黃勤勤 季峰 鐘佰強 施超枝
1. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化科,浙江 杭州 310000 2. 金華市第五醫(yī)院內(nèi)科,浙江 金華 321000
盡管骨修復(fù)研究取得了重大的進(jìn)步,但在大約10%的骨折中仍出現(xiàn)非正常愈合情況,正常的骨愈合仍然是一個挑戰(zhàn)[1]。骨重塑的過程涉及局部和系統(tǒng)調(diào)節(jié),并受到各種因素的影響,如年齡、既往疾病、吸煙、藥物、糖尿病和飲食[2]。高脂肪飲食(HFD)導(dǎo)致體內(nèi)脂肪積累,出現(xiàn)脂肪細(xì)胞的肥大[3]。富含脂肪的食物在亞洲國家越來越普遍,其對骨愈合的影響近年來也引發(fā)關(guān)注[4]。已有研究[5]報道HFD對骨量有負(fù)面影響,可以增加老年人的鈣排泄、降低骨折的機械強度,導(dǎo)致礦物質(zhì)含量降低和抑制成骨細(xì)胞形成。體脂和骨骼之間的關(guān)系是由脂肪因子介導(dǎo)的,脂肪因子調(diào)節(jié)骨骼重塑和脂肪生成[6]。此外,骨和脂肪之間的穩(wěn)態(tài)反饋在這種關(guān)聯(lián)中也起著重要的作用。身體脂肪的積累也增加了胰島素抵抗的風(fēng)險,導(dǎo)致2型糖尿病,這可能與骨愈合延遲有關(guān)[7]。然而,沒有證據(jù)表明飲食脂肪水平與骨質(zhì)疏松骨缺損愈合之間的關(guān)系。因此,本研究的目的是通過骨質(zhì)疏松骨缺損模型來評估HFD對骨愈合的影響。
56只3月齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠納入本研究,在受控的環(huán)境溫度(22±1)℃和相對濕度45%~50%的條件下隨意飼養(yǎng),水和食物可以自由接觸。自動控制明暗周期約12 h。所有程序均經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。
1.2.1模型建立:通過腹膜內(nèi)注射3%戊巴比妥(劑量為50 mg/kg)麻醉大鼠,并準(zhǔn)備進(jìn)行手術(shù)。OVX組大鼠接受卵巢切除術(shù):雙側(cè)切口是通過腰部背外側(cè)至腰椎腹側(cè)。然后打開腹膜,牽拉出卵巢和包裹脂肪,結(jié)扎子宮角和卵巢血管,并去除卵巢,用可吸收的縫合線封閉切口;Sham組的大鼠接受假手術(shù):卵巢周圍的部分脂肪被去除,但卵巢保留在原處。手術(shù)后用安爾碘皮膚消毒劑對切口部位進(jìn)行3 d的消毒。
1.2.2模型建立和HFD食物喂養(yǎng):切除卵巢的兩只大鼠在麻醉后死亡。其余大鼠隨機分為以下組:假手術(shù)組(Sham,n=18)、卵巢切除模型組(OVX,n=18)、卵巢切除模型組+高脂肪飲食組(OVX+HFD,n=18)。12周后,在大鼠的股骨上進(jìn)行鉆孔。通過腹膜內(nèi)注射40 mg/kg的3%戊巴比妥麻醉大鼠。在右股骨外側(cè)進(jìn)行皮膚切口,并進(jìn)行股四頭肌鈍性解剖以暴露股骨干骺端。然后制作一個直徑1.5 mm 圓形缺損,通過注入鹽水沖洗孔,以從空腔中去除骨碎片,隨后逐層縫合筋膜和皮膚。通過Micro-CT在體外以9 μm的分辨率對鉆孔的局部位置進(jìn)行了評估,以評估其愈合進(jìn)度。Sham組和OVX組大鼠食用的食物是根據(jù)美國營養(yǎng)學(xué)會(AIN-93G)的建議[8]生產(chǎn)的,OVX+HFD組大鼠食用一種改良的AIN-93G飲食,其中飽和脂肪的熱量含量為60%。每周測量大鼠的體重和每組的采食量。
1.2.3樣本的收集:三組大鼠分別在缺損術(shù)后第2周(n=9)和4周(n=9)處死一部分標(biāo)本。收集雙側(cè)股骨和血清標(biāo)本。使用ELISA試劑盒(Cusabio,武漢)評估血清雌二醇(E2)水平。根據(jù)制造商提供的協(xié)議使用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(南京建城生物工程研究所),通過標(biāo)準(zhǔn)比色法分析血清中堿性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的濃度。在680型酶標(biāo)儀(Bio-rad Corp,費城,賓夕法尼亞州,美國)上測量吸光度。
1.2.4使用微計算機斷層掃描(Micro-CT; YXLON International GmbH,德國)評估HFD對OVX大鼠骨缺損愈合的影響:使用VG Studio 2.1 V軟件(版本2.6)對股骨進(jìn)行掃描,并用X射線對18 μm(像素)處的管電壓為80 kV且電流為60 μA的X射線進(jìn)行成像。通過使用CT分析儀軟件繪制定制輪廓來提取皮質(zhì)骨。獲得骨密度(bone mineral density, BMD)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、小梁數(shù)(Tb.N),小梁分離度(Tb.Sp)來自于Micro-CT的3D渲染圖像。
1.2.5三點彎曲試驗測量外在和內(nèi)在生物力學(xué)材料特性:在材料測試系統(tǒng)(MTS-858,MTS system Inc.,Minneapolis,MN,USA)下對解凍后的右股骨進(jìn)行機械測試。在中軸施加載荷,兩個支撐件之間的中點相距10 mm。以2 mm/min的恒定速度記錄載荷位移曲線和變化力,直到發(fā)生骨折。用游標(biāo)卡尺測量骨折處股骨的內(nèi)外寬和高度。最大載荷、線性斜率、彈性模量、能量吸收直接由載荷變形曲線確定。
1.2.6股骨缺損部位組織基因分析:使用EASYspin Plus骨組織RNA試劑盒(Aidlab;中國)從股骨中分離總RNA。使用CFX96實時PCR檢測系統(tǒng)(BIO-RAD Laboratories,Hercules,CA,美國)分析基因的表達(dá)。使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Invitrogen;美國)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用Light Cycler 480 SYBR Green I Master試劑盒(Bio-rad;美國)進(jìn)行RT-qPCR以定量mRNA樣品和重塑標(biāo)記的表達(dá)。以45個循環(huán)進(jìn)行擴增反應(yīng)(95 ℃持續(xù)10 min;95 ℃持續(xù)15 s;60 ℃持續(xù)1 min;72 ℃持續(xù)30 s)。甘油-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)被用作管家基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化?;虮磉_(dá)的相對變化通過2 Ct法分析。所有實驗至少重復(fù)三遍。指定使用的引物如下:Wnt1的GTT TAC GCC ATC TCC TCA GC(正向)和GGT ACC TTT GCT GTC CTT GC(反向),TCT TTG GAG CCA CCG ATT A(正向)和TTT CCA CCA ACT GAT CCA GSK-3β的CA(反向),Smad 3的GAG ACA TTC CAC GCT TCA CA(正向)和GCT GCA TTC CGG TTA ACA TT(反向),CCA GGT CTC TTG ATG GTC GT(正向)和GCG TAT TCG CAG TTC Smad 2的TCG AT(反向),CTT ACG GCA ATC AGG AAA GC(正向)的TCG AT(反向)和β-catenin的TCA GCA CTC TGC TTG TGG TC(反向),CGA CTG TTA GAA CTC CCT CA(正向)和CAT TGG GGG TAG GAPDH的GAA CAC(反向)。
結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析評估三組之間是否存在差異,一旦檢測到之間存在顯著差異,則使用Tukey’s多重比較檢驗來確定每兩組之間的顯著性。P<0.05表示比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
血清E2的檢測為了觀察HFD是否影響大鼠血清激素表達(dá)(圖1a)。與Sham組相比,OVX和OVX+HFD組的血清E2水平均顯著降低(P<0.05)。血清ALP和TRAP的活性如圖1b、圖1c所示,OVX組的血清TRAP濃度顯著高于Sham組(P<0.01),但與OVX組相比,OVX+HFD組明顯降低(P<0.01)。此外,與Sham組相比,OVX+HFD組的血清ALP濃度顯著低于Sham和OVX組(P<0.05)。
圖1 HFD對血清E2、ALP和TRAP水平的影響 a:E2;b:ALP;c:TRAP。注:與Sham組相比,**P<0.01;與Sham組相比,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01。Fig.1 Effect of HFD on serum E2, ALP, and TRAP levels
進(jìn)行Micro-CT分析以檢測骨缺損部位的愈合。HFD治療對大鼠股骨缺損部位修復(fù)影響的Micro-CT二維和三維圖像如圖2所示,對缺損后2周和4周的損傷皮層骨進(jìn)行了定量分析。Micro-CT 3D圖像顯示,與Sham組大鼠相比,OVX組大鼠的小梁骨少、小梁結(jié)構(gòu)紊亂、小梁骨間隙擴大和分離度增加。OVX組大鼠的BMD、Tb.N、Tb.Th和BV/TV明顯低于Sham組大鼠,而OVX組Tb.Sp明顯高于Sham組大鼠。OVX+HFD組的BMD、Tb.N和Tb.Th顯著低于OVX組,而Tb.Sp則明顯高于在OVX組。
圖2 Micro-CT觀察HFD對去卵巢大鼠股骨缺損愈合指標(biāo)的影響注:與Sham組相比,**P<0.01;與Sham組相比,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01。Fig.2 Micro-CT to observe the effect of HFD on the healing index of femoral defect in ovariectomized rats
進(jìn)行三點彎曲測試以測試大鼠股骨的生物力學(xué)性能改變。去卵巢大鼠的力學(xué)性能明顯降低,表明為極限載荷、剛度、能量吸收和彈性模量均顯著低于Sham組大鼠(P均<0.05)。然而,HFD干預(yù)后明顯降低了去卵巢大鼠骨缺損部位的極限載荷、剛度、能量吸收和彈性模量(P均<0.05)。見表1。
表1 HFD對去卵巢大鼠股骨力學(xué)性能的影響(n=6,每組)
進(jìn)一步檢測Smad2、Smad3、Wnt1、GSK-3β和β-catenin的mRNA表達(dá)。如圖3所示,與Sham組相比,OVX組中Smad2、Smad3和GSK-3β的mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01);與OVX組相比,OVX + HFD組Smad2、Smad3和GSK-3βmRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01),OVX組的Wnt1和β-catenin的mRNA表達(dá)低于Sham組(P<0.01)。然而,與OVX組相比,OVX+HFD組中的Wnt1和β-cateninmRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。
本研究觀察了HFD對去卵巢大鼠骨缺損愈合及BMD的影響。研究發(fā)現(xiàn),HFD可以顯著降低去卵巢大鼠股骨骨缺損愈合速度而且影響缺損部位骨強度;同時影響骨重建過程中反映成骨、破骨活性的ALP和TRAP水平。
HFD與肥胖發(fā)展相關(guān)[4]。此前,人們認(rèn)為肥胖對骨骼是有有益的,因為機械負(fù)荷的增加刺激了骨的形成[9]。這一假設(shè)得到了骨適應(yīng)以保持最佳大小和特性以支持特定載荷論點的支持[9]。然而,最近的報道[10]表明,體重增加可能與骨量呈負(fù)相關(guān),脂肪細(xì)胞分化和成骨細(xì)胞分化之間可能存在競爭效應(yīng),因為它們具有共同的祖細(xì)胞。有學(xué)者[11]研究觀察到HFD引起體重增加并不能減輕骨丟失。雖然外部負(fù)荷被認(rèn)為是骨形成的積極刺激[11],但脂肪積累并不能防止骨丟失。脂肪組織不是具有儲存能量的唯一功能的惰性器官;它具有代謝功能,分泌與骨代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)。
圖3 HFD對大鼠股骨Wnt信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響注:與Sham組相比,**P<0.01;與Sham組相比,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01。Fig.3 Effect of HFD on the expression of Wnt signaling pathway-related genes in rat femurs A:Smad3;B:Wnt1;C:GSK-3β;D:β-catenin。
事實上,HFD對內(nèi)分泌刺激比機械刺激對骨代謝的影響更大。有證據(jù)[12]表明HFD可以引起生長小鼠骨結(jié)構(gòu)的負(fù)改變。此外,由于接受HFD的大鼠可能具有骨脆性,創(chuàng)傷性骨折可產(chǎn)生不同組間的骨碎裂。在本次研究中,與OVX組和Sham組大鼠相比,HFD大鼠股骨缺損部位的最大載荷較低,說明其生物力學(xué)性能受到損害。不平衡的重塑可以影響骨結(jié)構(gòu)、質(zhì)量和強度[13],因此,形態(tài)學(xué)研究與力學(xué)試驗相補充,可以更廣泛地了解骨質(zhì)量方面及其抵抗骨折的能力[14]。HFD降低了缺損部位修復(fù)進(jìn)程,也降低了與生物力學(xué)特性相關(guān)的骨骼強度。HFD喂養(yǎng)的去卵巢大鼠的骨骼中極限負(fù)荷較低,而BMD也在降低。在HFD喂養(yǎng)的大鼠的骨缺損部位觀察到骨形成降低的趨勢。
Wnt/β-catenin信號通路與成骨分化的刺激、骨形成和骨質(zhì)疏松的預(yù)防密切相關(guān)[15]。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵步驟是通過誘導(dǎo)GSK-3β磷酸化來破壞細(xì)胞質(zhì)GSK-3β復(fù)合物,隨后抑制β-catenin磷酸化,從而穩(wěn)定β-catenin[16]。同時,累積的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核并激活Wnt靶基因的表達(dá)[17]。在本研究中,HFD促進(jìn)了GSK-3β的表達(dá),HFD的存在抑制了β-catenin的表達(dá)。GSK-3β的表達(dá)明顯被HFD上調(diào),表明Wnt /β-catenin信號被HFD滅活。去卵巢手術(shù)后Wnt/β-catenin信號被顯著抑制,其中的β-catenin和Wnt1表達(dá)較Sham組明顯降低;而HFD干預(yù)后發(fā)現(xiàn)β-catenin和Wnt1表達(dá)進(jìn)一步降低且修復(fù)效果進(jìn)一步降低;這些結(jié)果表明HFD可以通過抑制Wnt /β-catenin信號傳導(dǎo)來抑制骨缺損愈合。
當(dāng)然本研究也存在不足之處。首先,研究時間較短,樣本數(shù)量較少;其次,使用高脂肪飲食的方案系參考先前的研究,因此對研究結(jié)果可能有影響;最后,僅初步探討了HFD對骨質(zhì)疏松骨缺損愈合及對Wnt/β-catenin信號的影響,但具體機制及HFD和骨愈合之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步探索。
總的來說,本研究表明了HFD對骨質(zhì)疏松狀態(tài)下骨缺損愈合有負(fù)面影響,而這種影響可能是通過對Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)抑制來實現(xiàn)的。