酒醅蒸餾過程中部分揮發(fā)性活性成分的變化

陳 璐，史冬梅，何宏魁，陸 瑋，韓興林,3，孫金沅,

（1.食品質量與安全北京實驗室，北京工商大學，北京 100048；2.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州 236000；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015）

白酒是中國的國酒，是世界六大蒸餾酒之一，以其獨特的香氣深受廣大消費者的喜愛。隨著人們對健康飲食要求的提高，白酒健康逐漸成為研究的焦點之一。中國白酒因原料和釀造工藝的獨特性含有較多對人體有益的活性成分，包括含量較高的醇類、酯類等，其在適宜濃度下也對健康有益[1]。除此之外酒中還有一些微量的 生物活性成分，其具有緩解酒精傷害、充分顯示人體防御功能、調節(jié)生理節(jié)奏、預防疾病促進康復等作用[2]。白酒中的活性成分可以分為揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分兩類，揮發(fā)性活性成分主要以萜烯類、酚類、吡嗪類和含硫化合物為主，非揮發(fā)性活性成分主要是氨基酸和生物活性肽等[1]。

前人已對白酒中的揮發(fā)性活性成分的功能進行了研究和梳理，有些已經被醫(yī)藥行業(yè)廣泛應用。范文來等[3]在董酒中發(fā)現(xiàn)了41 種揮發(fā)性萜烯類化合物；Wang Li等[4]在茅臺酒中發(fā)現(xiàn)了55 種萜烯類化合物。萜烯類化合物被證明具有抗菌能力[5]、抗病毒能力[6]、抗氧化力、止痛作用、消化活力[7]、防癌抗癌[8-9]等，許多中藥材中也含有大量的萜烯類化合物[10]。Fan Wenlai等[11-12]在五糧液和劍南春中檢測到了4 種酚類化合物，在洋河大曲中檢測到5 種酚類化合物；徐占成等[13]使用全二維-飛行氣相色譜-質譜聯(lián)用檢測儀在劍南春中發(fā)現(xiàn)了8 種酚類化合物。一部分酚類化合物也具有生物活性，如愈創(chuàng)木酚、苯酚、阿魏酸等。有實驗曾研究了酚酸類化合物對UMR106細胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)7 種酚酸類化合物可同時促進UMR106細胞的增殖與分化[14]。王雙[15]在劍南春酒中利用全二維氣相色譜-質譜聯(lián)用儀檢測到18 種吡嗪類化合物；Wu Jianfeng等[16]在茅臺中發(fā)現(xiàn)了8 種吡嗪類化合物。常在醬香型白酒中檢出的吡嗪類化合物是呈香物質同時也具有健康功效[1]，例如四甲基吡嗪廣泛用于心臟血管和腦血管疾病的治療，對中樞神經有影響[2]；2-甲基吡嗪具有抗氧化功能[17]。酒中的一些硫醇類化合物在臨床上常用某些含有巰基的化合物作重金屬的解毒劑[10]。這幾類化合物在原酒和商品酒中均有發(fā)現(xiàn)。

本實驗目的是研究酒醅在蒸餾過程餾分中部分揮發(fā)性活性成分的變化。蒸餾是由酒醅得到原酒的重要步驟，釀酒原料中的部分物質和酒醅中的微生物發(fā)酵產物在這一步驟中被提取富集，餾分大部分是乙醇和水，亦有大量呈香呈味等微量物質餾出。白酒蒸餾采用分層起窖，分段摘酒，不同層酒醅中微生物發(fā)酵產生的物質有不同，不同蒸餾階段原酒中各類活性成分也有一定差異。采集窖池底層酒醅蒸餾出的原酒為研究對象，探究其中萜烯類、酚類、吡嗪類等活性成分隨餾出時間的變化。旨在進一步認識酒醅在蒸餾過程中化學本質上的變化，也可對原酒的分級和后續(xù)的貯存勾調等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原酒樣品：底層酒醅蒸酒時除棄去的酒頭酒尾外每分鐘取一次樣，共33 個樣品，按1～33號排序命名。由安徽古井貢酒股份有限公司提供。

4-乙基愈創(chuàng)木酚、三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪（純度98%）、愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚、4-甲基苯酚（純度99%）、2,4-二叔丁基苯酚（純度99.5%）、2-乙基吡嗪（98%）、香蘭素（純度99%）（均為色譜純） 北京百靈威公司；亞油酸乙酯（純度97%）、β-石竹烯（純度90%） 東京化成工業(yè)株式會社公司；二甲基三硫（純度98%） 美國TCI公司；2-乙烷-3,5-二甲基吡嗪（純度99%） 上海麥克林生化科技有限公司；無水硫酸鈉（120 ℃烘箱中烘烤5 h）、氯化鈉、二氯甲烷（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5975A氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取纖維頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

DB-FFAP型毛細管柱（60 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為He，流速為1 mL/min；不分流模式，進樣量1 μL，平衡時間1 min，進樣口溫度250 ℃；柱子流速1 mL/min；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持0 min；以5 ℃/min升溫至90 ℃，恒溫0 min；再以1 ℃/min升溫至94 ℃，保持0.5 min；然后以3 ℃/min升溫至205 ℃，保持2 min；然后以5 ℃/min升溫至250 ℃，保持3 min。

1.3.2 質譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度250 ℃。定時質譜檢測器，在6.3 min狀態(tài)為關閉，7.8 min時打開。定性采用全掃描模式，質量掃描范圍45.00～350.00 u，駐留時間0.2 s。定量采用選擇離子掃描模式。

1.3.3 固相微萃取

通過單因素試驗對固相微萃取實驗條件進行優(yōu)化?？疾燧腿±w維種類（75 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS）、萃取溫度（30、40、50、60 ℃）和萃取時間（30、40、50、60 min）。

為進行優(yōu)化實驗，配制標準溶液所含化合物為二甲基三硫、β-石竹烯、香葉基丙酮、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、二苯并呋喃和亞油酸乙酯，均為酒樣中常見的揮發(fā)性活性成分。

優(yōu)化后實驗條件為50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭提取白酒中的揮發(fā)性成分。取2 mL酒樣加入7 mL飽和氯化鈉溶液，使所有酒樣乙醇體積分數稀釋到15%以下后，轉移至20 mL頂空瓶中，加蓋封口于50 ℃平衡15 min，萃取50 min，插入250 ℃氣相色譜進樣口，解吸5 min。

1.3.4 渦旋輔助液液微萃取

通過單因素試驗對渦旋輔助液液微萃取實驗條件進行優(yōu)化，考察渦旋時間（30 s、1 min、2 min）和離心時間（5、7、10 min）。優(yōu)化后實驗條件：取一定量模擬酒樣或酒樣于50 mL離心管中，加入50 μL質量濃度為100 mg/L的2-乙?；拎鹤鳛閮葮耍尤脒m量的超純水將酒樣乙醇體積分數稀釋到15%以下，加適量氯化鈉至過飽和，渦旋混合，加入2 mL二氯甲烷，渦旋萃取1 min，8 000 r/min離心5 min，收集下層有機相。重復3 次，合并萃取液氮吹至0.5 mL，進行氣相色譜-質譜分析。

1.4 數據處理

白酒微量成分的定量數據、標準曲線以及定量方法的檢出限、定量限、精確度和回收率等采用Microsoft Office Excel 2019進行計算；相關圖形采用Origin 8.5.1軟件繪制；主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析采用SPSS 19.0軟件分析。

2 結果與分析

2.1 固相微萃取法和渦旋輔助液液微萃取法對比

分別采用固相微萃取和渦旋輔助液液微萃取對1號酒樣進行分析，因主要關注酒醅蒸餾過程中部分健康活性成分的變化，故分析中只列出酚類、萜烯類、吡嗪類和呋喃類的具體檢出情況，對酯類、醇類、酸類、醛酮類和其他類的化合物作大致介紹。

通過固相微萃取并結合氣相色譜-質譜共檢測到87 種化合物，包括49 種酯類、5 種醇類、5 種酸類、8 種醛酮類、7 種酚類、4 種萜烯類、3 種呋喃類和6 種其他類化合物。通過渦旋輔助液液微萃取法結合氣相色譜-質譜共檢測到120 種化合物，包括39 種酯類、15 種醇類、11 種酸類、14 種醛酮類、9 種酚類、3 種萜烯類、7 種吡嗪類、13 種呋喃類以及9 種其他類化合物。渦旋輔助液液微萃取對酒中微量化合物的萃取數量和種類更多，選擇性更低。并且對于本實驗關注的酚類、萜烯類和吡嗪類的富集率更高。相較于其他常用的前處理方法如液液萃取、溶劑輔助蒸餾萃取、同時蒸餾萃取等，渦旋輔助液液微萃取需要的有機溶劑更少，操作更簡便。由此得出渦旋輔助液液微萃取更適合原酒中揮發(fā)性活性成分變化的研究。

2.2 酒醅蒸餾過程中揮發(fā)性活性成分的變化規(guī)律

蒸餾是白酒生產工藝中重要的環(huán)節(jié)之一，通過甑的傳熱與傳質可以將酒醅中的乙醇、水和微量成分富集到原酒中。白酒中的微量成分由于揮發(fā)性和水溶性的不同，導致其在蒸餾過程中的餾出時間不同。采用渦旋輔助液液微萃取對所采集的酒醅蒸餾過程中不同時間段餾分酒樣進行前處理，結合氣相色譜-質譜定量分析。探索在摘酒時間范圍內隨著蒸餾時間的延長，酒中部分揮發(fā)性活性成分的變化趨勢。

2.2.1 乙醇體積分數的變化

圖1 蒸餾過程中各餾分乙醇體積分數變化Fig. 1 Change in alcohol content in fermented grains during distillation

蒸酒過程是動態(tài)變化的過程，酒醅蒸餾出的原酒中占比最高的是乙醇和水，同時含量較少的揮發(fā)性活性成分、呈香物質等微生物發(fā)酵產物也由于不同的水溶性在不同的蒸餾時間被濃縮提取到原酒中，研究乙醇體積分數的變化可側面評價微量成分在蒸餾過程的變化規(guī)律。由圖1可知，餾出原酒的乙醇體積分數隨蒸餾時間的延長呈下降趨勢。酒樣中乙醇體積分數最大為70%，最小為45%。

2.2.2 蒸餾過程中活性揮發(fā)成分的含量變化

結合渦旋輔助液液微萃取對原酒的定性結果和文獻中前人對化合物活性的研究，實驗選取18 種化合物為目標化合物，分別為2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚、 4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、香蘭素、二甲基三硫、β-石竹烯、亞油酸乙酯和3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛。二甲基三硫是古井貢酒中重要的揮發(fā)性功能成分，二甲基三硫具有抗氧化、抑制血小板、降低血糖等作用[10]。β-石竹烯是從白酒中檢出的一種萜烯類化合物，具有抗病毒、抗炎癥等活性，還具有體外抗腫瘤細胞的活性[10]。亞油酸乙酯在人體內可水解產生高級脂肪酸亞油酸[18]，它不能由人體自身合成，是一種需要從食物中攝取的必需脂肪酸。亞油酸的代謝產物γ-亞油酸具有提高免疫力[19]、抑制癌細胞生長[20]、降血脂[21]、減肥[22]等功效。3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛是合成治療風濕性關節(jié)炎和骨關節(jié)炎的藥物Darbufelone[23-24]的重要原料。

測量實驗方法的回收率及檢出限和定量限，并繪制化合物的定量曲線，結果如表1所示。采用定量曲線計算不同摘酒時間餾分中揮發(fā)性活性成分的含量，結果如表2所示。

表1 渦旋輔助液液微萃取方法驗證及化合物定量曲線Table 1 Verification of VA-LLME and quantitative calibration curves of volatile bioactive compounds

圖2 第33分鐘餾分中部分揮發(fā)性活性成分Fig. 2 Contents of selected volatile bioactive ingredients in the distillation fraction at 33 minutes

表2 不同蒸餾時間餾分中揮發(fā)性活性成分的含量Table 2 Contents of volatile bioactive components in Baijiu at different distillation times

為了對目標化合物的含量進行大致比較，選取第33分鐘餾出的原酒數據進行分析。由圖2可知，所測酒樣中，亞油酸乙酯含量較高，在蒸餾過程中亞油酸乙酯在原酒中的質量濃度達到了2 820.27～8 009.90 μg/L， 它與棕櫚酸乙酯和油酸乙酯被稱為白酒中的三大高級脂肪酸。在蒸餾過程初期質量濃度最大，之后降到4 097.74 μg/L，從第6分鐘左右開始上下浮動但變化不明顯，第32～33分鐘時質量濃度下降到2 820.27 μg/L。亞油酸乙酯不溶于水，而溶于乙醇，故在蒸餾初段質量濃度偏高，最后質量濃度迅速下降可能是由于酒醅中的亞油酸乙酯前期已被大量蒸出。

圖3 8 種酚類化合物在不同蒸餾時間餾出原酒中的含量變化Fig. 3 Changes in concentrations of 8 phenolic compounds in fractions with distillation time

除亞油酸乙酯外，酚類化合物含量相較其他類化合物偏高。4-甲基苯酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚是原酒中主要的酚類，它們在底層酒醅中的質量濃度達到315.46～2 151.08、109.89～1 676.37 μg/L和63.21～986.85 μg/L。由圖3可知，8 種酚類化合物除 2,4-二叔丁基苯酚外的餾出規(guī)律相同，隨著蒸餾過程濃度逐漸上升，且上升速率相似，說明化合物的餾出規(guī)律與化合物的結構有很大的相關性。酚類化合物含有羥基，具有較強的親水性。由于蒸餾過程中乙醇體積分數不斷降低，含水量相對上升，因此酚類化合物隨著蒸餾時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢[25]。

2,4-二叔丁基苯酚與其他7 種酚類化合物的餾出規(guī)律不同，其含量在整個采樣時間中趨于穩(wěn)定，但在第20分鐘左右出現(xiàn)波動，可能與生產工藝有關。相對于目標化合物中的其他酚類物質，2,4-二叔丁基苯酚在支鏈上的2 個疏水基團叔丁基使它的親水性大大降低，平衡了酚羥基的親水性導致它在蒸餾過程中含量保持穩(wěn)定。

實驗共定量分析6 種吡嗪類化合物，分別為2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪。其含量相比餾分中其他種類化合物含量稍低。關注的吡嗪類化合物中含量最高的是三甲基吡嗪，質量濃度范圍為59.06～877.75 μg/L。由圖4可以看出，6 種吡嗪的餾出規(guī)律相同，都是隨蒸餾的進行餾分中的含量增加。吡嗪類化合物既能溶于水也可以溶于乙醇，它們的變化規(guī)律和疏水性關系不大。含量增加的主要的原因是蒸餾過程中發(fā)生美拉德反應的產物中含有吡嗪類化合物。蒸餾過程不僅是單純的富集過程，還有一些化學反應發(fā)生，在蒸餾時糖和氨基酸發(fā)生的美拉德反應就是其中之一[26]。美拉德反應會生成吡嗪類化合物[27]，導致蒸餾餾分中含量增加。葛向陽[28]與司冠儒[29]等也研究了吡嗪類在白酒蒸餾過程中的變化規(guī)律，結果均表明吡嗪類化合物在白酒蒸餾過程中呈上升趨勢。

圖4 吡嗪類化合物在不同蒸餾時間餾出原酒中的含量變化Fig. 4 Changes in contents of pyrazines in base Baiju at different distillation times

圖5 2 種其他化合物的餾出規(guī)律Fig. 5 Distillation patterns of two other compounds

由圖5可以看出，二甲基三硫含量總體隨著蒸餾時間的延長先增加后減少，但其在第19分鐘時含量突然降低，同時3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛的含量在第18分鐘增加約3 倍后又趨于穩(wěn)定。2 種化合物含量的變化可能是采集樣品時的錯誤或與生產工藝有關，還需要后續(xù)的研究。

2.2.3 數據分析

由表3 可知，前6 個P C 的累計貢獻率能夠達到98.173%，前2 個PC的累計貢獻率已經達到83.492%，足以說明隨著蒸餾時間的延長化合物含量的變化。對PC1貢獻較大的化合物為三甲基吡嗪、4-甲基苯酚、四甲基吡嗪、香蘭素、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪；對PC2貢獻較大的化合物為亞油酸乙酯和3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛。

表3 PC的特征值和貢獻率Table 3 Characteristic values and contribution rates to total variance of PC

圖6 18 種化合物的載荷圖（A）和33 個樣品的PCA圖（B）Fig. 6 Loading plot of 18 compounds (A) and PCA of 33 samples (B)

使用數據分析軟件對實驗數據進行降維處理。由 圖6A可以看出，18 個化合物中只有β-石竹烯在第3象限；3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛、2,4-二叔丁基苯酚和亞油酸乙酯在第2象限，可以看出2,4-二叔丁基苯酚和其他研究的酚類餾出規(guī)律不同，且因為2 個叔丁基的存在使它和3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛的餾出規(guī)律更為相近；其他吡嗪類、酚類化合物和二甲基三硫在第4象限，但二甲基三硫和其他化合物相距較遠，二者的餾出規(guī)律也并不相同。吡嗪類和酚類在圖6B中較為緊湊，它們的餾出規(guī)律也較為相似。PCA驗證了前文分析結果的準確性，能更加直觀說明活性成分的餾出規(guī)律和它的結構密不可分。 從圖6B可以看出，1～5號樣品受PC2的影響較大，5～32號樣品受PC1的影響較大，32號樣品與33號樣品受PC2的影響較大。隨著蒸餾時間的延長，相鄰樣品間存在著規(guī)律性變化，相鄰餾出時間的樣品在圖6B中也相近。

如圖7所示，整體上看，33 種酒樣可以分為兩大類，從第23分鐘分開，除酒頭酒尾外的接酒中段可以分為前段、后段兩部分。而前段又從第17分鐘分為2 類，1～16 min為1 類，17～22 min為第2類。后段大致從第29分鐘分開，23～28 min為1 類，29～33 min為1 類，但第26分鐘所接酒樣屬于后一類。這樣酒樣被細分為4 類，大致符合接酒時間規(guī)律?？梢钥闯?3 種酒樣隨著蒸餾時間的變化酒體也發(fā)生了細微的變化，但綜合33 種酒樣PCA的結果，此變化不足以將酒樣進行等級上的劃分，但可以為分段摘酒作參考。

圖7 33 個酒樣的聚類分析Fig. 7 Cluster analysis dendrogram of 33 Baijiu samples

3 結 論

分別使用固相微萃取和渦旋輔助液液微萃取對蒸出原酒進行定性分析，固相微萃取定性出87 種化合物，其中包括7 種酚類和4 種萜烯類化合物；渦旋輔助液液微萃取定性出120 種化合物，包括9 種酚類、3 種萜烯類和7 種吡嗪類化合物。可知渦旋輔助液液微萃取相對于固相微萃取更適合分析酒醅蒸餾餾分中的揮發(fā)性活性成分。

在后續(xù)實驗中定量分析了在目標蒸餾時間33 min內每分鐘餾出原酒中的18 種揮發(fā)性活性化合物：2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、愈創(chuàng)木酚、 4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、香蘭素、二甲基三硫、β-石竹烯、亞油酸乙酯和3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛。使用渦旋輔助液液微萃取檢測到的揮發(fā)性活性成分中，吡嗪類和大部分酚類在不同餾分中的含量會隨著蒸餾時間的延長而增加，亞油酸乙酯的含量隨蒸餾時間延長呈下降趨勢，二甲基三硫和3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛含量在蒸餾過程中的變化趨勢不明顯。

實驗結果證明活性成分的餾出規(guī)律與揮發(fā)性和疏水性有關，不同化合物結構導致不同的餾出規(guī)律，吡嗪類化合物還可能在蒸餾過程中作為美拉德反應的產物生成。通過研究酒醅蒸酒過程中部分揮發(fā)性活性成分的餾出規(guī)律，加深了對揮發(fā)性活性成分的研究，發(fā)現(xiàn)了它們在蒸餾過程的餾出規(guī)律，可以對白酒生產企業(yè)的蒸餾和勾調過程進行指導，有利于強化白酒中的活性成分。