MUS81-EME1維持基因穩(wěn)定性作用研究進展

賀鴻桂，徐祖敏

廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，廣東湛江524000

DNA是生物遺傳信息的主要載體，因此保持DNA的完整性和穩(wěn)定性對細胞的延續(xù)及發(fā)揮正常生理功能具有非常重要的意義?；蚪MDNA面臨各種各樣的損傷，這些損傷如不能及時、正確修復，可能導致基因組不穩(wěn)定甚至腫瘤的發(fā)生。為了維持基因組的穩(wěn)定性，生物在進化過程中逐步建立起完整而精密的損傷應答系統(tǒng)。結構特異性核酸內切酶在DNA復制、修復、重組中發(fā)揮了重要的作用，MUS81-EME1是結構特異性核酸內切酶之一[1]。在哺乳動物細胞中MUS81與EME1形成異源二聚體MUS81-EME1。MUS81和EME1屬于XPF內切酶家族，包含ERCC4核酸酶結構域和串聯(lián)螺旋-發(fā)夾-螺旋(HhH)2結構域。MUS81中的ERCC4核酸酶結構域具有催化活性，EME1缺少發(fā)揮催化活性的關鍵氨基酸，因此被認為是一個調節(jié)亞基[2,3]。MUS81-EME1復合物被證明可以裂解多個支鏈DNA底物，如DNA 3′游離末端、復制叉和帶切口的霍利迪連接(HJ)。相關研究表明，MUS81-EME1與其他核酸內切酶(如SLX1-SLX4和XPF-ERCC1)形成多聚體從而增強其作為分解酶的活性[4]。MUS81-EME1的活性以細胞周期依賴的方式受到嚴格的調控。人類MUS81-EME1中EME1可被細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK1)和PLK1磷酸化修飾，這種修飾能增強其拆解HJ的能力[5]。基于MUS81-EME1上述生物學功能特點，其在同源重組修復、鏈間交聯(lián)(ICL)修復、促進染色體脆弱位點(CFS)表達中發(fā)揮了重要的作用，還能作用于癌基因激活后復制應激中出現(xiàn)的反向復制叉，起到了潛在致癌作用。現(xiàn)就MUS81-EME1維持基因穩(wěn)定性作用的研究進展綜述如下。

1 MUS81-EME1在同源重組修復中的作用

DNA復制需要親本DNA雙鏈被解螺旋酶解旋，形成了稱為復制叉的分支DNA結構，再以每條親代DNA單鏈為模板進行DNA的復制。DNA在復制過程中遇到許多障礙，阻礙復制叉進程。復制叉的恢復高度依賴于同源重組，并且常涉及姐妹染色單體之間的相互作用，形成分支DNA中間體，特別是HJ[6]。HJ是姐妹染色單體之間形成共價連接的四鏈DNA連接，既往研究表明其主要來源于雙鏈斷裂的同源重組修復[7]。因此，盡管HJ的產(chǎn)生有助于DNA高效修復，但它會干擾正常的染色體分離，此類重組中間體必須在有絲分裂前被清除，以使DNA在子細胞中均勻分布。一個未經(jīng)處理的HJ可能導致染色體不分離和非整倍體，這與惡性腫瘤的發(fā)生有關。相關研究發(fā)現(xiàn)了兩種不同的HJ處理機制，即溶解和分解。溶解拓撲異構酶，產(chǎn)生非交叉產(chǎn)物產(chǎn)品；分解反應由高度特化的核酸酶催化，分解HJ產(chǎn)生交叉和非交叉產(chǎn)物[8～11]。

人體細胞中涉及HJ分解的核酸酶為MUS81-EME1、SLX1-SLX4、GEN1，這些酶是保證染色體分離、維持基因組穩(wěn)定性及細胞活力所必需的。在這些核酸酶中，MUS81-EME1是切割HJ的主要核酸酶[4, 12]。研究顯示，MUS81-EME1在體外不能有效地裂解完整的HJ，但MUS81-EME1可與另一種結構選擇性內切酶SLX1-SLX4在細胞G2/M期相互作用形成SLX-MUS全酶，增強了其對HJ的裂解能力[8,11]。最新研究發(fā)現(xiàn)，MUS81-EME1、SLX1-SLX4和XPF-ERCC1形成全酶復合體(SMX)，比三種核酸酶單體能更有效地解決復制和重組中間產(chǎn)物。在SMX中，在XPF-ERCC1刺激下，SLX4-SLX1和MUS81-EME1配合，用于HJ裂解；SMX通過松弛底物特異性激活MUS81-EME1，使復制叉和皮瓣結構發(fā)生裂解；激活涉及MUS81的保守的N端HhH區(qū)，介導切口位置選擇和SLX4結合。XPF-ERCC1對HJ的分解不是必需的，其可能促進了SMX內部的結構轉變，從而促進了催化的最佳底物結合，但它在復合物中的確切作用需要進一步研究[4]。

MUS81-EME1對HJ的作用受細胞檢查點的調控。MUS81-EME1中EME1在G2/M期同時被CDKs和PLK1修飾，EME1被磷酸化，這種修飾能增強其處理HJ的能力[5]。CDK1的活性在有絲分裂開始時達到峰值，它觸發(fā)了MUS81-EME1與二級結構選擇性內切酶SLX1-SLX4的細胞周期特異性結合，形成SLX-MUS全酶[8,10,11]。最新研究發(fā)現(xiàn)，人類細胞中MUS81-EME1復合物的生物學功能受到CK2的正向調節(jié)，CK2可磷酸化MUS81亞基中的絲氨酸87(S87)；該研究證實，人類的MUS81-EME1復合物在G2期末和有絲分裂早期變得活躍，在S期表達非常低或檢測不到，MUS81復合體需要在正常復制期間失活，說明MUS81-EME1的活性受細胞周期蛋白和復制檢查點的調控[13]。

上述研究表明，未被處理而積蓄的HJ會阻礙染色體分離并危及細胞的生存能力，MUS81-EME1可分解同源重組產(chǎn)生的中間產(chǎn)物HJ，促進DNA的修復及染色體的正確分離，進而維持基因組的穩(wěn)定性。

2 MUS81-EME1對CFS的作用

基因組的特定區(qū)域如普通型CFS在S期難以復制，這些位點招募DNA損傷反應蛋白形成核灶，在中期染色體中形成可見縫隙或斷裂的傾向。在大多數(shù)個體中，常見的CFS形成斷裂或缺口(通常稱為CFS表達)，這些位點中有200多個已在人類基因組中被識別[14]。雖然CFS表達并不是由任何單一原因引起的，但它們的不穩(wěn)定性可能是由于復制叉停止、晚期DNA復制中間體的積累、重復的DNA序列、缺乏復制起點或復制與轉錄機制之間的沖突等原因造成的。CFS在細胞周期的S期后期復制，在輕度復制應激條件下甚至可能更晚。CFS的不穩(wěn)定性在某些惡性腫瘤的發(fā)病中起著重要作用，因為在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)生的許多染色體易位和重排都起源于CFS[15,16]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個抑癌基因位于CFS區(qū)域，在惡性腫瘤中經(jīng)常被刪除，提示CFS表達(即其在中期的明顯斷裂)可能是腫瘤發(fā)生的驅動因素[17]。許多CFS可能在細胞進入有絲分裂前不能完全復制，這將阻礙姐妹染色單體在有絲分裂中的忠實分離，并對基因組的穩(wěn)定性構成重大威脅。MUS81-EME1和XPF-ERCC1等結構特異性核酸酶在復制后期中間產(chǎn)物上的核溶解切口被認為用于姐妹染色單體分離[18,19]。MUS81-EME1在有絲分裂早期定位于CFS，切割DNA鏈，解決復制中間產(chǎn)物及防止后期橋的形成；當MUS81-EME1缺失時，染色體-大橋、微核、超細后期DNA橋的數(shù)量都會增加，提示CFS位點的分裂失敗將導致姐妹染色單體分離的失敗。雖然在不完全復制的CFS區(qū)域的復制中間產(chǎn)物裂解足以使染色單體分離，但這些染色單體仍處于不完全復制狀態(tài)。MUS81-EME1在有絲分裂早期對CFS的裂解促進了CFS區(qū)域的有絲分裂DNA合成(MiDAS)，這是表達CFS所必需的[20]。CFS的表達來自于MiDAS位點染色質的去中心化，而不是DNA斷裂。目前認為，以依賴于MUS81-EME1的方式發(fā)生的CFS斷裂或縫隙有助于促進該區(qū)域的穩(wěn)定性。

3 MUS81-EME1對ICL修復的作用

ICL是一種高毒性的DNA損傷，為共價連接DNA雙鏈[21]。ICL誘導劑是腫瘤治療中常用的藥物，包括絲裂霉素C、氮芥、順鉑等。然而，這些藥物的療效被腫瘤細胞產(chǎn)生的耐藥性所限制。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞對不同ICL誘導劑的交叉抗性可能在接觸一種誘導劑后產(chǎn)生，這表明腫瘤細胞具有ICL修復機制，并提示該機制在耐藥細胞中增強。早期的哺乳動物細胞實驗表明，哺乳動物對順鉑、絲鏈霉素等鏈間交聯(lián)劑很敏感，而產(chǎn)生ICL誘導的雙鏈斷裂(DSB)需要MUS81-EME1，提示MUS81-EME1在ICL修復起到了切開切口的作用[21]。隨后有研究表明，MUS81-EME1突變細胞對ICL敏感，但不及XPF-ERCC1突變敏感[22,23]，這說明MUS81-EME1在ICL修復中起次要作用。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)SLX4與XPF-ERCC1和SLX1的結合形成的XPF-ERCC1-SLX4-SLX1復合體在ICL修復中的作用至關重要，這可能是通過將XPF-ERCC1-SLX4-SLX1復合體引入損傷位點來實現(xiàn)的[8]。而MUS81與SLX4的相互作用對于ICL的修復并不是必需的，即MUS81只用于特殊情況，也就是當ICL的3′端包含一個真正的3′ flap結構時。目前認為MUS81-EME1對ICL的修復確實起到了作用，但其作用只是眾多機制的一部分。

4 MUS81-EME1對DNA復制中間體的作用

復制叉在復制過程遇到DNA損傷時會引起復制叉的停滯或阻滯，復制叉的停滯和阻滯可導致不積極參與DNA合成的復制中間體(RIs)的積累。早期有學者用復制抑制劑HU和APT處理小鼠，發(fā)現(xiàn)MUS81響應了復制抑制劑誘導的復制叉停滯，參與了雙鏈DNA斷裂的形成，并且可重新啟動復制叉；在低劑量暴露于這些復制抑制劑的情況下，缺乏MUS81的細胞活力降低[24]。該研究表明MUS81-EME1可以處理這些停滯的復制叉，并可促進隨后的DNA復制，從而促進細胞的存活。在乳腺癌相關蛋白2(BRCA2)缺陷型細胞中，復制叉重新啟動需要部分切除，退化的復制叉要依賴于MUS81的切割[25]。該觀點與后來的斷裂誘導復制有著一致性，即在斷裂誘導復制修復途徑中，將阻滯的復制叉轉化為短暫的DNA雙鏈斷裂，后者隨后作為依賴于同源重組的復制沿斷裂誘導復制途徑重新啟動的底物[26]。在遭受各種內源性和外源性復制應激的人類細胞中，MUS81-EME1始終可以促進染色體斷裂、復制重新啟動及提高細胞生存能力[27,28]。

5 MUS81-EME1在癌基因誘導的復制應激中的作用

DNA復制應激被用于廣泛定義DNA復制障礙，包括DNA復制叉的停滯和崩潰。癌基因激活可引起復制應激，這是腫瘤細胞的共同特征。復制叉反轉是對復制停滯的一種響應，最初被認為是病理性的，其實對停滯的復制叉可起到保護作用。一項研究顯示，在癌基因激活后引起的復制應激中，反向復制叉是最常見的非典型復制中間體[29]。反向復制叉的定義是將一個典型的復制叉(三向連接)通過兩個新合成鏈的協(xié)調退火和模板鏈的再退火轉變?yōu)樯深愃艸J的四鏈DNA復制中間體。該研究采用電子顯微鏡觀察致癌基因細胞周期蛋白E(CycE)和CDC25A過表達后誘導的反向叉，發(fā)現(xiàn)在敲除MUS81后反向叉水平升高更明顯，提示反向復制叉可能被MUS81-EME1轉化成為DSB，作為復制染色體斷裂的前體。而MUS81在CycE過表達時引起的斷裂能增強細胞的存活能力；CDC25A過表達時，細胞則大量死亡。CycE過表達與CDC25A過表達不同之處在于細胞周期檢查點是正常的，這表明，在細胞周期檢查點正常的情況下，刻意的復制叉切割可以幫助細胞克服內源性復制應激。由此推測，癌前病變的細胞對結構特異性核酸酶如MUS81-EME1具有更高的依賴性，這為以MUS81-EME1為靶點的腫瘤治療提供了可能。有學者就WAN蛋白對復制應激的影響進行研究，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)歷了癌基因誘導的復制應激細胞中形成的DSB也是依賴于MUS81。實驗中顯示，無論是野生型細胞還是WRN敲除的細胞，在CycE過表達后，MUS81下調會抑制染色單體破壞，這一發(fā)現(xiàn)可能表明，由癌基因導致的復制應激引起的染色體損傷來自于MUS81對受干擾復制叉的不定期處理[30]。另有研究顯示，F(xiàn)BH1和MUS81-EME1介導的DNA DSB在長時間的復制應激后會觸發(fā)檢查點信號高表達和p53信號通路激活，誘導細胞凋亡，雖不能促進細胞的恢復，但可能幫助清除高水平復制應激的細胞，抑制病理遺傳變化的產(chǎn)物[31]。有研究報告，RAD51過表達的腫瘤細胞中有頻繁的復制叉停滯或反轉。上調的RAD51 RNA與編碼兩個已知HJ去除蛋白(EME1和GEN1)RNA表達之間存在很強的相關性。數(shù)據(jù)表明，表達增加的EME1可能有助于清除反向復制HJ，即EME1對腫瘤細胞中反轉復制叉的處理實際上促進了腫瘤細胞的DNA復制，起到了潛在致癌作用[7]。上述這些關于癌基因誘導的復制應激的研究表明，MUS81-EME1能作用于癌基因激活后復制應激下的反向復制叉，或是腫瘤細胞中的反向復制叉，并且促進反向復制叉的斷裂，形成DSB。MUS81-EME1對反向復制叉作用的程度與細胞復制檢查點和周期蛋白的調控密切相關。

綜上所述，MUS81-EME1能有效去除復制和重組中間產(chǎn)物，其高效分解對染色體分離至關重要。依賴于MUS81-EME1發(fā)生的CFS斷裂或縫隙可以很好地促進這些區(qū)域的穩(wěn)定性，在ICL修復中也有一定的作用。因此，MUS81-EME1是維持基因組穩(wěn)定性所必需的。MUS81-EME1功能的缺失或突變會引起相關疾病，且與腫瘤易感性密切相關。有研究發(fā)現(xiàn)中國南方女性EME1 Thr變異可增加患乳腺癌的風險和促進乳腺癌早發(fā)[32]。此外，MUS81-EME1還參與了DNA損傷修復過程，其功能的變化可能影響腫瘤細胞的放化療敏感性。有學者在人結腸癌細胞系HCT116中發(fā)現(xiàn)，人類細胞中EME1對DNA交聯(lián)劑引起的損傷有抵抗作用，原因可能是DNA交聯(lián)劑可造成復制叉停滯，而MUS81-EME1能修復和重新啟動停滯的復制叉從而出現(xiàn)對DNA交聯(lián)劑的耐受[33]。近些年癌基因誘導的復制應激相關研究提示，在癌前病變的細胞中，MUS81-EME1能修復損傷的DNA、促進細胞存活，或幫助清除高水平復制應激的細胞、抑制病理遺傳變化，在長遠上促進了基因組的穩(wěn)定及抑制細胞癌變[29，31]?？傊?，大量研究證實了MUS81-EME1在同源重組修復、ICL修復、促進CFS區(qū)域穩(wěn)定性方面的生物學功能，未來還需進一步探討和研究MUS81-EME1在惡性腫瘤中的具體作用機制、對腫瘤發(fā)展及預后的影響，MUS81-EME1在腫瘤治療中的探索也有望進一步展開。