃范圍內出現(xiàn)熔解峰（藍鰭金槍魚源性成分）的有4 份樣品；Tm值在（78.65±0.71）℃范圍內出現(xiàn)熔解峰（裸蓋魚源性成分）的有8 份樣品；Tm值在（82.38±0.25） ℃范圍內出現(xiàn)熔解峰（異鱗蛇鯖源性成分）的有6 份樣品；3 個Tm值范圍內均未出現(xiàn)熔解峰的樣品22 份。

表5 市場采購水產品的檢測結果Table 5 Results of detection of aduleration in commercial aquatic products

從樣品分類及結果的統(tǒng)計分析（表5）可以看出，金槍魚切塊、裸蓋魚切塊、烤鱈魚片、金槍魚罐頭、鱈魚罐頭中均存在標簽錯誤標識或者摻偽，錯誤標識或者摻偽率達22.5%，所有檢測樣品中烤鱈魚片的摻偽或者標簽錯誤標識率最高，高達37.5%。金槍魚切塊制品中有產品標識為白金槍魚切塊，而檢測結果顯示實際物種為異鱗蛇鯖；烤鱈魚片和罐頭類制品的摻假也多數(shù)采用鯰魚、異鱗蛇鯖等其他廉價或相似魚種冒充。以上結果證明所建方法在實際樣品檢驗中具有很好應用效果，該多重real-time PCR體系用于實際水產品的快速鑒別準確有效。

3 結 論

本研究針對藍鰭金槍魚、裸蓋魚和異鱗蛇鯖的市場檢測需求，基于3 種魚類的線粒體基因序列，利用SYBR Green real-time PCR的熔解曲線法開發(fā)了同時檢測藍鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖3 個物種的多重real-time PCR檢測方法。該方法實現(xiàn)了多物種的快速檢測，同時降低檢測成本，能夠滿足多樣品的快速檢測需求。所建的多重real-time PCR檢測方法具有很高靈敏度和很好的識別度，在實際水產樣品的檢測中也顯示了不錯的應用效果。所建方法能為監(jiān)管機構快速檢測水產類制品的物種提供技術支持，檢測結果準確可靠，可供執(zhí)法部門作為參考依據(jù)，同時提高市場監(jiān)管部門打擊水產制品摻假的效率，使其能夠有效加強水產品的監(jiān)管，保護消費者的健康，保證相關企業(yè)與消費者經濟不受損；此外，所建方法為漁業(yè)正確識別所捕撈魚類物種提供技術支持，從而改善目前金槍魚、鱈魚市場真實產品物種與標識物種不符的亂象，因此，所建方法會有很好的應用前景。