細(xì)胞因子配體3和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥嚴(yán)重程度相關(guān)性研究

趙東波 王昊 馬育林 何揚(yáng)

1.珠海市人民醫(yī)院/暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 珠海 519000 2.暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510630

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是絕經(jīng)后女性需要面臨的一種重要的代謝性骨病。雖然PMOP的病因尚不完全清楚，雌激素缺乏在PMOP的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。到目前為止，OP主要是根據(jù)股骨近端和腰椎骨密度(bone mineral density， BMD)來(lái)確診[2]。最近，已提出涉及骨轉(zhuǎn)換增加的生化標(biāo)志物作為骨吸收嚴(yán)重程度的潛在指標(biāo)[3]。趨化因子是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞募集的小的可溶性化學(xué)吸引細(xì)胞因子，與細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和增殖以及其他生理活動(dòng)有關(guān)[4]。趨化因子細(xì)胞因子配體3(CCL3)也稱為巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α，是最廣泛研究的趨化因子之一。CCL3是一種具有化學(xué)吸引力的細(xì)胞因子趨化因子，對(duì)樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞具有趨化活性。近年來(lái)，已經(jīng)部分研究了CCL3在骨代謝中的作用。CCL3與其受體趨化因子細(xì)胞因子受體1結(jié)合，通過(guò)下調(diào)骨鈣素(OCN)，與runt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)和osterix(Osx表達(dá))的表達(dá)來(lái)抑制礦化激活，從而抑制成骨細(xì)胞的分化、增殖和成骨潛能[5]。此外，施用抗CCL3抗體可以增加OCN、Runx2和Osx的水平，部分恢復(fù)成骨細(xì)胞的活性[5]。因此，CCL3可能在OP進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，目前血清CCL3水平與OP疾病嚴(yán)重程度之間研究有限。因此，本研究觀察血清CCL3水平和PMOP疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 一般臨床方案

2017年9月至2019年6月，82例PMOP患者納入本研究。所有診斷均基于世界衛(wèi)生組織的OP診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在可能導(dǎo)致低BMD的其他代謝性骨病，如骨軟化、甲狀旁腺功能亢進(jìn)和維生素D缺乏；存在明顯的腎、肝或心血管疾??；使用降鈣素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑或過(guò)去3個(gè)月內(nèi)使用雌激素或過(guò)去6個(gè)月內(nèi)雙膦酸鹽(BP)或糖皮質(zhì)激素。將76名骨量正常的絕經(jīng)后婦女[絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松癥(PMNOP)]和80名育齡婦女(20～49歲)作為對(duì)照組。所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 指標(biāo)檢測(cè)

在禁食過(guò)夜后的上午8:00，抽取靜脈血并快速離心，將樣品保持在-80 ℃條件下直至檢測(cè)完畢。使用定量夾心酶聯(lián)免疫吸附法通過(guò)試劑盒(Quantikine；R&；D Systems，Minneapolis，MN)檢測(cè)血清CCL3的水平。根據(jù)制造商的說(shuō)明設(shè)置空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CCL3的樣品水平。血清白細(xì)胞介素(IL)-6(1∶1 000，Santa Cruz，USA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) (1∶1 000，Santa Cruz，USA)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b) (1∶1 000，Abcam，Cambridge，UK)和1型交聯(lián)的羧基末端端肽(CTX-1) (1∶1 000，Abcam，Cambridge，UK)的水平也使用相同的檢測(cè)方案進(jìn)行測(cè)試。CCL3、IL-6、TNF-α、CTX-1和TRACP-5b測(cè)定間變異系數(shù)分別為3.3%、5.2%、4.0%、3.1%和3.9%；CCL3、IL-6、TNF-α、CTX-1和TRACP-5b測(cè)定內(nèi)變異系數(shù)分別為4.6%、6.6%、6.3%、7.5%和5.3%。所有樣品測(cè)試重復(fù)至少3次。

使用Oswestry殘疾指數(shù)(ODI)和視覺模擬評(píng)分(VAS)評(píng)估臨床癥狀嚴(yán)重程度。使用范圍從0(無(wú)疼痛)到100 mm(最嚴(yán)重的疼痛)的范圍評(píng)估VAS上的評(píng)分。ODI通過(guò)評(píng)估10個(gè)項(xiàng)目的自我管理問(wèn)卷評(píng)估背部特異性功能，每個(gè)項(xiàng)目的點(diǎn)數(shù)范圍為0～5，最終得分總計(jì)在0～100個(gè)點(diǎn)之間。這10個(gè)項(xiàng)目包括疼痛強(qiáng)度、睡眠、站立、坐、走、舉、個(gè)人護(hù)理、旅行、工作和社交生活；分?jǐn)?shù)較高的患者的疾病更嚴(yán)重。

所有受試者的BMD使用雙能量X射線吸收測(cè)定法(Prodigy Advance，General Electric Company，F(xiàn)airfield，CT，USA)檢測(cè)，檢測(cè)的部位包括股骨頸、全髖和腰椎(L1-L4)，檢測(cè)結(jié)果使用g/cm2表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用均數(shù)±準(zhǔn)偏差、中位數(shù)或頻率。用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)評(píng)估數(shù)據(jù)的正態(tài)性。根據(jù)數(shù)據(jù)分布，通過(guò)單向ANOVA或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行PMOP女性，PMNOP女性和健康對(duì)照之間的特征比較。應(yīng)用Bartlett試驗(yàn)檢驗(yàn)組間方差同質(zhì)性，用Tukey或Tamhane檢驗(yàn)進(jìn)行事后分析。通過(guò)Spearman相關(guān)和多元線性回歸分析調(diào)整體重指數(shù)(BMI)和年齡前后血清中CCL3濃度與BMD，臨床嚴(yán)重程度和生化指標(biāo)的相關(guān)性。所有分析均使用SPSS 19.0進(jìn)行，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1描述了所有受試者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征。PMOP組的平均年齡為(65.8±5.1)歲，PMNOP組為(64.9±5.7)歲，對(duì)照組為(44.9±5.0)歲。與PMNOP[(23.9±3.3)kg/m2]和對(duì)照組[(23.6±3.4)kg/m2]相比，PMOP[(24.0±3.0)kg/m2)的BMI沒有顯著差異。PMOP組血清CCL3水平顯著高于PMNOP組[(40.9±15.1)pg/mL vs (24.2±8.7) pg/mL vs (23.9±9.1) pg/mL；P<0.001]。

與PMNOP和對(duì)照組相比，PMOP組股骨頸、腰椎L1～4和全髖的骨密度顯著降低(表2)。進(jìn)一步分析血清CCL3水平以確定它們與PMOP中的BMD的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)較高的CCL3水平與較低的股骨頸BMD(r=-0.329，P=0.003)，較低的總髖BMD(r=-0.345，P=0.002)和較低的腰椎L1-L4的BMD(r=-0.354，P=0.001)相關(guān)。

本研究進(jìn)一步探討了血清CCL3濃度與VAS和ODI臨床嚴(yán)重程度評(píng)分的相關(guān)性，以說(shuō)明CCL3是否與臨床表現(xiàn)有關(guān)。結(jié)果顯示血清中的CCL3水平與VAS(r=0.413，P<0.001)和ODI(r=0.360，P<0.001)顯著相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CCL3與骨吸收標(biāo)志物TRACP-5b(r=0.371，P<0.001)、CTX-1(r=0.317，P=0.004)、TNF-α(r=0.305，P=0.005)以及IL-6(r=0.288，P=0.008)呈正相關(guān)。調(diào)整年齡和BMI后，所有這些相關(guān)性仍然顯著(表3)。多元線性回歸分析表明，CCL3可作為評(píng)估BMD和臨床嚴(yán)重程度的獨(dú)立候選標(biāo)志物(表4)。

表1 絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松癥、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和健康對(duì)照組的人口學(xué)數(shù)據(jù)、生化指標(biāo)和CCL3水平比較

表2 絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松癥、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和健康對(duì)照組中股骨頸、全髖和腰椎的骨密度比較(g/cm2)

3 討論

本研究證實(shí)PMOP的女性骨密度降低的同時(shí)血清CCL3水平則升高，表明這種趨化因子與OP之間存在相關(guān)性；此外，還發(fā)現(xiàn)CCL3水平和VAS和ODI密切相關(guān)；CCL3水平也與IL-6、TNF-α、CTX-1和TRACP-5b密切相關(guān)。這一結(jié)果表明CCL3是PMOP婦女OP進(jìn)展的重要中介因子。

表3 通過(guò)調(diào)整年齡和體重指數(shù)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥女性血清趨化因子細(xì)胞因子配體3濃度與其他指數(shù)的相關(guān)性

表4 多元線性回歸分析年齡、BMI和血清CCL3與BMD、VAS和ODI的相關(guān)性Table 4 Multivariate linear regression for age, BMI, and serum CCL3 with BMD,VAS, and ODI

趨化因子是介導(dǎo)白細(xì)胞和其他表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞的激活和遷移的細(xì)胞因子[6]?；谄浒被┒吮Ｊ氐陌腚装彼釟埢蛄?，有4個(gè)主要的趨化因子亞群，即CXC、CC、C和CX3C[6]。趨化因子在啟動(dòng)破骨細(xì)胞激活和破骨細(xì)胞發(fā)生中是至關(guān)重要的[7]。尤其是CCL3，在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中由RANKL誘導(dǎo)[8]，是誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤中破骨細(xì)胞形成的公認(rèn)因子[5]。CCL3是巨噬細(xì)胞的趨化細(xì)胞因子，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞聚集和活動(dòng)[8]。本研究證明血清CCL3水平與股骨頸、全髖和腰椎L1-L4的BMD降低有關(guān)，表明CCL3可能既誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活動(dòng)，又導(dǎo)致骨量減少。

慢性背痛是PMOP最重要的并發(fā)癥之一。腰背部疼痛在骨質(zhì)疏松癥患者中很常見，高達(dá)10.4%的腰背部疼痛的PMOP患者并未發(fā)現(xiàn)骨折[9]。此外，骨密度降低與椎骨骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，這反過(guò)來(lái)也可能導(dǎo)致慢性疼痛和限制背部運(yùn)動(dòng)[10-11]。用于治療OP(包括BP)的藥物可以通過(guò)作用于破骨細(xì)胞活性來(lái)減輕疼痛。這些發(fā)現(xiàn)表明OP與骨吸收和疼痛密切相關(guān)，骨吸收可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松骨疼痛。CCL3證明可以調(diào)節(jié)疼痛，炎癥組織中CCL3表達(dá)的升高與急性和慢性炎性痛覺過(guò)敏和慢性機(jī)械性過(guò)敏癥密切相關(guān)[12]。此外，在慢性和復(fù)發(fā)性頸痛患者中，隨著炎性細(xì)胞因子的增加，CCL3水平顯著增加[13]。本研究發(fā)現(xiàn)血清中CCL3濃度的增加與VAS和ODI都呈正相關(guān)，這意味著CCL3可能參與了與破骨細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的疼痛。

TRACP-5b作為破骨細(xì)胞活性、破骨細(xì)胞數(shù)量和骨吸收的標(biāo)志物[14]。CTX-1是OP進(jìn)展、骨折風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的參考標(biāo)志物[15]。CTX-1似乎是一種敏感、特異和快速可用的骨吸收生物標(biāo)志物，可以預(yù)測(cè)PMOP患者對(duì)BP治療的反應(yīng)。先前的研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，PMOP患者的CTX-1和TRACP-5b明顯升高，并與BMD呈負(fù)相關(guān)[16]。同時(shí)，雌激素水平下降，炎癥標(biāo)志物如IL-6和TNF-α水平增加，所有這些都加速了骨重塑周期，伴隨著破骨細(xì)胞的強(qiáng)烈激活和更大的骨吸收。本研究發(fā)現(xiàn)血清CCL3水平與升高的CTX-1和TRACP-5b水平呈正相關(guān)；CCL3與IL-6以及TNF-α水平呈正相關(guān)，進(jìn)一步支持CCL3在破骨細(xì)胞活動(dòng)中所起的作用以及骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物。

本研究有一些局限性。首先，本研究設(shè)計(jì)為橫斷面研究，涉及相對(duì)較小的樣本量。第二，未評(píng)估可能參與OP進(jìn)展的其他趨化因子的濃度?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)在PMOP中CCL3水平比健康女性更高。在PMOP中，CCL3水平與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。