白血病抑制因子通過JAK1/STAT3信號通路調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活性

黃科峰，江明君，王華英，戚賽春

（寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院 心胸外科，浙江 寧波 315040）

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的腫瘤，也是致死率最高的腫瘤之一，分為小細(xì)胞肺癌（13%）和非小細(xì)胞肺癌（87%，non-small cell lung cancer，NSCLC），5年總生存率僅18.2%[1]。目前臨床上主要治療方法為手術(shù)、化療、放療等，但肺癌發(fā)展到晚期后治療效果往往較差[2]。白血病抑制因子（leukemia inhibitor factor，LIF）是IL-6家族成員之一，在人類生殖、骨重塑、下丘腦-垂體-腎上腺軸、神經(jīng)肌肉系統(tǒng)、心臟、造血系統(tǒng)、腫瘤等方面都有重要作用。LIF已在許多實體瘤中發(fā)現(xiàn)有表達，包括乳腺癌、皮膚癌、結(jié)直腸癌、鼻咽癌和肺癌，且LIF在體外刺激多種腫瘤的生長，抑制腫瘤細(xì)胞分化并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)移，但其作用特點及機制有待進一步明確[3-4]。本研究通過評價NSCLC患者手術(shù)切除標(biāo)本和LIF干預(yù)肺腺癌A549細(xì)胞系，探討LIF在NSCLC病理過程中作用機制及特點。

1 材料和方法

1.1 材料 癌組織及癌旁組織均取自本院患者手術(shù)切除標(biāo)本。CCK-8試劑盒、LIF抗體、磷酸化JAK1抗體、JAK1抗體、磷酸化STAT3抗體（美國Santa Cruz公司），GAPDH（美國CST公司），二抗（上海碧云天生物科技有限公司）；AB629細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒（美國Bio-Rad公司）；重組LIF（美國Chemicon公司）；Transwell小室套裝（美國Corning公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法觀察LIF蛋白表達：患者肺癌組織和癌旁組織脫水、石蠟包埋后切片，脫蠟后用蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min后進行抗原修復(fù)，用3%過氧化氫室溫孵育5～10 min后，PBS沖洗3遍，每次 2 min。10%山羊血清封閉后，室溫孵育10 min后傾去血清，滴加對應(yīng)的一抗，37℃孵育2 h后4℃過夜。第2天PBS沖洗3遍，每次2 min，滴加對應(yīng)的二抗，37℃孵育2 h，PBS沖洗3遍，每次2 min。用顯色劑顯色，PBS沖洗，復(fù)染，梯度乙醇脫水后用二甲苯透明，中性樹膠封片。常規(guī)顯微鏡下隨機10個視野條件下，記錄棕色陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.2 RT-qPCR檢測LIF mRNA表達：取NSCLC患者手術(shù)切除的癌組織和癌旁組織勻漿，加入1 mL細(xì)胞裂解液，提取組織總RNA。使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄成為cDNA。反應(yīng)條件為：37℃，15 min；98℃，5 min。FQ-PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex Taq TMI II Mix 10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，模板cDNA 1 μL，dd H2O 8 μL，總體積為20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 15 s；72℃ 20 s；擴增40個循環(huán)。擴增結(jié)束后，采用ΔΔCT分析結(jié)果。引物序列LIF-F：CCTCTTCCCATCACCCCTGTAAGAAGG，LIF-R：CCTGGACCACCACACT；GAPDH-F：TCATCACTATTG GCAACGAGC，GAPDH-R：AACAGTCCGCCTAGAAGCAC。

1.2.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖：取生長狀態(tài)良好的A549細(xì)胞制備成1×105/mL的細(xì)胞懸液，每孔100 μL 加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中置于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5% CO2條件預(yù)孵育24 h后，各孔隨機分為以下4組：A549細(xì)胞對照組（LIF空白溶劑），LIF干預(yù)A549細(xì)胞組（50、100、150 ng/mL LIF）每組設(shè)5個副孔。繼續(xù)孵育12 h后向每孔加入10 μL CCK-8工作液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h。采用雙波長測定吸光度，檢測波長450 nm，參比波長600 nm，讀取各孔OD值，以O(shè)D值間接反映細(xì)胞增殖狀況。同法培養(yǎng)細(xì)胞至加入CCK-8工作液前，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌后用裂解液裂解各孔細(xì)胞，BCA法蛋白定量后加入Loading Buffer，100℃煮10 min蛋白變性，樣本-80℃保存待用。

1.2.4 Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲：Transwell小室均勻涂布基底膜基質(zhì)（1 mg/mL）后于37℃孵育0.5 h，分別吸取1×105個細(xì)胞接種至上室，并將各小室分為以下4組：A549細(xì)胞對照組（LIF空白溶劑），LIF干預(yù)A549細(xì)胞組（50、100、150 ng/mL LIF），每組設(shè)3個副孔；各小室下室加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。上述小室內(nèi)蓋住后置于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5% CO2條件培養(yǎng)48 h后，將濾膜用多聚甲醛固定后拭去表面細(xì)胞，Giemsa染色后隨機選擇10個不同視野記錄細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 Western blot檢測LIF蛋白表達：配制10%聚丙烯酰胺凝膠，固定于電泳槽后，以30 μg/孔注于泳道中開啟電泳，濕法轉(zhuǎn)模結(jié)束后用5%牛奶封閉1 h，用對應(yīng)的一抗4℃孵育過夜，洗膜后加入對應(yīng)的二抗，常溫孵育1 h后，洗膜。條帶浸淋增強化學(xué)發(fā)光試劑后用化學(xué)發(fā)光顯影儀顯影。結(jié)果以各泳道GAPDH灰度值作為參考，目的條帶與其灰度值的相對值進行組間比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS12.0軟件進行分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間差異采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 NSCLC患者癌旁組織（A）和癌組織（B）LIF陽性表達（棕色顆粒為LIF陽性表達細(xì)胞）（×400）

2.1 LIF在人NSCLC癌變組織中的表達 圖1免疫組化結(jié)果顯示，NSCLC患者的肺癌組織中LIF陽性表達率明顯偏高，且分布較為廣泛，提示較大范圍和高水平的LIF組織表達。PCR結(jié)果顯示NSCLC癌組織中LIF mRNA的表達明顯高于非病變組織，Western blot結(jié)果顯示NSCLC患者癌組織的LIF蛋白表達水平明顯增高，見圖2。

圖2 LIF mRNA（A）和蛋白（B）在NSCLC患者癌組織和癌旁組織中的表達

2.2 重組LIF對A549細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果顯示100、150 ng/mL LIF處理48 h可促使A549細(xì)胞活力明顯增強（P＜0.05），見圖3。

圖3 LIF孵育48 h促進A549細(xì)胞增殖

2.3 重組LIF對A549細(xì)胞侵襲的影響 A549細(xì)胞經(jīng)重組LIF處理48 h后，A549細(xì)胞通過其自身遷移能力通過基底膜的細(xì)胞數(shù)目越多提示細(xì)胞侵襲能力越強。經(jīng)100、150 ng/mL LIF處理后的A549細(xì)胞通過基底膜的細(xì)胞數(shù)顯著多于未經(jīng)LIF處理的細(xì)胞（P＜0.05），見圖4。

圖4 LIF孵育48 h促進A549細(xì)胞遷移

2.4 LIF對A549細(xì)胞JAK1/STAT3通路的影響 A549細(xì)胞經(jīng)重組LIF處理后，細(xì)胞中JAK1磷酸化水平顯著提高，其下游重要的分子STAT3磷酸化水平也明顯提高（P＜0.05），見圖5。

3 討論

LIF最初被克隆出來時被視為髓樣白血病細(xì)胞系（M1）的分化誘導(dǎo)物和增殖抑制劑[5]。作為IL-6家族成員，與其他IL-6家族細(xì)胞因子類似，LIF以緊湊的四螺旋束形式存在，其分子構(gòu)型極為穩(wěn)定，為其發(fā)揮生理作用創(chuàng)造了有利條件。LIF和其受體已在許多實體瘤中發(fā)現(xiàn)有表達，包括乳腺癌、皮膚結(jié)直腸癌和鼻咽癌[6]。體外實驗已經(jīng)證明了這些癌細(xì)胞上高LIF水平與腫瘤復(fù)發(fā)和放射抵抗以及LIF誘導(dǎo)的放射抵抗和DNA修復(fù)抑制有關(guān)[7]，然而其在NSCLC患者組織上的表達研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，LIF在NSCLC細(xì)胞A549中持續(xù)較高水平表達，活化水平亦高。LIF可通過促進NSCLC相關(guān)癌細(xì)胞的增殖、侵襲作用促進癌細(xì)胞活化，可能的作用機制是通過活化JAK1/STAT3信號通路。

JAK/STAT信號通路與肺癌關(guān)系密切，尤其是JAK/STAT1、JAK/STAT3、JAK/STAT5是該信號通路幾條參與肺癌作用的經(jīng)典通路，其中JAK1/STAT3信號通路在肺癌中研究較多[8-9]。在一項對NSCLC的研究中發(fā)現(xiàn)，列入研究的10例NSCLC患者全部出現(xiàn)STAT3的高度磷酸化[10-11]，另外擴大樣本檢測發(fā)現(xiàn)，約有55%的NSCLC患者及大多數(shù)NSCLC相關(guān)細(xì)胞系都發(fā)現(xiàn)了STAT3的異?；罨?。說明STAT3A的高度活化與NSCLC密切相關(guān)[12]。

細(xì)胞膜上相關(guān)受體一旦被LIF激活，受體結(jié)合的JAK1最初將LIF受體胞內(nèi)域上的酪氨酸靶向磷酸化。磷酸化的受體鏈（gp130和LIF-Rβ）充當(dāng)支架以募集許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)實體，其中最重要的可能是STAT3。STAT蛋白是轉(zhuǎn)錄因子家族，通常以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中[13]。STAT3一旦募集到相關(guān)效應(yīng)分子，其自身就會被JAK1磷酸化，這一激活步驟使其形成具有信號功能的二聚體[14]，該二聚體易位進入細(xì)胞核并上調(diào)適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄。本研究發(fā)現(xiàn)LIF促進A549細(xì)胞的過度活化是通過JAK/STAT信號通路中JAK1/STAT3所實現(xiàn)的，但具體機制尚不明確。下一步將進一步明確LIF作用JAK1/STAT3信號后的相互作用及信號間的聯(lián)系特征。

圖5 Western blot檢測A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度LIF干預(yù)后JAK1和STAT3表達情況

綜上，NSCLC患者腫瘤組織存在LIF過表達現(xiàn)象，過表達的LIF可通過JAK1/STAT3信號促進肺癌細(xì)胞的增殖和遷移（侵襲），從而促進該病病程的發(fā)展。LIF可能作為一個重要靶點干預(yù)NSCLC的疾病進程。