葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中TRAIL-R基因敲除對(duì)Th17細(xì)胞凋亡的影響

金穎莉，夏宣平，曹曙光，林道潑，胡定元，夏盛隆，蔣益

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosisinducing ligand，TRAIL）屬于TNF超家族成員之一，與功能性受體結(jié)合后，可激活天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生凋亡信號(hào)，選擇性誘導(dǎo)異常轉(zhuǎn)化的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞無影響[1-3]。在人體中，TRAIL功能性受體包括TRAIL-R1和TRAIL-R2，又稱死亡受體（death receptor，DR）4和DR5，而小鼠體內(nèi)僅有一種TRAIL功能性受體，即TRAIL-R，與人類DR5高度同源[4]。TRAIL-R廣泛表達(dá)于各種免疫細(xì)胞上，通過調(diào)控這些免疫細(xì)胞的增殖、活化及凋亡，在維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[5-8]。炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一類慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。IBD的病因尚不明確，但免疫因素在IBD發(fā)病中起著關(guān)鍵作用[9]。KOBAYASHI等[10]報(bào)道，Th17細(xì)胞數(shù)目和活性與IBD患者腸道炎癥程度呈正相關(guān)。我們的前期研究表明TRAIL（rs1131568、rs1131579、rs1131580），DR4（rs20575、rs13278062）和DR5（rs1047266）基因多態(tài)性與漢族人群IBD的易感性密切相關(guān)[11-12]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探討TRAIL-R基因敲除（TRAIL-R-/-）對(duì)小鼠結(jié)腸炎及Th17細(xì)胞凋亡的影響，為深入揭示TRAIL/TRAIL-R信號(hào)通路影響IBD的潛在機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：DSS（相對(duì)分子質(zhì)量36～50 kDa）購自美國MP Biomedicals公司，小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊锕?，RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶購自日本TaKaRa公司，iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix購自美國Bio-Rad公司，胎牛血清購自美國Sigma公司，ROR-γt和IL-17A ELISA試劑盒、Caspase酶活性檢測試劑盒均購自杭州聯(lián)科生物公司。兔抗小鼠GAPDH抗體購自北京Affinity公司，兔抗小鼠IL-17A抗體購自英國Abcam公司；大鼠抗小鼠CD4抗體、大鼠抗小鼠CD4-FITC、大鼠抗小鼠IL-17A-PE及Fix & Perm試劑盒購自美國Biolegend公司；山羊抗大鼠Alexa Fluor 594熒光抗體和山羊抗兔Alexa Fluor 647熒光抗體購自美國Jackson公司。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司。DAPI染色液購自美國Solarbio公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6品系的TRAIL-R-/-小鼠經(jīng)CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)獲得（上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司）。根據(jù)小鼠TRAIL-R基因組序列，設(shè)計(jì)針對(duì)TRAIL-R基因的向?qū)NA（singleguide RNA，sgRNA），構(gòu)建sgRNA表達(dá)質(zhì)粒。將sgRNA和Cas9 mRNA顯微注射到C57BL/6小鼠受精卵中，獲得F0代TRAIL-R+/-小鼠。TRAIL-R+/-小鼠相互雜交后獲得TRAIL-R-/-小鼠。采用PCR驗(yàn)證TRAIL-R+/-小鼠和TRAIL-R-/-小鼠的基因型（見圖1）。同一品系的WT小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠均在溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2020-0014。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型：選擇6～8周齡、體質(zhì)量20～22g的雄性TRAIL-R-/-小鼠和WT小鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為TRAIL-R-/-結(jié)腸炎組、TRAIL-R-/-對(duì)照組、WT結(jié)腸炎組和WT對(duì)照組，每組9只。根據(jù)COOPER等[13]介紹的實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建結(jié)腸炎小鼠模型：自由飲用3.5%的DSS溶液連續(xù)7 d。對(duì)照組小鼠自由飲用清水。造模后每日觀察并紀(jì)錄小鼠的體質(zhì)量變化、糞便性狀和便血情況，計(jì)算小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）[14]。

圖1 PCR驗(yàn)證TRAIL-R基因敲除小鼠基因型

造模第7天，采用頸椎脫臼法處死小鼠，收集外周血和結(jié)腸組織。測量全結(jié)腸長度，取部分結(jié)腸標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片后HE染色，在光學(xué)顯微鏡下采用組織學(xué)活動(dòng)度評(píng)分（histology activity index，HAI）[15]對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行病理學(xué)評(píng)估。

1.2.2 提取外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）和結(jié)腸黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞（lamina propria mononuclear cells，LPMCs）：摘取小鼠眼球取血后置于EDTA抗凝管，采用小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液提取PBMCs，置于1.5 mL EP管中備用。結(jié)腸組織經(jīng)清洗、消化和過濾等處理，采用密度梯度離心后，提取溶液中間云霧狀層的結(jié)腸黏膜LPMCs，置于1.5 mL EP管中備用。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞的比例：將PBMCs和LPMCs分別重懸于1 mL含10%胎牛血清的RPMI l640培養(yǎng)基中。取200 μL的細(xì)胞懸液于96孔板中，加入1%佛波酯/離子霉素混合物2 μL、1%布雷非德菌素A/莫能菌素混合物2 μL后，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育5 h。PBS洗滌，加入抗小鼠FITC-CD4抗體，4℃避光孵育30 min，PBS再次洗滌后加入Fix & Perm，4℃避光孵育15 min后，PBS洗滌，加入抗小鼠IL-17A-PE，4℃避光孵育2 h后，PBS洗滌，上Cytoflex流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特公司），分析CD4+IL-17A+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例。

1.2.4 RT-qPCR：分別從PBMCs和LPMCs中提取總RNA，用分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度后，按PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶說明書操作，制備cDNA樣品。采用iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix進(jìn)行RT-qPCR檢測。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。小鼠β-actin上游引物：5’-GGCTGTATTCCC CTCCATCG-3’；下游引物：5’-CCAGTTGGTAACGCCATG-3’。小鼠視黃酸相關(guān)孤兒受體（retinoic acid-related orphan receptor-γt，ROR-γt）上游引物：5’-CGCAGCC AGCAGTGTAAT-3’；下游引物：5’-TGACAGCATCTCGGGAC AT-3’。小鼠IL-17A上游引物：5’-GATGCTGTTGCTGCT GCTGAG-3’；下游引物：5’-GTGGAACGGTTGAGGTAGTCT GAG-3’?？偡磻?yīng)體系10 μL，包括上下游引物各 0.4 μL，SYBR Green 5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔采用2-△△Ct法分析mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 Western blot檢測：采用蛋白裂解液對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行蛋白提取，BCA法檢測蛋白濃度，蛋白樣品電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉中封閉1.5 h，封閉結(jié)束將PVDF膜放入一抗（IL-17A或GAPDH）中，4℃搖床孵育過夜，次日洗滌后在室溫下孵育二抗1 h，顯影后用Image Lab軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 ELISA測定：小鼠外周血離心后取血漿，按產(chǎn)品說明書檢測血漿IL-17A濃度。PBMCs和結(jié)腸組織分別經(jīng)勻漿器充分勻漿后經(jīng)低速離心取上清液，按產(chǎn)品說明書檢測ROR-γt濃度。

1.2.7 免疫熒光TUNEL檢測：留取小鼠結(jié)腸標(biāo)本，制作5 μm厚度的冰凍切片，4%多聚甲醛溶液中4℃固定10 min后，用0.3% Triton X-100破膜15 min。PBS洗滌后，進(jìn)行TUNEL染色。PBS洗滌后，用5%的牛血清白蛋白封閉1 h后，加入大鼠抗小鼠CD4抗體，置于濕盒中4 ℃孵育過夜。次日加入山羊抗大鼠Alexa Fluor 594熒光抗體，室溫避光孵育60 min后，依次加入兔抗小鼠IL-17A抗體、山羊抗兔Alexa Fluor 647熒光抗體和DAPI染液，最后采用激光共聚焦顯微鏡分析。

1.2.8 凋亡蛋白酶Caspase的活性檢測：整個(gè)操作過程在4 ℃環(huán)境下完成。取小鼠結(jié)腸組織，加入細(xì)胞裂解液后，用玻璃勻漿器勻漿后轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，裂解10 min后，離心15 min，取上清液。按照試劑盒說明書操作分別檢測Caspase 3、Caspase 8 和Caspase 9的酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。首先采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)分析原始數(shù)據(jù)的正態(tài)性，結(jié)果顯示所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)或輕微偏態(tài)分布。計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析；采用Tukey’s post-hoc檢驗(yàn)對(duì)組間比較進(jìn)行校正，方差齊性者采用LSD-t法，方差不齊者采用Tamhane檢驗(yàn)；重復(fù)測量資料比較采用重復(fù)測量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TRAIL-R基因敲除對(duì)小鼠結(jié)腸炎的影響 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，TRAIL-R-/-對(duì)照小鼠和WT對(duì)照小鼠均未自發(fā)性出現(xiàn)腹瀉、便血等結(jié)腸炎癥狀，體質(zhì)量均輕度增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后，TRAIL-R-/-小鼠和WT小鼠都逐漸出現(xiàn)大便次數(shù)增多、便血、體質(zhì)量減輕等。如圖2所示，于造模第5天開始，TRAIL-R-/-結(jié)腸炎小鼠與WT結(jié)腸炎小鼠相比，上述癥狀更為嚴(yán)重，DAI顯著增高（P＜0.01）。造模第7天處死小鼠取結(jié)腸組織并測量長度。TRAIL-R-/-結(jié)腸炎小鼠與WT結(jié)腸炎小鼠相比，其結(jié)腸縮短更加明顯（P＜0.01），并且HAI評(píng)分更高（P＜0.01），表現(xiàn)為結(jié)腸黏膜和隱窩結(jié)構(gòu)大量破壞，炎癥細(xì)胞大量浸潤，病變累及深度和范圍均顯著增加。

2.2TRAIL-R基因敲除對(duì)PBMCs和LPMCs中Th17細(xì)胞比例及活性的影響如圖3-5所示，TRAIL-R-/-對(duì)照組小鼠與WT對(duì)照組小鼠相比，PBMCs和LPMCs中Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例以及ROR-γt和IL-17A的mRNA以及蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。WT結(jié)腸炎小鼠與WT對(duì)照組小鼠相比，PBMCs中Th17細(xì)胞比例顯著增高（P＜0.05），ROR-γt和IL-17A的mRNA和蛋白表達(dá)水平亦顯著增高（P＜0.05）。TRAIL-R-/-結(jié)腸炎小鼠與WT結(jié)腸炎小鼠相比，PBMCs中Th17細(xì)胞比例顯著增高（P＜0.01），ROR-γt和IL-17A的mRNA表達(dá)水平亦顯著增高（均P＜0.01），并且ROR-γt（P＜0.05）和IL-17A（P＜0.01）的蛋白表達(dá)水平也顯著增高。進(jìn)一步在各組小鼠的LPMCs中對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，與WT對(duì)照組小鼠相比，WT結(jié)腸炎小鼠LPMCs中Th17細(xì)胞比例增高（P＜0.05），ROR-γt和IL-17A的mRNA和蛋白表達(dá)水平增高（均P＜0.05）。TRAIL-R-/-結(jié)腸炎小鼠與WT結(jié)腸炎小鼠相比，LPMCs中Th17細(xì)胞比例顯著增高（P＜0.01），ROR-γt和IL-17A的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增高（均P＜0.05）。

圖2 TRAIL-R-/-結(jié)腸炎小鼠和WT結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸炎癥表現(xiàn)

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測4組小鼠PBMCs和LPMCs中CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞比例

2.3TRAIL-R基因敲除對(duì)結(jié)腸組織中Th17細(xì)胞凋亡及Caspase酶活性的影響如圖6-7所示，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，TRAIL-R-/-對(duì)照組小鼠與WT對(duì)照組小鼠的結(jié)腸組織中CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞數(shù)量極少，因此本研究未對(duì)兩對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織的Th17細(xì)胞做進(jìn)一步凋亡率統(tǒng)計(jì)。TRAIL-R-/-對(duì)照小鼠與WT對(duì)照小鼠比較，結(jié)腸組織中Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的酶活性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。WT結(jié)腸炎小鼠與WT對(duì)照小鼠比較，Caspase 3和Caspase 8的酶活性均顯著降低（P＜0.05），而Caspase 9的酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TRAIL-R-/-結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中Th17細(xì)胞的凋亡率（30.51%±2.35%）較WT結(jié)腸炎小鼠（72.08%±2.81%）顯著降低（P＜0.01），Caspase 3和Caspase 8的酶活性也顯著降低（均P＜0.01），而Caspase 9的酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

本研究中TRAIL-R-/-小鼠在清潔級(jí)條件下能正常生長、發(fā)育和繁殖，這與之前的研究結(jié)果[16]基本相符?？诜?.5%DSS后，TRAIL-R-/-小鼠較WT小鼠發(fā)生了更加嚴(yán)重的結(jié)腸炎癥反應(yīng)，這與采用TRAIL-R-/-小鼠構(gòu)建其他自身免疫性疾病模型的觀察結(jié)果基本一致[6-7]。本研究在WT結(jié)腸炎小鼠與WT小鼠之間比較發(fā)現(xiàn)，前者的PBMCs和LPMCs中Th17細(xì)胞的比例以及IL-17A和ROR-γt的mRNA和蛋白表達(dá)水平都顯著高于后者，表明在DSS誘導(dǎo)小鼠發(fā)生結(jié)腸炎過程中，數(shù)目和活性增高的Th17細(xì)胞發(fā)揮致病作用，這與MA等[17]的研究結(jié)論基本一致。再將TRAIL-R-/-結(jié)腸炎小鼠與WT結(jié)腸炎小鼠進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，前者的PBMCs和LPMCs中Th17細(xì)胞的比例，以及IL-17A和ROR-γt的mRNA和蛋白表達(dá)水平都顯著高于后者，推測原因可能是：TRAIL-R基因敲除后，TRAIL-R-/-小鼠的PBMCs和LPMCs中活性異常增高的Th17細(xì)胞不能被及時(shí)清除，促炎性Th17細(xì)胞的數(shù)目增多，從而導(dǎo)致DSS誘導(dǎo)的TRAIL-R-/-結(jié)腸炎小鼠較WT結(jié)腸炎小鼠炎癥反應(yīng)更為嚴(yán)重。

圖4 4組小鼠外周血（A、B）和結(jié)腸黏膜固有層（C、D）中Th17相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的的變化

圖5 4組小鼠外周血（A、B）和結(jié)腸黏膜固有層（C、D）中Th17相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平的變化

越來越多的學(xué)者致力于TRAIL/TRAIL-R凋亡信號(hào)對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能及相關(guān)機(jī)制的研究。LI等[18]在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn)腹腔注射DR5受體激動(dòng)劑TRA-8后，小鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀得以明顯緩解，并且引流淋巴結(jié)中Th1和Th17細(xì)胞的數(shù)目減少，IL-17A水平顯著降低。LI等[19]還曾設(shè)計(jì)表達(dá)人/小鼠嵌合型DR5受體的轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠表達(dá)的DR5受體由人DR5的胞外域、小鼠TRAIL-R的跨膜和胞內(nèi)域共同組成。隨后在這種轉(zhuǎn)基因小鼠中構(gòu)建膠原抗體誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型，造模成功后采用特異性人DR5受體的激動(dòng)劑腹腔注射治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀明顯改善，并且在小鼠的關(guān)節(jié)炎滑膜中還觀察到，具有促炎功能的CD11b+Ly-6C+巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。該研究進(jìn)一步證實(shí)此類促炎巨噬細(xì)胞數(shù)量減少與其凋亡增加相關(guān)。IKEDA等[20]在誘導(dǎo)EAE小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，TRAIL-/-小鼠會(huì)更早出現(xiàn)EAE癥狀，且病情更加嚴(yán)重，其機(jī)制可能與TRAIL-/-小鼠中Th1細(xì)胞的凋亡減少有關(guān)。PARK等[21]在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，外源性補(bǔ)充TRAIL治療能上調(diào)小鼠炎性關(guān)節(jié)組織的Caspase 3，誘導(dǎo)Th17細(xì)胞凋亡，進(jìn)而緩解關(guān)節(jié)炎癥。本研究對(duì)結(jié)腸組織中Th17細(xì)胞的凋亡率及Caspase的酶活性進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，相比于WT對(duì)照小鼠，WT結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中Caspase 3和Caspase 8的酶活性水平顯著降低，這與SETIA等[22]在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中的觀察結(jié)果基本相符；繼續(xù)在TRAIL-R-/-結(jié)腸炎小鼠和WT結(jié)腸炎小鼠之間比較發(fā)現(xiàn)，前者的結(jié)腸組織中Th17細(xì)胞凋亡率顯著降低，Caspase 3和Caspase 8 的酶活性水平亦顯著降低，而Caspase 9的酶活性水平在2組間差異無統(tǒng)計(jì)意義差異。理論上，TRAIL與TRAIL-R結(jié)合后首先啟動(dòng)細(xì)胞外凋亡途徑，募集Fas 相關(guān)死亡域蛋白，在細(xì)胞膜上形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物，激活Caspase 8，進(jìn)而啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終以Caspase 3為凋亡執(zhí)行蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷、氧化等因素刺激時(shí)，將激活線粒體參與的細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑，激活Caspase 9，最后亦通過Caspase 3誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。因此，本研究推測TRAIL-R基因敲除可能抑制Caspase 8和 Caspase 3介導(dǎo)的細(xì)胞外凋亡途徑，而不影響Caspase 9參與的細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑，造成炎性腸黏膜組織中具有促炎活性的Th17細(xì)胞凋亡減少，Th17細(xì)胞的數(shù)目和活性增高，從而導(dǎo)致DSS誘導(dǎo)的TRAIL-R-/-結(jié)腸炎小鼠較WT結(jié)腸炎小鼠更為嚴(yán)重。

圖6 免疫熒光技術(shù)檢測小鼠結(jié)腸組織中Th17細(xì)胞凋亡率的變化

圖7 4組小鼠結(jié)腸組織中凋亡蛋白酶活性水平比較

綜上所述，本研究結(jié)果表明，TRAIL/TRAIL-R通路可能通過調(diào)控Th17細(xì)胞的凋亡，影響Th17細(xì)胞的數(shù)目和活性，參與結(jié)腸炎小鼠的發(fā)病機(jī)制。