熊果酸通過BMP-2/Smad4/Wnt/β-catenin信號通路介導(dǎo)對去卵巢大鼠骨量流失的保護(hù)作用

李潔 孫雅楠 解光越 李斯

1.唐山市工人醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 唐山 063000 2.唐山市工人醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 唐山 063000 3.唐山市工人醫(yī)院骨科，河北 唐山 063000 4.唐山市工人醫(yī)院心內(nèi)科，河北 唐山 063000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是由于雌激素缺乏導(dǎo)致破骨細(xì)胞吸收與成骨細(xì)胞形成之間的不平衡，已成為衰老發(fā)展過程中全球主要的健康問題之一[1]。減少骨吸收或增加骨形成成為治療骨質(zhì)疏松癥的合適策略，旨在恢復(fù)骨骼重塑的正常平衡。目前，臨床上最常用的抗骨質(zhì)疏松藥物是抗重吸收藥，如雙膦酸鹽、地諾單抗等[2]。此外，僅抑制骨吸收顯然是不夠的，特別是對于那些已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重骨量減少的人。因此，非常需要開發(fā)新的治療藥物來治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。大量的研究報(bào)道了許多來自植物的天然化合物可預(yù)防骨質(zhì)疏松大鼠的骨質(zhì)流失。熊果酸(XGS)是藥材中普遍存在的三萜類化合物之一，是人類飲食中不可或缺的一部分。XGS的藥理作用包括抗癌、抗肝損傷、促分化、抗病毒、抗白血病、抗菌和抗侵襲活性[3]。富含XGS的中草藥對嚙齒動物的骨質(zhì)流失具有保護(hù)作用[4]。但是，XGS對去卵巢引起的骨質(zhì)疏松癥的藥理作用仍然未知。這項(xiàng)研究旨在評估XGS對去卵巢引起的骨質(zhì)疏松癥影響及探索可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 研究方案和藥物治療

30只3月齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重200～240 g，批準(zhǔn)號：SCXK2007-007。購于北京實(shí)驗(yàn)動物中心。大鼠飼養(yǎng)在(21±2)℃，濕度為60%～70%，光照/黑暗周期為12 h，可自由接觸食物和水。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，對大鼠進(jìn)行雙側(cè)去卵巢以建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型。將動物分為3組(n=10)：假手術(shù)組(Sham)，去卵巢組(OVX)，去卵巢+熊果酸治療組(XGS)；其中XGS組接受100 mg/kg劑量XGS(分子式：C30H48O3，批號201912，南京迪爾格醫(yī)療技術(shù)有限公司)治療。其中XGS組從術(shù)后第3天開始每天通過管飼熊果酸治療，為期12周。

禁食過夜后采集尿液樣本并通過腹主動脈穿刺采集血液，離心(2 000 r/min，20 min)收集血清。收集的尿液和血清樣本在-80 ℃冰箱保存直至使用。過量麻醉處死大鼠。解剖出雙側(cè)股骨在生理鹽水中解剖固定，-20 ℃保存，采用雙能X線骨密度儀(DEXA)測定骨密度，Micro-CT測定骨小梁微結(jié)構(gòu)，三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)檢測骨強(qiáng)度變化以及蛋白印記檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)。

1.2 骨代謝指標(biāo)檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Quidel，San Diego，USA)測定血清堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)和尿脫氧吡啶啉(DPD)水平。

1.3 骨密度、骨礦物質(zhì)含量和Micro-CT檢測

采用美國GE Healthcare(GE Healthcare)公司的Lunar Prodigy Advance掃描右側(cè)股骨并使用配備的小型實(shí)驗(yàn)動物軟件分析和評估骨密度(BMD，g/cm2)和骨礦物質(zhì)含量(BMC，g)。采用美國GE Healthcare公司的Explore Locus SP型號Micro-CT測量各組右側(cè)股骨遠(yuǎn)端的形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)。使用15 μm3的各向同性體素大小，70 kVp的X射線管峰值電勢，114 mAs的管電流和200 ms的積分時(shí)間進(jìn)行掃描，并進(jìn)行高斯濾波和分段。該區(qū)域包括使用1024×1024矩陣從每個(gè)股骨獲得的350個(gè)圖像，導(dǎo)致各向同性體素分辨率為22 μm3。將感興趣體積(VOI)選為距股骨近端生長板25～125片的區(qū)域。采集股骨的三維(3D)圖像數(shù)據(jù)，體素大小為12 μm，所有特殊方向。根據(jù)二值化VOI直接測定骨體積/總體積(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁間距(Tb.Sp)和骨小梁厚度(Tb.Th)。

1.4 生物力學(xué)檢測

采用858 Mini Bionix材料試驗(yàn)機(jī)(MTS，Eden Prairie，Minnesota，USA)對離體右股骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。股骨水平放置在機(jī)器兩側(cè)支架上面，兩側(cè)支架距離為23 mm，加載方向垂直于骨的中心軸上，加載速度為2 mm/min。通過與試驗(yàn)機(jī)連接的計(jì)算機(jī)專用軟件自動記錄載荷-位移曲線，得到最大載荷和彈性模量。

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析

使用RIPA緩沖液從股骨遠(yuǎn)端組織中分離出總蛋白。用Pierce BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)測定蛋白質(zhì)濃度，將20 μg蛋白通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore Corporation，Billerica，MA)上。將膜在室溫下用5%脫脂牛奶PBS-T緩沖液封閉1 h，然后與第一抗體以1∶1 000的稀釋度孵育2 h，但β-肌動蛋白(1∶5 000)除外。然后將膜與辣根過氧化物酶連接的二抗孵育1 h，并用ChemiImager 5500成像系統(tǒng)(Alpha Innotech Corporation，San Leandro，CA)進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光。Image J軟件用于評估蛋白表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異分析采用單因素方差分析，然后進(jìn)行最低顯著性差異多因素檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMD和BMC改變比較

各組大鼠股骨BMD和BMC檢測結(jié)果如圖1所示，OVX組的BMD和BMC均低于Sham組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；XGS組的BMD和BMC均高于OVX組(P<0.05)。

圖1 各組大鼠BMD和BMC改變Fig.1 BMD and BMC changes in each group注：與Sham組相比，*P<0.05；與OVX組相比，#P<0.05。

2.2 Micro-CT結(jié)果分析

股骨干骺端骨小梁三維重建圖像如圖2 A所示，股骨干骺端的微觀參數(shù)如圖2B～F所示。OVX組左側(cè)股骨BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Sham組明顯降低，而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)。XGS組左側(cè)股骨BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05)，而Tb.Sp則明顯低于OVX組(P<0.05)。

圖2 各組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結(jié)果Fig.2 Micro-CT test results of the metaphysis of the femur in the three groups of rats注：Sham組(a)、OVX組(b)和XGS組(c)；與Sham組相比，*P<0.05；與OVX組相比，#P<0.05。

2.3 股骨的生物力學(xué)變化

股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)表明，OVX組的最大載荷和彈性模量均低于Sham組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，XGS治療12周的大鼠股骨的最大載荷和彈性模量均高于OVX組(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠股骨的三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of the three-point bending test of the femur注：與Sham組相比，*P<0.05；與OVX組相比，#P<0.05。

圖4 XGS治療對骨代謝指標(biāo)的影響Fig.4 Effect of XGS treatment on bone metabolism indexes注：與Sham組相比，*P<0.05；與OVX組相比，#P<0.05。

2.4 骨形成和吸收指標(biāo)改變

治療12周時(shí)，OVX組ALP、OPD和OCN水平明顯升高(P<0.05)；而XGS治療后大鼠的ALP、OPD和OCN水平低于OVX組(P<0.05)。見圖4。

圖5 使用WB檢測BMP-2、Smad4、Wnt 1和 β-catenin的相對表達(dá)Fig.5 Relative expressions of BMP-2, Smad4, Wnt 1, and β-catenin using Western blotting注：與Sham組相比，*P<0.05；與OVX組相比，#P<0.05。

2.5 WB檢測結(jié)果

和Sham組比較，OVX組BMP-2、Smad4、Wnt 1和β-catenin表達(dá)水平明顯下調(diào)，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。和OVX組比較，XGS組BMP-2、Smad4、Wnt 1和 β-catenin表達(dá)水平明顯上調(diào)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

3 討論

在本研究中，XGS治療可以顯著改善由于去卵巢對大鼠骨密度、骨量、骨強(qiáng)度以及骨代謝指標(biāo)影響。在這項(xiàng)研究中，通過大鼠雙側(cè)卵巢切除術(shù)作為骨質(zhì)疏松動物模型。該模型模仿人類絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥，可以誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥的表現(xiàn)[5]。植物化合物具有用于治療或預(yù)防以骨吸收過度為特征的幾種骨疾病的藥理學(xué)應(yīng)用和治療價(jià)值[6]。有研究表明，XGS通過促進(jìn)骨骼形成，抑制骨骼吸收和調(diào)節(jié)骨骼代謝，對小鼠骨質(zhì)疏松癥具有一定的預(yù)防作用[7]。本研究表明，基于3D骨組織形態(tài)分析，XGS可以刺激骨形成，這表明XGS可能是骨質(zhì)疏松癥的潛在治療劑。

有研究表明，XGS能夠預(yù)防去卵巢引起的鈣和磷降低，并降低鈣和磷排泄的增加速率，這可能是由于鈣和磷的腸吸收和腎臟分泌增加所致[8]。DPD在監(jiān)測骨吸收中起著重要作用。ALP和OCN是骨形成的生物標(biāo)志物，從成骨細(xì)胞釋放到血清中并反映了成骨細(xì)胞的活性[9]。這項(xiàng)研究表明，XGS治療12周可顯著降低雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松大鼠骨轉(zhuǎn)換標(biāo)記ALP、OCN和DPD水平。如預(yù)期的那樣，雙側(cè)去卵巢12周導(dǎo)致股骨的BMD明顯降低。同時(shí)，去卵巢手術(shù)12周股骨干骺端骨小梁Tb.N、Tb.Th和TV/BV顯著降低，而Tb.Sp明顯升高，這是松質(zhì)骨丟失的典型變化。盡管XGS治療可以顯著改善上述變化，但無法完全恢復(fù)骨小梁的結(jié)構(gòu)和形態(tài)。

骨質(zhì)流失伴隨著骨骼重塑的顯著增加，這由骨轉(zhuǎn)換標(biāo)記物ALP、OCN和DPD的水平升高所證明。XGS的治療可防止BMD的下降，這與血清ALP、OCN和尿DPD比例的下降有關(guān)。本研究進(jìn)一步使用三點(diǎn)彎曲測試來觀察各組大鼠的骨骼的生物力學(xué)性能變化。在測試各組大鼠股骨的生物力學(xué)性能指標(biāo)，包括最大負(fù)荷和彈性模量。其中，彈性模量是骨骼的內(nèi)在特性的指標(biāo)，而最大載荷是骨骼的外在特性的指標(biāo)[10]。與Sham組相比，OVX組大鼠導(dǎo)致骨骼生物力學(xué)性能下降。與OVX組相比，XGS治療可大大增強(qiáng)其生物力學(xué)性能，這可能是由于維持了小梁的骨骼結(jié)構(gòu)所致?？傊@項(xiàng)研究清楚地證明，去卵巢引起的骨質(zhì)疏松大鼠接受XGS 治療12周可以預(yù)防骨質(zhì)流失和骨小梁微結(jié)構(gòu)的惡化，從而維持骨骼的生物力學(xué)能力。

屬于TGF-β超家族成員的BMP在成骨細(xì)胞分化中具有重要作用[11]。在許多BMPs家族成員中，BMP-2是關(guān)鍵信號，并且在激活后會募集磷酸化的Smad1/5/8與Smad4形成復(fù)合物，然后將其轉(zhuǎn)入細(xì)胞核以激活Runx2的轉(zhuǎn)錄[12]。此外，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)在動物模型中通過增加骨量在調(diào)節(jié)成骨中具有公認(rèn)的作用。當(dāng)被激活時(shí)，Wnts引起一系列下游事件的級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致β-catenin易位進(jìn)入細(xì)胞核，從而啟動許多靶基因的轉(zhuǎn)錄[13]。BMP在成骨調(diào)節(jié)過程中以多種機(jī)制促進(jìn)Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)[14]。本研究中OVX組的BMP-2、Smad4、Wnt 1和 β-catenin表達(dá)顯著降低，而XGS治療后可以顯著上調(diào)BMP-2、Smad4、Wnt 1和 β-catenin表達(dá)，這表明XGS可以激活BMP-2/Smad4/Wnt/β-catenin信號通路來保護(hù)去卵巢大鼠骨量。這些結(jié)果表明，XGS可能是去卵巢誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥的潛在療法。這種作用的分子機(jī)制可能與BMP-2/Smad4/Wnt/β-catenin信號通路激活有關(guān)。