特發(fā)性膜性腎病靶抗原PLA2R抗原表位的研究進展①

陳施曉 劉建華 秦曉松

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院,沈陽110004)

膜性腎病(membranous nephropathy，MN)是成人腎病綜合征的常見病理類型之一。在我國，MN在原發(fā)性腎小球疾病中的患病率倍增，其中約80%為特發(fā)性MN(idiopathic MN，IMN)[1]。此外，兒童腎病綜合征中MN患者比例亦呈逐年上升趨勢[2]。30%～40%的IMN患者最終可發(fā)展為終末期腎臟疾病[3,4]；MN也是腎臟移植后疾病復發(fā)的主要原因之一[5]。作為一種自身免疫性疾病，靶抗原對應的抗體在IMN的發(fā)病機制應中起關(guān)鍵作用，因此，尋找IMN的靶抗原一直是該領(lǐng)域的研究熱點。2009年Beck等[6]研究指出,M型磷脂酶 A2 受體 (M-type phospholipase A2 receptor，PLA2R)為IMN的靶抗原，并表示70%IMN患者為PLA2R相關(guān)性IMN；2014年Tomas等[7]在抗PLA2R抗體血清學陰性患者中發(fā)現(xiàn)了另一種靶抗原，即1型血小板反應蛋白7A域(thrombospondin type-1 domain-containing 7A，THSD7A)，約占IMN的2.5%～7.5%。這些開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)使靶抗原的相關(guān)檢測技術(shù)，尤其是PLA2R，在臨床中對IMN的診治指導、疾病監(jiān)測及預后判斷等方面迅速地開展[8-10]。抗原抗體的特異性結(jié)合反應僅發(fā)生在某個特定的免疫區(qū)域，即抗原表位，又名抗原決定簇，各種免疫細胞通過結(jié)合和識別抗原表位以發(fā)揮免疫效應、激發(fā)免疫應答，自身抗體與抗原表位結(jié)合可誘發(fā)自身免疫性疾病[11]。對IMN的主要靶抗原PLA2R的抗原表位進行深入認識，有助于理解IMN的免疫發(fā)病機制及病理生理，同時也有助于開發(fā)新型IMN的治療干預措施，如表位特異性治療。

1 PLA2R

PLA2R為甘露糖受體家族的一員，其相對分子量為180 kD，包含胞外段、跨膜段及胞內(nèi)段3部分。其中胞外段從N端到C端又可依次分為1個胱氨酸富集區(qū)域(cysteine-rich ricin domain，CRD)、1個Ⅱ型纖維連接蛋白區(qū)域(fibronectin type Ⅱ domain，F(xiàn)NⅡ)及8個串聯(lián)的C型凝集素樣區(qū)域(C-type lectin domain，CTLD)，見圖1，每個相鄰結(jié)構(gòu)域之間分別由少于10個氨基酸組成的肽鏈相連接。其中，CRD可結(jié)合內(nèi)源性糖蛋白上硫酸化的碳水化合物。FNⅡ的分子結(jié)構(gòu)最為保守，具有結(jié)合及清除膠原蛋白的作用。PLA2R可在FNⅡ的介導下與膠原蛋白Ⅰ及Ⅳ結(jié)合，這可能為PLA2R相關(guān)性MN產(chǎn)生蛋白尿的機制之一[12]。Ⅳ型膠原蛋白是腎小球基底膜與腎小球細胞外基質(zhì)的主要成分，體外試驗結(jié)果顯示，anti-PLA2R可以抑制足細胞產(chǎn)生膠原蛋白Ⅳ，Ⅳ型膠原蛋白是否為anti-PLA2R攻擊靶點仍需進一步研究[13]。CTLDs能夠被90%的anti-PLA2R所識別，其中CLTD5為分泌型磷脂酶A2(secreted phospholipase A2，sPLA2)的關(guān)鍵結(jié)合部位[12]。作為PLA2R的天然配體，sPLA2-ⅠB在人體內(nèi)可通過結(jié)合PLA2R促使足細胞呈時間和劑量依賴性的功能下降及凋亡，這一行為可能是通過活化ERK1/2-cPLA2α-AA-p53信號通路發(fā)生的[14]。PLA2R在不同物種、不同器官中均有不同程度的表達，但其在人類足細胞中表達最高，而在其他大多數(shù)物種的足細胞中并不表達。目前，已證實PLA2R具有調(diào)控衰老、促炎、抑癌、基質(zhì)黏附及結(jié)合內(nèi)化膠原和纖連蛋白作用，但并未發(fā)現(xiàn)這些功能與PLA2R誘發(fā)的IMN存在明確關(guān)系，而在嚙齒類動物中，缺乏PLA2R的足細胞仍能形成完全健康的腎小球濾過屏障，這一事實支持了PLA2R在人類中可能存在多余的功能，使IMN易感者更容易發(fā)生自身抗體介導的損傷[15]。

2 Anti-PLA2R

多數(shù)研究認為anti-PLA2R為IMN的致病性抗體[16]。PLA2R和THSD7A這兩種靶抗原的相應抗體的主要抗體亞型均為IgG4。體外實驗證明anti-PLA2R IgG4的Fc結(jié)構(gòu)域上缺少半乳糖殘基，使得甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)能直接結(jié)合IgG4并激活C4[17]。通過激活MBL途徑，最終形成攻膜復合物損傷腎小球基底膜，導致蛋白尿形成。Pozdzik等[18]在MN小鼠模型中發(fā)現(xiàn)足細胞會逐漸表達氧化應激分子(如超氧化物歧化酶)，提示anti-PLA2R可初始攻擊足細胞，誘導胞內(nèi)氧化應激和細胞因子表達，從而引發(fā)二次損傷；同時細胞質(zhì)的抗原可遷移至細胞膜引起相應免疫反應，導致新的自身抗體產(chǎn)生，造成新的損傷。鑒于其致病性，anti-PLA2R的滴度水平在臨床上認為與疾病的活動性有關(guān)，并被大多數(shù)研究所證實[6,8-10]。

2019年改善全球腎臟病預后組織(KDIGO)在對腎小球腎炎的治療方面建議定量檢測抗PLA2R抗體的動態(tài)變化，以用于診斷和監(jiān)測MN的疾病活動程度[19]。

3 PLA2R的抗原表位

在靶抗原PLA2R被證實后，明確PLA2R抗原表位隨即成為研究熱點之一。在Beck等[6]的研究中，anti-PLA2R僅與非還原狀態(tài)的PLA2R相結(jié)合，提示其抗原表位主要為構(gòu)象表位，且二硫鍵對維持其表位的穩(wěn)定狀態(tài)具有關(guān)鍵作用，這與甘露糖受體家族成員的特性相一致[12]。Behnert等[20]通過肽陣列的表位作圖方法在85名血清學陽性的IMN患者中篩選出7個可能的線性表位(1個在CRD、1個在CTLD1、1個在CTLD2、2個在CTLD6、2個在CTLD8)，并運用ELISA及激光免疫磁珠分析法驗證，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)這些線性表位在IMN患者與正常人或其他腎臟疾病患者間存在差異，提示需要形成構(gòu)象表位才能具有免疫反應性，進一步說明PLA2R抗原表位主要是構(gòu)象表位，即B細胞表位。PLA2R的胞外段共含有56個內(nèi)源性半胱氨酸，鏈間二硫鍵形成形式可改變PLA2R的三維構(gòu)象，而胞外段的每個結(jié)構(gòu)域都可能存在二硫鍵，則PLA2R的構(gòu)象表位可由單個或多個胞外結(jié)構(gòu)域在折疊構(gòu)象而成[21]。但該結(jié)果是否囿于當時技術(shù)水平，PLA2R的T細胞表位仍有待進一步研究，且由于所選取的肽陣列技術(shù)篩選出的抗原表位肽鏈較短，無法形成合適的空間結(jié)構(gòu)等原因，不能排除線性構(gòu)象表位可能。

最近，PLA2R抗原表位探索進程取得了突破性進展。2015年，Kao等[21]運用完整的PLA2R胞外結(jié)構(gòu)研究其抗原表位，結(jié)果提示抗原表位位于CRD-FnⅡ-CTLD1區(qū)域，可能是一種PLA2R相關(guān)MN的通用抗原。其中，F(xiàn)nⅡ與CTLD1間存在鏈間二硫鍵，但完整的構(gòu)象表位需要CRD、FnⅡ、CTLD1等三個結(jié)構(gòu)域共同組成。CRD與CTLD1可能與抗體識別有關(guān)，而FnⅡ可能在構(gòu)象的形成及維持中發(fā)揮重要作用。同年，F(xiàn)request等[22]將表位進一步定位于CRD結(jié)構(gòu)域的1條31肽中，并指出CRD結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在1個鏈間二硫鍵，其連接與斷裂隨即影響31肽功能。使用冷凍電鏡解析及單顆粒技術(shù)構(gòu)建的PLA2R三維結(jié)構(gòu)模型的平面形象與希臘字母“π”相似，并指出該抗原的主要表位定位于CRD結(jié)構(gòu)域形成的β折疊三葉草結(jié)構(gòu)中，anti-PLA2R主要與PLA2R、CRD及CTLD3相結(jié)合。Frequest等[22]研究發(fā)現(xiàn)pH值的改變與PLA2R構(gòu)象改變有關(guān)，而最近Dong等[23]、Yu等[24]也證實了這一結(jié)果。但PLA2R構(gòu)象改變并未對PLA2R與anti-PLA2R結(jié)合造成影響，這可能與一個或多個疾病的序列變異及多態(tài)性有關(guān)，可能會影響含有PLA2R的內(nèi)體形成、運輸及抗原提呈。

圖1 PLA2R分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Illustrative structural diagrams of PLA2R

以上兩項研究使用方法不同，但都將PLA2R的主要顯性表位指向了其胞外段靠近N端部分，尤其是CRD結(jié)構(gòu)域。Kao等[21]研究表明CRD-FnⅡ-CTLD1能夠與完整的PLA2R分子免疫活性相當，若缺少了CRD-FnⅡ-CTLD1，其余的結(jié)構(gòu)域?qū)⑹ッ庖呋钚浴request等[22]還發(fā)現(xiàn)，10%的PLA2R陽性血清并不與所確定的抗原表位結(jié)合，提示在更靠近C端的胞外段結(jié)構(gòu)中可能存在1個或多個表位，同時也不能排除其發(fā)生表位擴展的可能。而Kao等[21]的究并未發(fā)現(xiàn)含風險基因的PLA2R與野生型PLA2R對anti-PLA2R的親和力存在差異，提示在IMN發(fā)病過程中，PLA2R基因多態(tài)性可能只起到一部分致病作用[25]。有趣的是，F(xiàn)request等[22]所發(fā)現(xiàn)的31肽中包含了一段九肽片段與細菌細胞壁具有完全同源性，這其中可能存在潛在的分子模擬所誘發(fā)自身免疫反應，也許與A族溶血性鏈球菌感染致病機制相似，但目前尚未有IMN患者腎臟以外的器官出現(xiàn)PLA2R損傷相關(guān)報道。

腫瘤相關(guān)性MN的anti-PLA2R抗體亦可呈陽性。MN的病理診斷常在明確腫瘤診斷的一年前進行[26]。提示IMN可能可以同時合并腫瘤相關(guān)性MN，因此可在IMN發(fā)病后持續(xù)監(jiān)測患者是否存在腫瘤等疾病的風險。腫瘤所釋放的抗原可以在腎小球上形成循環(huán)免疫復合物沉積，在適當?shù)拇笮〖半姾上?，腫瘤抗原可沉積在上皮并隨即誘發(fā)抗原抗體反應。機體可能產(chǎn)生與內(nèi)源足細胞抗原相似或具有類似于內(nèi)源足細胞抗原表位的抗體，其與內(nèi)源性足細胞抗原相結(jié)合可導致原位免疫復合物形成，這一機制已在THSD7A相關(guān)MN中被證實，該機制是否可以同樣應用于PLA2R相關(guān)性MN仍有待進一步研究[27]。

4 PLA2R抗原表位擴展

一直以來，人類對IMN發(fā)病機制的認識來源于Heymann腎炎模型的探索，有研究指出Heymann腎炎可隨病程延長出現(xiàn)表位擴展現(xiàn)象，且與蛋白尿的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，促使學者思考是否IMN疾病的發(fā)生發(fā)展間也存在表位擴展現(xiàn)象[28]。2016年，Seitz-Polski等[29]對69名IMN患者進行表位篩查后指出，CRD是疾病中首先應答的免疫顯性表位，隨后可擴展至CTLD1及CTLD7。僅有CRD表位應答時，IMN病情穩(wěn)定、臨床癥狀輕，隨著免疫應答過程持續(xù)存在，可發(fā)生表位拓展；當表位拓展至CTLD7時，蛋白尿程度則明顯加重。隨訪發(fā)現(xiàn)，CRD表位擴展是IMN患者不良預后的獨立危險因素，當病情緩解時，抗CTLD1抗體及抗CTLD7抗體水平有所下降，這不僅解釋了抗PLA2R滴度反映患者病情的原因，還提示可通過檢測是否出現(xiàn)表位擴展及其相對應抗體滴度來檢測PLA2R相關(guān)IMN患者的預后及治療效果。Cui等[30]在一項關(guān)于IMN與MHCⅡ類分子相關(guān)研究中指出，CTLD1、CTLD4與CTLD5及CTLD7間存在抗原表位，且編碼CTLD7序列中含有2個IMN風險基因，在一定程度上解釋了當表位擴展至CTLD7時患者病情加重的原因。

Seitz-Polski 等[31]在此基礎(chǔ)上對PLA2R表位擴展與臨床IMN患者預后間關(guān)系做出了進一步研究，結(jié)果表明，表位擴展這一指標比血清高滴度anti-PLA2R更能提示IMN不良預后，是1個較為理想的病情活動指標，由于該項研究所含樣本量較小，需要更多的證據(jù)支撐以上論點，表位擴展使IMN患者病情加重的免疫機制尚未明確。在能夠廣泛使用的具有表位特異性的anti-PLA2R尚未被研發(fā)出來之前，患者是否出現(xiàn)表位擴展目前只能依靠血清學中是否出現(xiàn)了高滴度的anti-PLA2R來判斷。另外，Seitz-Polski等[31]在PLA2R表位擴展所研究的是循環(huán)中的抗體，而IMN作為一種器官特異性自身免疫病，血清抗體與腎組織的抗體是否具有一致性仍需進一步探討[32]。雖然表位擴散對理解IMN病情的緩解或加重提供了相對合理的解釋，但同時意味著治療IMN不能僅針對免疫優(yōu)勢表位進行干預。Degn等[33]提出，當機體檢測到抗原時，會激活B細胞生發(fā)中心產(chǎn)生大量抗體，其中不僅包含對初試抗原的“最優(yōu)”抗體，還可能包含了能夠攻擊自身其他組織的抗體，即自身抗體，或進一步產(chǎn)生相近的自身抗體，這可能是表位擴展發(fā)生的原因之一，而直接阻斷B細胞生發(fā)中心將有望阻斷這一表位擴展進程，控制病情。鑒于其具有定量及高通量的優(yōu)點，目前anti-PLA2R檢測主要是以ELISA為主，其主要是使用HEK29表達PLA2R 1型異構(gòu)體的胞外結(jié)構(gòu)域作為抗原，具有高特異性，但靈敏度較低，波動較大[34]。有實驗根據(jù)表位擴展位點制備出多表位診斷性融合抗原R101蛋白用于anti-PLA2R特異性ELISA的血清學檢測，靈敏度、特異性均有所提高，理論上可有效降低抗體制備成本[35]。

5 PLA2R抗原表位與遺傳易感性

近年來不斷有研究表示遺傳學因素在IMN發(fā)病中起到不可忽視的作用。一項關(guān)于PLA2R的全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)IMN與人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)Ⅱ類抗原密切相關(guān)[36]；單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與IMN的易感性有關(guān)，并指出2個最重要的等位基因：PLA2R基因及HLA-DQA1基因，提示這兩種等位基因的遺傳變異可能促使自身抗體的形成。PLA2R1的基因突變改變了PLA2R受體蛋白的表達，使內(nèi)源性抗原表位暴露從而影響其抗原性，并作為外源性受體，被抗原提呈細胞攝取、加工，改變抗原-肽處理模式，促使PLA2R蛋白與MHCⅡ類受體相結(jié)合[37]；同時，HLA基因突變可改變MHCⅡ類受體的蛋白構(gòu)象形成更合適的PLA2R表位結(jié)合位點，進而激活CD4+T細胞，輔助anti-PLA2R形成及進一步誘導PLA2R構(gòu)象改變從而暴露隱藏表位，發(fā)生表位擴展，進一步激活各種免疫途徑，誘導MN發(fā)生[38]。目前已發(fā)現(xiàn)多個與IMN易感性相關(guān)的SNP位點。PLA2R1基因中最重要的SNP位點為rs4664308，該位點的變異不能導致PLA2R序列發(fā)生變化，但其與另一位點rs3749117存在連鎖不平衡，而rs3749117位點變異可導致PLA2R受體CTLD1區(qū)的氨基酸(M292V)發(fā)生非同義突變，并使PLA2R受體發(fā)生結(jié)構(gòu)變化[36]。但在Cui等[30]研究結(jié)果中，模擬PLA2R基因突變對PLA2R對T細胞表位預測結(jié)果影響不大，提示基因突變不能完全解釋IMN的發(fā)病機制，可能存在其他致病因素同時存在誘發(fā)IMN，如“二次打擊”學說中所提及遺傳易感個體中存在腎源性自身免疫反應的基礎(chǔ)，而環(huán)境因素可能是疾病發(fā)生的另一發(fā)病基礎(chǔ)，有研究表明空氣污染、汞中毒、幽門螺桿菌感染及錳的職業(yè)暴露等也與IMN的疾病發(fā)展相關(guān)[39-41]；特定的基因-環(huán)境相互作用的特點強調(diào)了診治IMN需要早期可靠、穩(wěn)定的檢測手段。

6 展望

目前，對于IMN靶抗原PLA2R主要顯性表位大致確定在其胞外段N端，也初步明確PLA2R相關(guān)IMN中存在免疫擴展現(xiàn)象。但PLA2R如何作為靶抗原誘導IMN產(chǎn)生的免疫機制，anti-PLA2R是作為IMN的發(fā)病啟動因子之一或是下游產(chǎn)物；anti-PLA2R是如何與抗原表位相結(jié)合；遺傳因素是如何影響PLA2R抗原表位的形成、暴露及抗體形成；既然表位擴展與疾病的發(fā)展、預后相關(guān)，那么表位擴展是否可能作為IMN的始發(fā)病因之一；阻斷上游表位或阻斷相關(guān)B細胞生發(fā)中心是否阻斷IMN疾病進展；雖然能夠影響表位擴展的因素十分復雜，但是否可以通過大量臨床研究制定表位擴展的時間節(jié)點，適時使用免疫治療或靶向治療等問題仍需解決。隨著的PLA2R抗原表位認識的加深，更具有特異性的anti-PLA2R將在IMN臨床診斷中大放異彩，同時，可制定基于表位或起始表位的靶向治療方案。未來有望在對PLA2R分子結(jié)構(gòu)的更進一步認識的基礎(chǔ)上，研發(fā)新型口服非肽類PLA2R拮抗劑以阻斷其抗原-抗體反應，延緩IMN病情發(fā)展。

PLA2R抗原表位在IMN診治的各個步驟的研究前景樂觀，已逐漸成為國內(nèi)外臨床診治IMN的參考指標之一，如今在anti-PLA2R滴度測定等方面取得突破性進展，但國外對PLA2R抗原表位及表位擴展等的研究成果均未在中國得到證實，國內(nèi)相關(guān)研究尚處于起步階段，有待進一步深入。