李建英,毛玉環(huán),劉珊玲
湖南省長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖南長(zhǎng)沙 410005
BCR-ABL融合基因由9號(hào)染色體長(zhǎng)臂(9q34)上的原癌基因埃布爾森小鼠白血病病毒癌基因同源物1(ABL1)和22號(hào)染色體長(zhǎng)臂(22q11)上的斷裂點(diǎn)集簇區(qū)(BCR)基因易位而成,具有異常的酪氨酸激酶活性。BCR-ABL融合基因作為慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的分子基礎(chǔ),既是CML診斷和監(jiān)測(cè)療效的生物學(xué)標(biāo)志物,也是酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療CML的靶點(diǎn)。因此,監(jiān)測(cè)CML患者的BCR-ABL融合基因水平已成為評(píng)估療效、早期識(shí)別耐藥、監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展,從而指導(dǎo)治療的重要手段[1-2]。CML患者在接受TKI及造血干細(xì)胞移植(HSCT)治療后低BCR-ABL融合基因水平是普遍且長(zhǎng)期存在的,因此BCR-ABL融合基因已成為TKI治療過(guò)程中及HSCT治療后療效評(píng)估不可或缺的指標(biāo)[3]。然而,目前用于檢測(cè)BCR-ABL融合基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)操作步驟較多,所采用的試劑、儀器及人員操作水平等均可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。為了提高BCR-ABL融合基因檢測(cè)水平,研制出標(biāo)準(zhǔn)化BCR-ABL融合基因質(zhì)控物是當(dāng)前的首要任務(wù)。裝甲R(shí)NA(Armored RNA)技術(shù)可形成內(nèi)含BCR-ABL融合基因不同類型特定RNA的病毒樣顆粒(VLPs),可使BCR-ABL融合基因免受環(huán)境中核糖核酸酶(RNase)和脫氧核糖核酸酶(DNase)的降解,且無(wú)生物傳染性,既能大量人工合成,又有長(zhǎng)期穩(wěn)定性,是制備BCR-ABL融合基因質(zhì)控物的合適材料[4-5]。本研究旨在建立基于Armored RNA的BCR-ABL融合基因質(zhì)控物,用于評(píng)價(jià)BCR-ABL融合基因檢測(cè)試劑盒的性能,以促進(jìn)BCR-ABL融合基因檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化。
1.1材料 p210型BCR-ABL融合基因陽(yáng)性骨髓標(biāo)本。
1.2儀器與試劑 PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、TA克隆試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Promega公司;p210型BCR-ABL融合基因RT-qPCR試劑盒(以下稱市場(chǎng)在售試劑盒)購(gòu)自上海源奇生物有限公司; Top10 E.Coli 用于重組克隆的構(gòu)建和擴(kuò)增,購(gòu)自天根生化科技有限公司;BL21(DE3) E.Coli 用于BCR-ABL融合基因特定RNA的MS2噬菌體VLPs的原核表達(dá),購(gòu)自天根生化科技有限公司。pACYCDuet-1購(gòu)自德國(guó)Novagen公司;pACYC-MS2 由MS2噬菌體成熟酶蛋白基因和衣殼蛋白基因克隆于pACYCDuet-1而成,由中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心免疫室提供。
1.3方法
1.3.1Armored RNA質(zhì)控物制備 收集p210型BCR-ABL融合基因陽(yáng)性骨髓標(biāo)本cDNA,采用PCR擴(kuò)增p210 型BCR-ABL融合基因片段和ABL內(nèi)參基因片段,純化后的PCR產(chǎn)物分別插入pACYC-MS2載體,經(jīng)Top10 E.Coli 轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定、擴(kuò)增,提取pACYC-MS2-p210和pACYC-MS2-ABL陽(yáng)性重組載體質(zhì)粒后轉(zhuǎn)導(dǎo)BL21(DE3) E.Coli,大量誘導(dǎo)表達(dá)形成pACYC-MS2-p210 VLPs和pACYC-MS2-ABL VLPs后分離、富集、純化和鑒定。將純化的VLPs標(biāo)本原液用基本必需培養(yǎng)基進(jìn)行倍比稀釋,然后取1∶104和1∶105稀釋的VLPs用RT-qPCR先進(jìn)行預(yù)定量。
1.3.2質(zhì)控物性能檢測(cè)
1.3.2.1耐RNase試驗(yàn) 隨機(jī)抽取分裝好的pACYC-MS2-p210 VLPs和pACYC-MS2-ABL VLPs標(biāo)本各10份作為p210 Armored RNA組和ABL Armored RNA組,另取2份p210型BCR-ABL融合基因裸露RNA標(biāo)本作為裸露RNA組,在p210 Armored RNA組和ABL Armored RNA組的各5份標(biāo)本與裸露RNA組的1份標(biāo)本中分別加入RNase(1 μg/mL)后于37 ℃放置60 min;3組剩余標(biāo)本不做處理。然后同時(shí)提取RNA進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。
1.3.2.2均一性檢測(cè) 隨機(jī)抽取分裝好的pACYC-MS2-p210 VLPs和pACYC-MS2-ABL VLPs標(biāo)本各10份,提取RNA進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè),每份標(biāo)本檢測(cè)3次,獲得平均Ct值。
1.3.2.3穩(wěn)定性檢測(cè) 隨機(jī)抽取5份標(biāo)本后分別置于下列環(huán)境:(1)-20 ℃環(huán)境中,檢測(cè)7個(gè)月,每個(gè)月檢測(cè)1次;(2)4 ℃環(huán)境中,檢測(cè)3個(gè)月,每半個(gè)月檢測(cè)1次;(3)室溫(20~25 ℃)環(huán)境中,檢測(cè)15 d,3 d檢測(cè)1次;(4)37 ℃環(huán)境中,檢測(cè)7 d,1 d檢測(cè)1次。
1.3.3RT-qPCR判斷質(zhì)控物適用性 取兩種VLPs水平約為106copy/mL的標(biāo)本,依次稀釋至105、104和103copy/mL,采用市場(chǎng)在售試劑盒對(duì)不同水平標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),以不同水平為橫坐標(biāo)、Ct值為縱坐標(biāo)繪制兩種VLPs的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算R2,判斷線性,以驗(yàn)證該質(zhì)控物能否評(píng)價(jià)BCR-ABL融合基因檢測(cè)試劑盒的性能。
2.1PCR擴(kuò)增目的片段結(jié)果 經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到p210型BCR-ABL融合基因片段和ABL內(nèi)參基因片段,長(zhǎng)度分別為1 399 bp和1 633 bp,擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。
2.2pACYC-MS2-p210和 pACYC-MS2-ABL載體的驗(yàn)證 將目的片段克隆入pACYC-MS2載體,形成pACYC-MS2-p210和pACYC-MS2-ABL重組載體,轉(zhuǎn)化后隨機(jī)挑取克隆,提取質(zhì)粒,做PCR驗(yàn)證,結(jié)果見(jiàn)圖2。
2.3pACYC-MS2-p210 VLPs和pACYC-MS2-ABL VLPs的表達(dá)、純化和鑒定
2.3.1分子篩純化VLPs 分別將構(gòu)建好的2個(gè)單質(zhì)粒雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主細(xì)胞BL21(DE3) E.Coli,經(jīng)誘導(dǎo)、表達(dá)、超聲碎菌離心后得到的上清液用RNase、DNase 消化過(guò)夜,經(jīng)分子篩色譜純化。
注:M為DL 2000 DNA marker;1為p210型BCR-ABL融合基因擴(kuò)增產(chǎn)物;2為ABL內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物。
注:A中M為DL 2000 DNA marker,1、3、4、5為pACYC-MS2-p210重組載體質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物,2為陰性克隆;B中M為DL 2000 DNA marker,1~4、6、7為pACYC-MS2-ABL重組載體質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物,5為陰性克隆。
2.3.2反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)鑒定VLPs 提取pACYC-MS2-p210 VLPs和pACYC-MS2-ABL VLPs里的RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再進(jìn)行RT-PCR鑒定。VLPs包裝的RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物長(zhǎng)度依次為1 399 bp和1 633 bp,見(jiàn)圖3。
2.4耐RNase試驗(yàn) 耐RNase試驗(yàn)結(jié)果顯示,p210 Armored RNA組和ABL Armored RNA組經(jīng)RNase處理的Ct值與未經(jīng)RNase處理的Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);裸露RNA組經(jīng)RNase處理后均無(wú)擴(kuò)增曲線、無(wú)Ct值,裸露RNA在RNase作用下完全降解。見(jiàn)表1。
2.5均一性與穩(wěn)定性檢測(cè) 均一性檢測(cè)pACYC-MS2-p210 VLPs和pACYC-MS2-ABL VLPs標(biāo)本的變異系數(shù)(CV)分別為3.45%和3.64%,均<5.00%,表明標(biāo)本中目的片段拷貝數(shù)水平是均一的。穩(wěn)定性檢測(cè)顯示,兩種VLPs標(biāo)本在-20 ℃可至少穩(wěn)定保存7個(gè)月,4 ℃穩(wěn)定保存3個(gè)月,室溫穩(wěn)定保存15 d,37 ℃穩(wěn)定保存1周(CV<5.00%),穩(wěn)定性變化趨勢(shì)見(jiàn)圖4。
注:M為DL 2000 DNA marker;1為pACYC-MS2-p210 VLPs中RNA的RT-PCR產(chǎn)物;2為pACYC-MS2-ABL VLPs中RNA的RT-PCR產(chǎn)物。
表1 Armored RNA和裸露RNA經(jīng)RNase處理與未經(jīng)RNase處理的Ct值比較
注:A為-20 ℃下的穩(wěn)定性;B為4 ℃下的穩(wěn)定性;C為室溫下的穩(wěn)定性;D為37 ℃下的穩(wěn)定性。
2.6RT-qPCR判斷質(zhì)控物的適用性 不同水平pACYC-MS2-p210 VLPs和pACYC-MS2-ABL VLPs均能被市場(chǎng)在售試劑盒檢出,其標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2分別為0.994 0和0.991 7,具有很好的適用性。見(jiàn)圖5。
注:A為pACYC-MS2-p210 VLPs標(biāo)準(zhǔn)曲線;B為pACYC-MS2-ABL VLPs標(biāo)準(zhǔn)曲線;兩種VLPs的水平均為實(shí)際值取lg。
BCR-ABL融合基因檢測(cè)對(duì)造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病的篩查和診斷具有重要意義,為促進(jìn)BCR-ABL融合基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化,本研究建立了基于Armored RNA的BCR-ABL融合基因質(zhì)控物。此外,考慮到臨床檢測(cè)該融合基因采用的是RT-qPCR,除了含有融合基因轉(zhuǎn)錄本以外,還含有內(nèi)參基因,而且目前常見(jiàn)的內(nèi)參基因?yàn)锳BL,為盡可能模擬真實(shí)臨床標(biāo)本,本研究還制備了內(nèi)參基因ABL質(zhì)控物。
Armored RNA是由MS2噬菌體衣殼蛋白和成熟酶蛋白自行裝配包裹外源RNA形成的,將MS2噬菌體基因組中成熟酶編碼序列、成熟酶核糖體結(jié)合位點(diǎn)、衣殼蛋白編碼序列、包裝位點(diǎn)和復(fù)制酶部分起始位點(diǎn)的cDNA序列克隆到原核表達(dá)載體上,并在其下游處插入外源RNA的cDNA序列,經(jīng)轉(zhuǎn)錄后即可得到帶有MS2噬菌體操縱子序列的外源RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,引起衣殼蛋白自發(fā)組裝,并將外源RNA序列包裝到包膜內(nèi),形成VLPs。同時(shí)包裝本身還是一個(gè)翻譯調(diào)節(jié)的元件,當(dāng)衣殼蛋白表達(dá)水平超過(guò)組裝要求時(shí),衣殼蛋白二聚體與包裝位點(diǎn)結(jié)合,阻止核糖體結(jié)合到復(fù)制酶的起始位點(diǎn),抑制了復(fù)制酶的翻譯,從而完成了翻譯的調(diào)節(jié)[6]。PEABODY[7]于1990年發(fā)現(xiàn)MS2噬菌體衣殼蛋白能夠優(yōu)先包裝含有19 mer莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA,形成VLPs,但外源RNA長(zhǎng)度超過(guò)500 bp則包裝效率明顯降低。隨后,其他研究人員以此為基礎(chǔ),嘗試包裝更長(zhǎng)的外源RNA片段[8-10]。我國(guó)學(xué)者ZHAN等[11]進(jìn)一步優(yōu)化條件并構(gòu)建帶有3個(gè)或2個(gè)C-variant 包裝位點(diǎn)的表達(dá)系統(tǒng),成功地將長(zhǎng)3 034 bp的RNA包入VLPs中。
本研究通過(guò)探討包裝位點(diǎn)的親和力及位置改變對(duì)MS2噬菌體包膜蛋白包裝外源RNA的影響,采用Armored RNA技術(shù),經(jīng)大量原核表達(dá)純化,制備了包裝有p210型BCR-ABL融合基因和ABL內(nèi)參基因的VLPs,用于制備BCR-ABL融合基因核酸檢測(cè)質(zhì)控物。原核表達(dá)純化1次即可獲得大量的VLPs,相比裸露的RNA和陽(yáng)性細(xì)胞系成本更低,且對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求低,目前被廣泛應(yīng)用于核酸檢測(cè)質(zhì)控和標(biāo)準(zhǔn)的研究[12]。BCR-ABL融合基因Armored RNA的推廣應(yīng)用,將為檢測(cè)工作提供統(tǒng)一的質(zhì)控物。
均一性和穩(wěn)定性是質(zhì)控物應(yīng)具備的基本特性。均一性檢測(cè)pACYC-MS2-p210 VLPs和pACYC-MS2-ABL VLPs標(biāo)本的CV分別為3.45%和3.64%,均<5.00%,表明標(biāo)本中目的片段拷貝數(shù)水平是均一的;本研究穩(wěn)定性結(jié)果顯示,質(zhì)控物在-20 ℃可至少穩(wěn)定保存7個(gè)月,4 ℃穩(wěn)定保存3個(gè)月,室溫穩(wěn)定保存15 d,37 ℃穩(wěn)定保存1周(CV<5.00%)。在均一性和穩(wěn)定性允許的條件下,兩種不同水平的VLPs均能被市場(chǎng)在售試劑盒檢出,pACYC-MS2-p210 VLPs和pACYC-MS2-ABL VLPs標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2分別為0.994 0和0.991 7,說(shuō)明本研究研制的質(zhì)控物將有助于核酸檢測(cè)工作測(cè)量程序的評(píng)價(jià)、室內(nèi)質(zhì)控物和室間質(zhì)評(píng)標(biāo)本的建立和應(yīng)用,促進(jìn)我國(guó)BCR-ABL融合基因檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。
研究發(fā)現(xiàn),隨CML病情進(jìn)展,BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)錄本水平進(jìn)行性增高,該基因的定量檢測(cè)有助于療效觀察和預(yù)后判斷[13]。陳蕾等[14]發(fā)現(xiàn),BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)錄本水平持續(xù)性增高對(duì)CML病情進(jìn)展可能具有預(yù)測(cè)作用。隨著分子靶向治療藥物的廣泛使用,BCR-ABL融合基因的突變是導(dǎo)致治療效果不佳的主要原因之一,且在治療與預(yù)后中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn),BCR-ABL 融合基因T315I突變是目前治療CML耐藥最難以克服的基因突變[15],國(guó)外報(bào)道 BCR-ABL 融合基因T315I突變?cè)贑ML患者中的發(fā)生率約為15%[16],這為制備不同變異來(lái)源的BCR-ABL融合基因質(zhì)控物提供了基礎(chǔ)。