棕櫚酸誘導(dǎo)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞M1型極化①

張焱皓 劉芊伊 馮繼紅 李 茂 劉利萍 秦 歡 羅軍敏

(遵義醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，貴州省免疫分子應(yīng)用研究工程中心，遵義563003)

巨噬細(xì)胞是組織動(dòng)態(tài)平衡和炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵細(xì)胞，發(fā)揮基本的組織特異性功能并保護(hù)機(jī)體免受感染。巨噬細(xì)胞因所處微環(huán)境中細(xì)胞因子、微生物及其產(chǎn)物和其他刺激物極化為特定表型，根據(jù)刺激物的不同，IFN-γ激活的巨噬細(xì)胞被定義為經(jīng)典激活型巨噬細(xì)胞(M1)，IL-4激活為替代激活型巨噬細(xì)胞(M2),且M2型巨噬細(xì)胞可細(xì)分為M2a、b、c[1-3]。M1型巨噬細(xì)胞具有促炎特性，高表達(dá)炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-12、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase 2，iNOS或NOS2)等，具有殺滅病原體及抗腫瘤功能；而M2型巨噬細(xì)胞膜表面高表達(dá)CD206，分泌大量轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、IL-10、炎癥區(qū)域分子1(found in inflammatory zone 1，F(xiàn)izz1)、類幾丁質(zhì)酶3樣分子3(chitinase 3-like 3，Chi3L3或YM-1)等細(xì)胞因子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織修復(fù)[4]。受病原體及腫瘤微環(huán)境影響，巨噬細(xì)胞以M2型為主，分泌抑炎細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫抑制作用，導(dǎo)致病原菌感染或腫瘤進(jìn)展。因此，調(diào)控免疫抑制狀態(tài)下巨噬細(xì)胞的極化表型尤其重要。棕櫚酸(palmitic acid，PA)是脂肪生成過(guò)程中產(chǎn)生的脂肪酸。研究表明中草藥中也含有PA，在昆侖雪菊花中PA占比達(dá)9.71%，在黃蜀葵子中占比約為5.88%，在貓爪草中占比為2.64%[5-7]。陳冬梅等[8]發(fā)現(xiàn)黨參中提取的PA具有免疫活性，作用于TNF及IL-10發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。大量研究表明，PA是一種致炎能力極強(qiáng)的脂肪酸，常用于構(gòu)建體外脂毒性損傷模型[9-11]。因此作為中草藥中常見(jiàn)的單體成分，有必要了解PA對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞的功能影響，明確其作用機(jī)制。本研究通過(guò)將PA配制為水溶液，將其直接加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化，觀察BMDM受誘導(dǎo)后的極化表型，并探討PA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 6～10周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)于重慶市第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室清潔級(jí)動(dòng)物房。PA購(gòu)于Sigma公司，純度≥99%。小鼠重組GM-CSF購(gòu)于NOVUS。RNAisoTMPlus、PrimeScriptTMRT Reagent Kit(RR037A)、SYBR Premix Ex Taq Real-time PCR 購(gòu)于TaKaRa。Cell Counting Kit-8購(gòu)于東仁化學(xué)科技(上海)有限公司。分析純氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等購(gòu)于重慶川東化工公司。DMEM低糖培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco，胎牛血清購(gòu)于MRC。引物購(gòu)于上海生物工程有限公司。APC 標(biāo)記的抗小鼠 CD11b 抗體(cat.no.17-0112-82，eBioscience)、FITC標(biāo)記的抗小鼠F4/80 抗體(cat.no.11-4801-82，eBioscience)、APC標(biāo)記的抗小鼠CD206 抗體(cat.no.17-2061-82，eBioscience) 和PE標(biāo)記的抗小鼠Nos2抗體(cat.no.25-5920-82，eBioscience)購(gòu)于賽默飛。Anti-JNK(No.9252s)、 Anti-p-JNK(No.4668s)、 Anti-NF-κB(No.8242s)、Anti-p-NF-κB(No.3033s)一抗購(gòu)于CST。anti-p38 MAPK(No.ab197348)、anti-ERK(No.196883)、anti-AKT(No.ab8805)、anti-phospho ERK(No.ab50011)、anti-phospho AKT(No.ab81283)、anti-phospho p38-MAPK(No.ab47363)、anti-GAPDH(No.ab181602)、Anti-Lamin B1(No.ab16048)及anti-IKBα(No.ab32518) 一抗購(gòu)于Abcam。Anti-rabbit Ab conjugated to HRP(No.7074s) 二抗購(gòu)于CST。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMDM)的獲取 無(wú)菌條件下取BALB/c小鼠脛骨和腓骨細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、20 ng/ml GM-CSF的DMEM低糖培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)7 d，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓細(xì)胞F4/80和CD11b雙陽(yáng)性比率。

1.2.2PA脂性培養(yǎng)基配置 稱取0.04 g NaOH溶于10 ml ddH2O配置成濃度為0.1 mol/ml的NaOH溶液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，稱取0.1 g PA置于9 ml NaOH溶液中，75℃水浴加熱30 min。稱取1.2 g BSA于55℃預(yù)熱的3 ml PBS中,8 000 r/min離心20 min。向 75℃的PA、NaOH混合液中加入BSA溶液，搖勻后55℃助溶30 min。細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后紫外照射30 min 滅菌。

1.2.3CCK8檢測(cè)巨噬細(xì)胞活性 將PA以100、300、400和500 μmol/ml刺激小鼠BMDM 24 h后，收集培育7 d的BMDM于離心管，計(jì)數(shù)，以 1∶ 2比例依次采用DMEM等比稀釋為至少3個(gè)細(xì)胞濃度梯度，接種于96孔板，每組設(shè)3～6個(gè)復(fù)孔。孵育箱培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞貼壁，10 μl/孔加入CCK 8試劑，孵育4 h后于450 nm處測(cè)定OD值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá) 收集樣品，TRIzol提取RNA，按照TaKaRa說(shuō)明書構(gòu)建10 μl逆轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。構(gòu)建20 μl反應(yīng)體系，95℃ 10 min，95℃ 15 s；60℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞NOS2和CD206表達(dá) 收集細(xì)胞于EP管，加入流式抗體4℃避光孵育 30 min。 洗去未結(jié)合的抗體后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.2.6Western blot檢測(cè)MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞核蛋白。全蛋白提取按照如下操作：加入含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和PMSF 的Lysis Buffer于細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞并制備蛋白；測(cè)定各組總蛋白濃度后，加入上樣緩沖液制備樣品，電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉、洗膜，加入一抗孵育過(guò)夜，加入二抗，ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光。

2 結(jié)果

2.1PA對(duì)小鼠BMDM的影響 與未處理組相比，當(dāng)PA濃度為400 μmol/ml時(shí)，對(duì)小鼠BMDM活性無(wú)影響，且為誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的最大濃度。以此濃度作為誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1。

2.2PA對(duì)小鼠BMDM形態(tài)的影響 M0細(xì)胞呈橢圓形，400 μmol/L PA誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形且偽足細(xì)長(zhǎng)，與M1巨噬細(xì)胞形態(tài)一致。表明PA可能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化，見(jiàn)圖2。

2.3PA對(duì)小鼠BMDM細(xì)胞因子表達(dá)的影響 與未處理組相比，PA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后，M1型相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平在0～72 h上調(diào)，其中IL-6 mRNA水平在誘導(dǎo)36 h后達(dá)到峰值，IL-12 mRNA水平在12 h后達(dá)到峰值，iNOS mRNA水平在48 h后達(dá)到峰值，而TNF-α mRNA水平在24 h后達(dá)到峰值。PA誘導(dǎo)后M2型相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)，且YM-1、IL-10在被誘導(dǎo)后12 h出現(xiàn)低轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，TGF-β出現(xiàn)于24 h，而Fizz1出現(xiàn)于36 h。表明在PA誘導(dǎo)后，小鼠BMDM上調(diào)M1型相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，同時(shí)下調(diào)M2型相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，提示PA可能具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化的作用，見(jiàn)圖3。

2.4PA對(duì)小鼠BMDM NOS2及CD206表達(dá)的影響 PA誘導(dǎo)后，F(xiàn)4/80+NOS2+細(xì)胞占比明顯上升，且于36 h達(dá)到峰值。 PA誘導(dǎo)組F4/80+CD206+細(xì)胞比例雖然在24 h時(shí)顯著上升，但誘導(dǎo)48 h后，CD206表達(dá)恢復(fù)至未處理組水平，表明在PA誘導(dǎo)后，巨噬細(xì)胞向M1型極化，見(jiàn)圖4。

表1 引物序列

圖1 PA對(duì)小鼠BMDM活性的影響Fig.1 Effect of PA on mice BMDM viabilityNote:Compared with control group,*.P<0.05.

圖2 PA對(duì)小鼠BMDM形態(tài)的影響Fig.2 Effect of PA on BMDM morphology of mice

圖3 PA對(duì)小鼠BMDM促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.3 Effect of PA on transcriptional levels of pro-inflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines in BMDM of miceNote:Compared with control group,*.P<0.05,**.P<0.01，***.P<0.001.

圖4 PA對(duì)小鼠BMDM NOS2和CD206表達(dá)的影響Fig.4 Effect of PA on expression of NOS2 and CD206 in BMDM of miceNote:Compared with untreated group,*.P<0.05,**.P<0.01，***.P<0.001.

2.5Western blot檢測(cè)MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 誘導(dǎo)后15 min胞質(zhì)中呈現(xiàn)p-ERK、p-JNK及p-p38表達(dá)，胞核中呈現(xiàn)p-NF-κB表達(dá)，30 min時(shí)達(dá)到峰值，而IKBα相比于其15 min時(shí)表達(dá)降低，60 min 時(shí)p-ERK、p-JNK、p-p38及p-NF-κB有少量表達(dá)，而無(wú)IKBα表達(dá)。說(shuō)明PA通過(guò)MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化，見(jiàn)圖5。

3 討論

巨噬細(xì)胞具有極強(qiáng)的可塑性，可極化為不同表型。M1型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥發(fā)展，殺傷病原體及腫瘤細(xì)胞。而M2型巨噬細(xì)胞釋放抑炎細(xì)胞因子，抑制炎癥反應(yīng)，參與組織修復(fù)，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。因此調(diào)控巨噬細(xì)胞極化在疾病防治中具有重要意義。近年大量研究報(bào)道了中草藥對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，中草藥活性成分通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化治療疾病。PA是大部分中草藥的主要成分。雖然已有研究報(bào)道PA可作為巨噬細(xì)胞TLR4的配體誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，但其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化后表型的鑒定及相關(guān)機(jī)制研究尚未明確[12]。

本研究從形態(tài)學(xué)出發(fā)觀察到PA誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞形狀呈梭型，形似M1型巨噬細(xì)胞。為驗(yàn)證其表型變化，檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)相較于未處理組，PA誘導(dǎo)后M1型相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-12和iNOS在0～72 h的轉(zhuǎn)錄水平升高數(shù)十倍，而M2型相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β、IL-10、Fizz1和YM-1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到抑制，說(shuō)明巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺妆硇?。研究表明NOS2可作為巨噬細(xì)胞M1型極化的標(biāo)志物[13]。本研究檢測(cè)F4/80+NOS2+巨噬細(xì)胞雙陽(yáng)性細(xì)胞比例結(jié)果顯示，相較于未處理組，PA誘導(dǎo)6 h后，NOS2表達(dá)上調(diào)，72 h時(shí)F4/80+NOS2+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為16.3%，處于較高水平。為進(jìn)一步驗(yàn)證巨噬細(xì)胞的極化表型，本研究檢測(cè)了M2型極化標(biāo)志物CD206表達(dá)[14]。結(jié)果顯示，雖然F4/80+CD206+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例在PA誘導(dǎo)24、36 h時(shí)明顯上升，但隨著誘導(dǎo)時(shí)間推移，F(xiàn)4/80+CD206+雙陽(yáng)性比例下降至未處理組水平，因此推測(cè)CD206表達(dá)上調(diào)的原因可能是在PA的刺激下所激活的通路引發(fā)CD206表達(dá)，但隨著PA誘導(dǎo)時(shí)間推移，引發(fā)促炎細(xì)胞因子的正反饋刺激，巨噬細(xì)胞逐漸向M1型轉(zhuǎn)化，CD206表達(dá)也隨之下降，說(shuō)明PA具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化的能力。

圖5 PA對(duì)小鼠BMDM JNK/P38 MAPK信號(hào)通路的影響Fig.5 Effect of PA on JNK/P38 MAPK signaling pathway in mouse BMDMNote:Compared with 0 min group,*.P<0.05,**.P<0.01，***.P<0.001.

巨噬細(xì)胞的極化過(guò)程涉及多種經(jīng)典的信號(hào)通路，而MAPK信號(hào)通路尤其重要[15]。MAPK信號(hào)通路可將信號(hào)傳導(dǎo)給核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞M1型極化[16]。本研究檢測(cè)了PA對(duì)該信號(hào)通路的影響，加入PA后15 min，檢測(cè)到p-ERK、p-JNK，p-p-38表達(dá)，并通過(guò)提取核蛋白發(fā)現(xiàn)p-65入核。在誘導(dǎo)后30 min，p-ERK、p-JNK及p-p-38表達(dá)明顯上調(diào)，p-65在核蛋白中高表達(dá)。誘導(dǎo)后60 min 仍然可觀察到MAPK信號(hào)通路的信號(hào)傳遞。大量研究表明只有當(dāng)NF-κB和IKBα解聚后，其核定位序列暴露，才能被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)NF-κB依賴的基因轉(zhuǎn)錄，因此檢測(cè)IKBα表達(dá)作為驗(yàn)證，結(jié)果顯示IKBα的表達(dá)與NF-κB相反，進(jìn)一步證明PA通過(guò)MAPK信號(hào)通路導(dǎo)致p-65入核，激活NF-κB，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化。

PA是中草藥中的主要組成部分，但其對(duì)機(jī)體細(xì)胞功能的影響常常被忽略。目前研究發(fā)現(xiàn)，PA可通過(guò)激活庫(kù)普弗細(xì)胞炎癥小體導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝炎進(jìn)展[17]。此外，PA可作用于遷移抑制因子導(dǎo)致胰島細(xì)胞功能紊亂和凋亡[18，19]。但Boubaker等[20]發(fā)現(xiàn)PA可阻礙可移植腫瘤發(fā)展，并提高荷瘤小鼠的脾細(xì)胞增殖率及宿主巨噬細(xì)胞溶酶體活性，發(fā)揮抗腫瘤作用?？傊?，在不同疾病中PA可能對(duì)疾病的轉(zhuǎn)歸發(fā)揮不同的作用。近年來(lái)中草藥的活性成分在疾病治療中發(fā)揮重要作用，而巨噬細(xì)胞的極化是疾病治療的切入點(diǎn)，因此了解PA對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響將有助于中草藥的開(kāi)發(fā)和利用。