新型絲素蛋白水凝膠攜載西咪替丁預(yù)防酒精引起的小鼠急性胃潰瘍

陳翩翩，黃維潔，沈淑蓉

（溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 溫州 325000，1.中藥房；2.腫瘤科）

消化性潰瘍是一種全球性的常見疾病，而胃潰瘍是消化性潰瘍中最為常見的類型[1]。胃潰瘍的病因復(fù)雜，而且為多發(fā)病，易反復(fù)發(fā)作。胃黏膜的急性損傷是胃潰瘍發(fā)生的重要原因，而針對胃潰瘍的治療主要以口服藥物為主。西咪替丁（cimetidine，CMD）為H2受體拮抗劑，能抑制基礎(chǔ)和夜間胃酸分泌，也能抑制由組胺、分肽胃泌素、胰島素和食物等刺激引起的胃酸分泌，并使其酸度降低，對因化學(xué)刺激引起的腐蝕性胃炎有預(yù)防和保護(hù)作用，對應(yīng)激性胃潰瘍和上消化道出血也有明顯療效[2]。但是，胃黏膜黏液的更新、黏膜層的物理保護(hù)屏障、酶降解作用等，使得具有治療潛力的藥物不能到達(dá)胃黏膜損傷部位，從而降低治療的有效性，增加全身不良反應(yīng)。同時，胃排空效應(yīng)[3]易將治療藥物排空，難以達(dá)到有效的原位給藥預(yù)防治療效果，極大降低了藥物治療效率，增加了治療時間。

絲素蛋白（silk fibroin，SF）為一種可降解材料，且生物安全性好，提取于蠶繭[4-5]，通過脫膠提取等步驟可得到SF水凝膠。以SF水凝膠為基礎(chǔ)的生物黏附型水凝膠攜載CMD，將最大限度地發(fā)揮高親和性水凝膠的優(yōu)勢。

針對胃內(nèi)特殊生理結(jié)構(gòu)特點和黏液屏障，本項目利用安全性高的生物新材料或材料新組合，制備攜載CMD的生物黏附水凝膠，構(gòu)建新型胃潰瘍長效預(yù)防治療系統(tǒng)，充分發(fā)揮藥物與生物材料聯(lián)合應(yīng)用對于胃黏膜損傷的高效預(yù)防作用。

1 材料和方法

1.1 材料 BMJ-III型病理組織包埋機(jī)（常州中威電子儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)型石蠟切片機(jī)（珊頓，英國）；酶標(biāo)儀（BioTek，美國）；ECLIPSE NI正置熒光顯微鏡（尼康，日本）；Ti-E&A1 plus激光共聚焦顯微鏡（尼康，日本）；掃描電子顯微鏡（日立，日本）；超聲細(xì)胞破碎儀（Branson，美國）。CMD（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度99%）；SOD和MDA試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；阿利新藍(lán)-過碘酸-雪夫染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 CMD-SF水凝膠的制備：SF水溶液制備方法參考PIKULA等[6]的制備步驟。首先，剪開蠶繭，使其成碎片狀，稱取10 g蠶繭碎片，加入1 L 0.02 mol/L Na2CO3溶液，在100℃下煮沸1.5 h，期間更換Na2CO3溶液1次，后用蒸餾水反復(fù)沖洗，以去除絲膠蛋白，再放入烘箱干燥。烘干后，將脫膠的蠶絲纖維放入9.3 mol/L LiBr溶液中3 h，期間保持60℃恒溫水浴。最后，通過離心和過濾之后，將溶液放入透析袋中，透析3 d，以去除殘留的鹽溶液。提取的SF溶液的最后濃度約等于1.5 wt%，放于4 ℃?zhèn)溆谩Ｈ? mL SF溶液，混入1 g CMD，混合均勻之后，進(jìn)行超聲處理，誘導(dǎo)CMD-SF溶液相變?yōu)镃MD-SF水凝膠[7]（20%的振幅，共作用30 s，10 s作用，10 s間隙）。

1.2.2 CMD-SF水凝膠形態(tài)學(xué)表征：取適量CMD-SF溶液和CMD-SF水凝膠樣品，用液氮迅速冷凍至固態(tài)，放到冷凍干燥機(jī)中凍干48 h，呈白色粉狀，將其固定于導(dǎo)電片上，噴金后用掃描電鏡觀察樣品的結(jié)構(gòu)與形態(tài)。同時進(jìn)行FT-IR分析檢測判別CMD-SF的成膠狀態(tài)，光譜通過Excalibur Series收集，64次掃描，分辨率為4 cm-1[8]。

1.2.3 CMD-SF水凝膠的體外緩釋：通過動態(tài)透析方法檢測CMD-SF水凝膠體系對CMD的緩釋效果。首先，將CMD溶液、CMD-SF溶液以及CMD-SF水凝膠樣品分別放入透析袋中（MW，100 kDa），將透析袋放入裝有50 mL pH為7.4的PBS溶液的離心管中，接著將離心管放入37℃恒溫水浴搖床上，每個時間點取0.5 mL外界溶液，再保存在-80℃超低溫冰箱，在收集完最后一個時間點后，用紫外分光光度儀于波長218 nm波長處測定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算釋放液中的CMD濃度。累計釋放率=（上清液的CMD含量/原始CMD含量）×100%。

1.2.4 急性胃潰瘍模型的構(gòu)建與動物分組：C57BL/6雄性小鼠32只，8周齡，由上海斯萊克實驗動物中心提供，在溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室的室溫維持在（23±2）℃，濕度35%～60%，自然光照，自由飲食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組，即對照組、CMD組、CMD-SF溶液組、CMDSF水凝膠組。于造模前3 d給予各組藥物進(jìn)行預(yù)防治療，CMD組、CMD-SF溶液組以及CMD-SF水凝膠組灌服劑量為每天4 mL/kg，連續(xù)灌胃3 d，對照組灌服同等容積的0.9%氯化鈉溶液。于最后一次灌胃后禁食24 h，各組小鼠按15 mL/kg劑量灌胃無水酒精[9]，灌胃1 h后，致急性酒精性胃潰瘍模型。

1.2.5 原位灌胃CMD-SF水凝膠對急性胃潰瘍模型動物的預(yù)防效果：標(biāo)本采集：無水酒精灌胃1 h后，處死動物，摘取全胃，沿胃大彎對半剪開，用0.9%氯化鈉溶液洗凈，將胃組織攤平，擺上標(biāo)尺，在同樣的高度、視野、倍數(shù)下快速拍照記錄。然后，將一半組織平攤在錫箔紙上，浸泡于10%甲醛溶液中固定，用于組織學(xué)評價，另一半組織移入-80℃冰箱中保存，待勻漿。胃組織中SOD、MDA檢測：按照MDA、SOD試劑盒的檢測步驟對采集得到的各組小鼠胃組織中SOD、MDA的含量進(jìn)行檢測。組織學(xué)評價：固定好的胃組織進(jìn)行脫水，石蠟包埋，制備成5 μm切片，分別進(jìn)行HE染色觀察胃組織形態(tài)學(xué)、PAS染色觀察胃黏膜的損傷情況和caspase3免疫組化染色觀察胃的細(xì)胞凋亡情況。用光學(xué)顯微鏡觀察，根據(jù)前期實驗[1]的組織學(xué)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)對間質(zhì)水腫（評分0～3）、出血損傷（評分0～3）和炎癥細(xì)胞的存在（評分0～3）進(jìn)行評分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，采用Dunnett’st檢驗進(jìn)行多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CMD-SF水凝膠的特征 為了驗證CMD-SF水凝膠的成膠狀態(tài)，將制備得到的CMD-SF溶液和CMDSF水凝膠分別進(jìn)行了掃描電鏡成像觀察顯微結(jié)構(gòu)，CMD-SF溶液（見圖1a）呈細(xì)長水滴狀雜亂排列，而CMD-SF水凝膠則呈扁片狀（見圖1b），掃描電鏡成像結(jié)果與文獻(xiàn)報道[10-11]相同，說明CMD-SF水凝膠制備成功。通過FT-IR檢測CMD-SF水凝膠成膠狀況。SF在溶液狀和凝膠狀下，有著不同的二級結(jié)構(gòu)，主要體現(xiàn)在SF溶液中有1 660、1 540和1 235 cm-1的特征峰，該特征峰為α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰，而SF凝膠中有1 630和1 530 cm-1的特征峰，該特征峰為 β-折疊結(jié)構(gòu)的特征峰[12]。從圖1c可知，經(jīng)過超聲處理后CMD-SF的特征峰為1 630和1 526 cm-1，具有 β-折疊的特征，而未經(jīng)超聲處理的CMD-SF的特征峰為1 650和1 545 cm-1，具有α-螺旋的特征。此結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)，本實驗的超聲處理能夠誘導(dǎo)CMD-SF溶液向CMD-SF水凝膠轉(zhuǎn)變。

圖1 CMD-SF水凝膠的特征

2.2 CMD-SF水凝膠的緩釋 由圖1d可見，在12 h時，CMD溶液的累計釋放量約為51.6%，CMD-SF溶液的累計釋放量約為49.2%，與CMD溶液幾乎沒有差別；而CMD-SF水凝膠的累計釋放量約為31.7%，72 h時，CMD溶液的累計釋放量約為73.0%，CMD-SF溶液的累計釋放量與單純CMD的累積釋放量幾乎沒有差別，而CMD-SF水凝膠的累計釋放量約為45.4%，以上結(jié)果說明單純的SF溶液并不能有效穩(wěn)定CMD，而成膠后的SF能有效穩(wěn)定CMD的釋放，達(dá)到緩釋的效果，從而延長CMD的作用。

圖2 4組胃組織宏觀評價

2.3 CMD-SF水凝膠能有效預(yù)防酒精引起的急性胃潰瘍通過各組組織樣本可以看出，給予CMD-SF水凝膠預(yù)防治療，能有效減少胃出血、潰瘍的發(fā)生，并且預(yù)防效果高于CMD組和CMD-SF溶液組（見圖2）。對照組（見圖3a）的小鼠胃組織的黏膜層破損，腺體排列紊亂且形態(tài)變異，黏膜下層存在較多炎癥細(xì)胞浸潤。CMD-SF水凝膠組（見圖3d）黏膜層較為完整，腺體排列較為規(guī)整，黏膜下層幾乎未見炎癥細(xì)胞浸潤，優(yōu)于CMD組（見圖3b）和CMD-SF溶液組（見圖3c）的預(yù)防效果。CMD-SF水凝膠（見圖3h）預(yù)防治療后胃組織周邊黏膜PAS染色陽性的中性黏液面積相較于對照組（見圖3e）明顯增加，說明CMD-SF水凝膠能有效緩解由酒精引起的黏膜糖蛋白的損失，能有效預(yù)防胃潰瘍的發(fā)生，而未成膠的SF溶液并不能提高CMD的治療效果。胃組織損傷評分見圖4，與對照組相比，治療組組織學(xué)損傷評分有所下降，尤其是CMD-SF水凝膠組（P＜0.01），能有效降低出血、減少炎癥細(xì)胞浸潤以及減輕間隙水腫，而CMD組 （P＜0.01）和CMD-SF溶液組（P＜0.01）的組織學(xué)損傷評分改善沒有CMD-SF水凝膠組顯著。各組胃組織樣本的PAS染色中的中性黏液水平結(jié)果示，與對照組比，CMD-SF水凝膠組的中性黏液水平顯著提高（P＜0.01），而CMD組和CMD-SF溶液組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），同時CMD組和CMD-SF溶液組之間幾乎沒有差別，說明SF溶液并不能提高CMD的治療效果。

圖3 4組胃組織病理染色

2.4 CMD-SF水凝膠有效預(yù)防細(xì)胞凋亡減少胃黏膜損傷 大量攝入酒精會嚴(yán)重?fù)p傷胃黏膜，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]，從圖5的caspase3免疫組化染色結(jié)果可以看出，相較于對照組，給予CMD-SF水凝膠，能有效降低caspase3的表達(dá)量，而給予CMD-SF溶液和CMD溶液，caspase3的表達(dá)量較對照組下降。值得注意的是，與CMD-SF水凝膠組相比，CMD-SF溶液與單純CMD溶液的預(yù)防效果差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明未成凝膠的SF溶液并不能提高CMD的預(yù)防效果。免疫印跡實驗結(jié)果表明，對照組的caspase3表達(dá)水平最高，而給予CMD-SF水凝膠治療后caspase3水平顯著下降（P＜0.01），CMD組和CMD-SF溶液組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。相較于CMD-SF水凝膠，CMD組和CMD-SF溶液組的caspase3表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.5 CMD-SF水凝膠通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)來防止胃潰瘍發(fā)生 酒精會導(dǎo)致胃組織中的MDA水平提高，SOD水平下降[14]，而通過給予CMD-SF水凝膠預(yù)防治療后，相對于對照組，CMD-SF水凝膠能有效提高胃組織中SOD水平（P＜0.01），而CMD組和CMD-SF溶液組與對照組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。相對于對照組，CMD-SF水凝膠能有效降低胃組織中MDA水平（P＜0.05），而CMD組和CMD-SF溶液組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?？梢缘贸鯟MD-SF溶液的預(yù)防效果等同于單純的CMD溶液，說明未成凝膠狀的SF并不能協(xié)助CMD有效停留于胃黏膜處發(fā)揮長效的預(yù)防作用。

圖4 4組胃組織損傷評分和中性黏液水平

圖5 4組胃組織caspase3蛋白表達(dá)

表1 CMD-SF水凝膠對小鼠胃組織中SOD和MDA含量的影響（n=8）

3 討論

由酒精引起的急性胃潰瘍的發(fā)病率越來越高，且重癥患者多伴有出血、穿孔等并發(fā)癥，若不及時治療會導(dǎo)致嚴(yán)重后果[15]。應(yīng)激性胃潰瘍發(fā)病機(jī)制主要為胃酸過多、幽門螺桿菌感染、胃黏膜保護(hù)機(jī)制遭到破壞，胃黏膜血流供應(yīng)不足，胃酸侵蝕性增加，從而引起急性胃潰瘍[16]。CMD是臨床治療胃潰瘍的常用藥，但是單純的CMD藥物不能有效停留在胃黏膜表面發(fā)揮長效的預(yù)防治療作用。生物材料作為一種新興的手段，可以作為藥物載體，發(fā)揮其攜載、緩釋、靶向等不同作用。在眾多生物材料中，SF作為天然蛋白，有著高生物相容性，有利于細(xì)胞黏附和伸展，同時易提取且價格低等優(yōu)點在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受青睞[17]。

本研究采用堿提取法獲得SF溶液，再通過超聲處理獲得SF水凝膠[8，11]。通過掃描電鏡觀察制備得到的SF水凝膠的顯微結(jié)構(gòu)，同時通過FT-IR檢測進(jìn)一步確認(rèn)SF溶液向水凝膠轉(zhuǎn)變成功。我們還利用C57BL/6小鼠構(gòu)建胃潰瘍模型，應(yīng)用CMD-SF水凝膠進(jìn)行預(yù)防給藥，觀察對急性胃潰瘍的預(yù)防作用。結(jié)果表明，給予CMD-SF水凝膠預(yù)防能有效減少胃組織出血和潰瘍的發(fā)生。HE染色結(jié)果也說明，CMD-SF水凝膠的預(yù)防作用明顯好于CMD-SF溶液組和CMD溶液組，能有效保持黏膜層完整，腺體排列也較為規(guī)整，炎癥細(xì)胞浸潤減少。PAS染色也表明CMD-SF水凝膠能有效緩解黏膜糖蛋白的減少。Caspase3免疫組化染色結(jié)果證明，CMD-SF水凝膠能有效減少急性損傷的胃組織的細(xì)胞凋亡，有著良好的預(yù)防損傷作用。

現(xiàn)已證實，胃腸黏膜在化學(xué)物質(zhì)、缺血或細(xì)胞能量不足等情況下會產(chǎn)生大量的氧自由基。氧自由基在整體水平和細(xì)胞水平都可以引起胃黏膜或黏膜細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致胃黏膜血流障礙，引發(fā)胃黏膜損傷[18]。MDA是脂質(zhì)過氧化物，可引起蛋白質(zhì)變性和交聯(lián)，損害細(xì)胞及細(xì)胞膜，反映了體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，并間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重性，進(jìn)而反映細(xì)胞損傷的程度[9]。SOD是存在于生物體內(nèi)的一種抗氧化酶，能降低酒精引起的胃黏膜損傷，對酒精性胃潰瘍起到了一定的保護(hù)作用[19-20]。CMD-SF水凝膠能有效降低血中和胃組織中MDA水平和提高SOD水平，從而緩解了氧化應(yīng)激反應(yīng)，防止胃潰瘍的發(fā)生。

綜上，CMD-SF水凝膠能有效預(yù)防酒精引起的急性胃潰瘍的發(fā)生，可作為一種理想的預(yù)防胃潰瘍的載藥體系，主要是它能有效地黏附在胃黏膜表面，延長CMD的作用時間，從而增強(qiáng)其預(yù)防治療胃潰瘍的作用。