耶氏肺孢子菌不同病原學(xué)染色形態(tài)特征在PJP診斷中的效果評價*

薛 婷，王淑峰，杜偉勤，盧 鴻，張新日△

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院：1.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；2.檢驗科，山西太原 030001；3.山西省呂梁市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，山西呂梁 033000

肺孢子菌是一種機會致病性真菌，具有顯著的宿主特異性，感染人的肺孢子菌是耶氏肺孢子菌(P.jirovecii)，可引起嚴重且致命的肺孢子菌肺炎(PJP)[1]。近年來，隨著高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的開展與應(yīng)用，人類免疫缺陷病毒(HIV)感染人群中PJP的發(fā)病率明顯下降，但非HIV感染人群，如器官移植受者、進行放化療的惡性腫瘤和自身免疫性疾病患者的PJP發(fā)病率逐年增高[2-4]，且P.jirovecii定植的現(xiàn)象在呼吸系統(tǒng)疾病患者中非常普遍。P.jirovecii缺乏有效的體外培養(yǎng)體系是阻礙其致病性、病原學(xué)及流行病學(xué)研究進展的主要原因。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，諸如巢式PCR、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴展技術(shù)等檢測P.jirovecii基因的方法日漸增多[5-8]，但均無法區(qū)分P.jirovecii定植和感染狀態(tài)，而病原學(xué)染色方法仍是確診PJP的“金標準”。因此，本研究通過比較P.jirovecii不同病原學(xué)染色的形態(tài)特征，分析其在PJP診斷中的價值，期望為PJP的早期診斷提供有效的病原學(xué)檢測方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者，男，51歲，咳嗽、咳痰，伴氣短、胸悶加重，于2019年11月27日入住山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科。實驗室檢測指標：二氧化碳分壓30.5 mm Hg，氧分壓60.8 mm Hg，淋巴細胞百分比7.5%，淋巴細胞絕對值0.5×109/L，紅細胞沉降率(ESR)65 mm/h,乳酸脫氫酶(LDH)699 U/L，CD4+T細胞計數(shù)1 mm39個，CD4+T細胞/CD8+T細胞0.03，超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)129.17 mg/L，白細胞介素-6 81.57 pg/mL，降鈣素原(PCT)0.161 ng/mL，HIV-1抗體陽性。胸部X線片可見雙肺紋理增多，局部紋理紊亂、模糊，兩側(cè)胸壁下可見條索狀密度增高影。肺部CT可見雙肺透亮度減低，小葉間隔增厚影及磨玻璃密度影，雙肺下葉可見多發(fā)斑片狀密度影，左肺下葉外基底段實性小結(jié)節(jié)影。行纖維支氣管鏡檢查，收集肺泡灌洗液(BALF)送檢，真菌熒光染色鏡檢可見P.jirovecii包囊。結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、實驗室檢查及影像學(xué)表現(xiàn)，考慮為PJP。本研究通過山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(2019-K051)，患者簽署知情同意書。

1.2主要試劑 快速革蘭染色液(BA4012，珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，抗酸染色液(BA4091，珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，Wright-Giemsa染色液(BA4017，珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，真菌熒光染色液(19091901，青島市三凱醫(yī)學(xué)科技有限公司)，六次甲基四胺、四硼酸鈉(遼寧永強醫(yī)藥器械化玻有限公司試劑廠)，氯化金[A602526，生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3涂片制備 收集該患者BALF，取500 μL經(jīng)涂片離心機離心后，制成涂片。以臨床分離培養(yǎng)鑒定的近平滑假絲酵母菌(C.parapsilosis)作為對照，無菌接種環(huán)取血培養(yǎng)皿上的C.parapsilosis菌落配置成菌懸液，制成涂片。

1.4染色方法

1.4.1革蘭染色 涂片自然干燥，染色前用酒精燈外焰加熱固定。革蘭染色步驟嚴格按說明書進行：(1)龍膽紫液染色10 s，水洗，甩干；(2)碘溶液染色10 s，水洗，甩干；(3)脫色液脫色10～20 s，水洗，甩干；(4)沙黃溶液復(fù)染10 s，水洗，自然干燥后油鏡鏡檢。

1.4.2抗酸染色 涂片干燥、固定?？顾崛旧襟E嚴格按說明書進行：(1)石碳酸復(fù)紅溶液染色15 min，水洗，甩干；(2)酸性酒精溶液脫色至涂片無紅色染料，水洗，甩干；(3)亞甲基藍溶液復(fù)染1 min，水洗，自然干燥后油鏡鏡檢。

1.4.3真菌熒光染色 涂片滴加1滴真菌熒光染色液，使染色液與標本充分結(jié)合，蓋上蓋玻片，濾紙吸取多余溢出的染色液，輕壓蓋玻片，熒光顯微鏡鏡檢。

1.4.4HE染色 涂片自然干燥，冰甲醇固定，HE染色步驟如下：(1)蘇木精水溶液染色8 min；(2)于鹽酸乙醇中分化5 s；(3)自來水沖洗30 min后用蒸餾水沖洗3 s；(4)乙醇伊紅染色液染色3 min；(5)于95%和100%乙醇中各脫色5 min；(6)于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各透明5 min；(7)中性樹膠封片后鏡檢。

1.4.5Wright-Giemsa染色 待涂片自然干燥后冰甲醇固定，滴加Wright-Giemsa A液2～3滴，染色1～2 min，滴加等量Wright-Giemsa B液(pH=6.8)，輕晃載玻片使Wright-Giemsa A、B液充分混勻，染色2 h，水洗，自然干燥后油鏡鏡檢。

1.4.6改良Giemsa染色 待涂片自然干燥后冰甲醇固定，Giemsa 染液[pH 7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)20倍稀釋Giemsa原液]染色約2 h，雙蒸水洗3次，自然干燥后油鏡鏡檢。

1.4.7改良GMS染色 待涂片自然干燥后冰甲醇固定，改良GMS染色步驟如下：(1)過碘酸固定5 min，雙蒸水洗3次，甩干；(2)載玻片置于預(yù)熱的加熱板上，滴加GMS工作液，覆蓋涂片，加熱3～5 min (此過程中避免GMS工作液干涸)，直至涂片顏色變?yōu)樯詈稚?，待冷卻后雙蒸水洗3次，甩干；(3)滴加氯化金溶液，15 s后待涂片顏色變?yōu)榛野咨珪r傾倒掉氯化金，雙蒸水洗3次，甩干；(4)硫代硫酸鈉固定3 min，雙蒸水洗3次，自然干燥后油鏡鏡檢。

2 結(jié) 果

如圖1A和圖2A所示，革蘭染色和抗酸染色P.jirovecii包囊均不著色，可見透明空泡樣結(jié)構(gòu)。C.parapsilosis革蘭染色陽性，鏡檢可見典型藍紫色卵圓形孢子，見圖1B；C.parapsilosis抗酸染色陰性，鏡檢可見藍色卵圓形孢子，見圖2B。圖3為真菌熒光染色鏡檢結(jié)果，可見發(fā)出藍色熒光的P.jirovecii包囊與C.parapsilosis孢子。HE染色鏡檢結(jié)果顯示，P.jirovecii包囊囊壁不著色，呈透明暈圈狀，囊內(nèi)可見4～8個囊內(nèi)小體，呈藍紫色，見圖4A；C.parapsilosis HE染色可見孢子呈紫紅色,見圖4B。圖5A、5B分別為P.jirovecii包囊Wright-Giemsa染色和改良Giemsa染色鏡檢結(jié)果，均可見圓形或卵圓形P.jirovecii包囊，囊壁不著色但折光性強，呈新月形，囊內(nèi)可見4～8個囊內(nèi)小體；改良Giemsa染色囊內(nèi)小體核呈藍色，囊內(nèi)容物呈藍紫色，周圍可見呈紫紅色的滋養(yǎng)體，而Wright-Giemsa染色囊內(nèi)容物和囊內(nèi)小體核均被染成紅色。改良Giemsa染色C.parapsilosis 孢子呈藍色，見圖5C。改良GMS染色鏡檢結(jié)果顯示，P.jirovecii包囊囊壁為深褐色或黑色，呈特征性括弧樣結(jié)構(gòu)，囊內(nèi)小體不著色，中間有1條黑色褶皺或中心點狀深染，見圖6A；C.parapsilosis孢子囊壁較厚，呈黑色或中心點狀深染，見圖6B。

注：A為P.jirovecii包囊不著色，呈透明空泡樣結(jié)構(gòu)；B為C.parapsilosis藍紫色卵圓形孢子。

注：A為P.jirovecii包囊不著色，呈透明空泡樣結(jié)構(gòu)；B為C.parapsilosis藍色卵圓形孢子。

注：A為發(fā)出藍色熒光的P.jirovecii包囊；B為發(fā)出藍色熒光的C.parapsilosis孢子。

注：A為P.jirovecii包囊囊壁不著色，囊內(nèi)容物呈藍紫色；B為C.parapsilosis孢子，呈紫紅色。

注：A為Wright-Giemsa染色，P.jirovecii囊內(nèi)容物和囊內(nèi)小體核均被染成紅色；B為改良Giemsa染色，P.jirovecii囊內(nèi)小體核呈藍色，囊內(nèi)容物呈藍紫色，周圍可見呈紫紅色的滋養(yǎng)體；C為改良Giemsa染色，C.parapsilosis孢子呈藍色。

注：A為P.jirovecii包囊囊壁為深褐色或黑色；B為C.parapsilosis孢子囊壁較厚，呈黑色或中心點狀深染。

3 討 論

P.jirovecii缺乏可靠的體外培養(yǎng)體系，且臨床實驗室缺乏診斷PJP的有效方法和經(jīng)驗，加之痰液中P.jirovecii的檢出率較低，因此P.jirovecii感染易被臨床漏診。

P.jirovecii作為一種非典型真菌，革蘭染色、抗酸染色的染色效果差。本研究發(fā)現(xiàn)，若BALF涂片在經(jīng)革蘭染色和抗酸染色發(fā)現(xiàn)有空泡樣結(jié)構(gòu)，應(yīng)高度懷疑P.jirovecii感染，并進一步經(jīng)真菌熒光染色初步判定。真菌熒光染色是一種快速檢測真菌感染的染色方法，其染色液中的熒光染料與真菌細胞壁成分結(jié)合，在紫外光激發(fā)下呈強熒光，通過熒光顯微鏡可觀察真菌形態(tài)。該方法方便快捷，靈敏度高，在熒光顯微鏡下真菌形態(tài)清晰，可提高檢出率，且對檢驗人員技術(shù)要求較低，便于臨床快速診斷。雖然真菌熒光染色適用范圍廣，但檢測P.jirovecii的特異度較差，本研究運用其分別對P.jirovecii和C.parapsilosis染色，熒光顯微鏡鏡檢結(jié)果顯示，二者孢子呈現(xiàn)的熒光形態(tài)相似，容易混淆，因此真菌熒光染色對于P.jirovecii的檢測特異度較低。

HE染色是病理組織石蠟切片最常用的染色方法，本研究對BALF涂片中P.jirovecii 包囊使用HE染色，結(jié)果顯示，P.jirovecii包囊囊壁不著色，呈透明暈圈狀，囊內(nèi)可見4～8個囊內(nèi)小體，呈藍紫色，與魯懷偉等[9]的染色結(jié)果一致。Wright-Giemsa染色是血液細胞學(xué)染色最常用的方法；改良Giemsa染色常用于細胞核和寄生蟲的染色。本研究對BALF涂片中P.jirovecii包囊分別使用Wright-Giemsa和改良Giemsa染色，鏡檢結(jié)果顯示，兩種染色方法的染色背景有所區(qū)別，包囊結(jié)構(gòu)特征與HE染色相似，均呈現(xiàn)P.jirovecii包囊的典型形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，即囊壁不著色，囊內(nèi)可見4～8個囊內(nèi)小體；Wright-Giemsa和改良Giemsa染色中P.jirovecii包囊囊壁不著色，易與其他真菌鑒別。但Wright-Giemsa染色可使BALF中細胞、黏液等其他物質(zhì)著色，且PBS的pH值對細胞染色有很大影響，致使P.jirovecii包囊結(jié)構(gòu)與背景中其他成分缺乏對比，難以區(qū)分；改良Giemsa染色對PBS的pH值進行了調(diào)整，可見P.jirovecii滋養(yǎng)體，較Wright-Giemsa染色檢出率高。本研究運用改良GMS染色檢測P.jirovecii與C.parapsilosis，結(jié)果表明，盡管二者均著色，且均有中心點狀深染形態(tài)結(jié)構(gòu)，但C.parapsilosis孢子囊壁較厚，大小、形態(tài)均與P.jirovecii典型包囊有顯著區(qū)別。改良GMS染色可使其他真菌的菌絲、芽孢等結(jié)構(gòu)著色，但根據(jù)孢子大小、形態(tài)及孢子囊壁的厚薄均能與P.jirovecii典型包囊結(jié)構(gòu)鑒別。

此外，當患者高度懷疑PJP，但經(jīng)病原學(xué)染色未找到P.jirovecii典型形態(tài)結(jié)構(gòu)，或因無法耐受支氣管肺泡灌洗致使無法獲得BALF標本時，應(yīng)結(jié)合患者CD4+T細胞計數(shù)、血清LDH等實驗室指標進行判斷。P.jirovecii感染與CD4+T細胞的反應(yīng)密切相關(guān)，CD4+T細胞計數(shù)在判斷艾滋病患者免疫系統(tǒng)抑制程度、PJP疾病進展及臨床診療方面具有重要的指導(dǎo)意義[10-11]。血清LDH有助于PJP的輔助診斷，還可動態(tài)反映病情的進展和療效[12-13]。本研究中患者血清LDH水平增高，CD4+T細胞計數(shù)降低。此外，本研究中患者PCT、hs-CRP、ESR水平均增高，但這些指標缺乏特異性，因此應(yīng)結(jié)合其他輔助檢查及臨床癥狀綜合考慮[14]。

由于本研究應(yīng)用C.parapsilosis血培養(yǎng)皿純培養(yǎng)物配置成菌懸液，而非存在C.parapsilosis的BALF制成涂片進行不同方法染色，因此有一定局限性，即本研究涉及的不同染色方法鏡檢結(jié)果因缺少BALF中細胞及黏液等其他物質(zhì)的染色背景，C.parapsilosis的輪廓和形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可見，易于辨別。然而在實際檢測中，大多數(shù)真菌經(jīng)HE、Wright-Giemsa、改良Giemsa染色后，其顏色與細胞、組織、其他物質(zhì)背景顏色接近，尤其當真菌數(shù)量不多時，更不易區(qū)分。

綜上所述，BALF是檢測P.jirovecii的最佳標本，當革蘭染色和抗酸染色發(fā)現(xiàn)BALF中存在成堆排列的透明空泡樣結(jié)構(gòu)時，應(yīng)高度懷疑P.jirovecii感染，并聯(lián)合多種染色方法進一步確認。真菌熒光染色可快速檢出P.jirovecii，但難以與其他酵母樣真菌鑒別；HE染色、Wright-Giemsa染色、改良Giemsa染色、改良GMS染色均可用于確診PJP，但HE染色、Wright-Giemsa染色、改良Giemsa染色中P.jirovecii包囊結(jié)構(gòu)與背景中其他成分缺乏對比、難以區(qū)分，對檢驗人員要求較高；改良Giemsa染色易于區(qū)分P.jirovecii與其他真菌結(jié)構(gòu)，可用于P.jirovecii的篩選；改良GMS染色的染色效果良好，是臨床確診PJP的推薦病原學(xué)染色方法。此外，當臨床高度懷疑PJP，但病原學(xué)染色未見P.jirovecii典型結(jié)構(gòu)時，可結(jié)合LDH、CD4+T細胞等檢查結(jié)果及影像學(xué)表現(xiàn)綜合判斷。