鳶尾苷元對輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)的防護作用

王金鳳，高 云，王 芳，王國玉，趙慶蘭，楊翠燕

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六四醫(yī)院，吉林 長春130062)

隨著科技的發(fā)展，核軍事、核事故的威脅日趨嚴重，戰(zhàn)地救援、醫(yī)療救護的輻射防治任務(wù)隨之加劇；核技術(shù)推廣應(yīng)用給人類帶來益處的同時，職業(yè)性照射、醫(yī)源性照射人員大幅增加，電離輻射已成為威脅人類健康的重要因素。

研究發(fā)現(xiàn)[1]不論天然甾體激素，還是人工合成非甾體激素，以及雌激素衍生物都具有良好的輻射損傷防治作用。盡管如此，但因其對人體的毒副作用大，實際應(yīng)用受到很大的限制。與此相比，中藥具有藥源廣泛、服用方便、毒副作用低等特點，在輻射防護領(lǐng)域的研究中顯示出一定的潛力和優(yōu)勢，倍受關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)部分黃酮、皂苷和多糖等單體成分具有抗輻射損傷作用[2]。其中，染料木黃酮作為一種植物雌激素類化合物，具有抗氧化損傷、刺激造血干細胞增殖、促進損傷DNA修復(fù)等作用[3]，成為美國研發(fā)的軍用抗輻射損傷藥物，并已進入臨床試驗階段[4]。鳶尾苷元是葛花的主要活性成分，為異黃酮類化合物，結(jié)構(gòu)與染料木黃酮相似，只是A環(huán)C6位引入一個甲氧基，可有效清除自由基，抗炎、抗腫瘤、保護心血管，安全多效[5-8]。本文研究鳶尾苷元對輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)的防護作用，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級昆明小鼠，雄性，5周齡，體重 24-30 g。由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，合格證號：SCXK(遼) 2020-0001。

1.2 試劑與儀器

鳶尾苷元(自制，純度為 98.56%，批號20200711)；RPMI 1640培養(yǎng)基(L210KJ,上海源培生物科技有限公司)；XN2000全自動血細胞分析儀(希森美康醫(yī)用電子有限公司)；CPA2P-F 電子天平(德國賽多利斯股份公司)；UV-3200S紫外分光光度儀(上海美譜達儀器有限公司)；TGL-16G菲恰爾臺式離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)；CK40倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)；Compact醫(yī)用直線加速器(ELEKTA公司)。

1.3 方法

1.3.1照射條件

小鼠裝在有機玻璃盒內(nèi)，X射線源(Compact醫(yī)用直線加速器)，照射距離：100 mm；照射視野：10 cm×10 cm；照射劑量率350.0 MU/min，吸收劑量為4.0 Gy。

1.3.2分組及給藥

雄性昆明小鼠200只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為5組，每組40只。即正常對照組、模型組(單純輻照組)、鳶尾苷元低、中、高 3個劑量的給藥組(輻照+鳶尾苷元)。給藥組每日分別給予鳶尾苷元40、80、160 mg/kg bw[9,10]。藥品以0.5%羧甲基纖維素鈉制備成混懸液，分早晚2次灌胃給藥，灌胃體積為0.1 mL/10 g。對照組和模型組每日給予同等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。連續(xù)給藥3 d，除對照組外，其余各組小鼠于第4天灌胃后進行一次全身性照射。

1.3.3臟器指數(shù)和外周血象檢測

分別于照射后第7、14、21和28 d，每組隨機取小鼠10只，將小鼠稱重后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟取血1 ml加入EDTA-K2的抗凝管中，全自動血球分析儀測定全血白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)和血小板(PLT)數(shù)量。分離胸腺、脾臟，小心去除粘連的脂肪及結(jié)締組織，吸干水分后稱重，計算臟器系數(shù)(即臟器重/體重，mg/g)。取兩側(cè)股骨，置生理鹽水中備用。

1.3.4骨髓有核細胞(bone marrow nucleated cells，BMNCs)計數(shù)

分離股骨，去除附著的肌肉組織，生理鹽水沖洗干凈。剪開兩端少許。用帶有4號針頭的無菌注射器吸取RPMI 1640培養(yǎng)液2 ml，沖洗出全部骨髓，過4號針頭1次。3 000 r/min 離心10 min，去上清。加0.5 ml RPMI 1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液，加入適量的白細胞稀釋液(冰乙酸2 ml，雙蒸水 98 ml，1%亞甲基藍液3滴)，室溫靜置10 min，混勻后計數(shù)板計數(shù)。

1.3.5骨髓DNA含量測定

取另一股骨，用注射器吸取5 mmol/L CaCl2溶液10 ml，將股骨中全部骨髓細胞沖出至15 ml離心管中，混勻，4℃靜置30 min，3 000 r/min 離心10 min，棄上清；加入0.2 mmol/L HClO410 ml，90℃水浴加熱 15 min；冷卻后4 000 r/min離心10 min，取上清，于268 nm波長處測定吸光值(A268)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 鳶尾苷元對輻照小鼠狀態(tài)和臟器指數(shù)的影響

小鼠接受4Gy的X射線照射后，于第4-5 d出現(xiàn)活動度降低，皮毛散亂、光澤性差。9-10天后狀態(tài)逐漸改善，各組均無輻照相關(guān)死亡。輻照組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著低于正常對照組。脾指數(shù)以照射后7 d最低，隨后逐漸恢復(fù)，各鳶尾苷元給藥組下降幅度較模型組減輕，且恢復(fù)較快。第7、14、21 d與模型組比較具有顯著性差異，隨著給藥劑量的增加脾指數(shù)有增加趨勢，但各劑量組間無顯著差異；至第28 d各輻照組均明顯恢復(fù)，與正常組比較中、高劑量給藥組呈增生趨勢，高劑量組有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。胸腺指數(shù)在輻照后第7 d即顯著低于正常組，并呈進行性下降，輻照后第21 d降幅最大，至第28 d有所恢復(fù)，但仍顯著低于正常組。鳶尾苷元可減輕其下降程度，與模型組比較，高劑量給藥組各時間點均有顯著差異，中劑量組在第14、21、28 d差異具有顯著性，而低劑量組只有第14 d差異顯著，并且第28 d高劑量組的胸腺指數(shù)顯著高于低劑量組(P<0.05)，見表2。

表1 鳶尾苷元對輻照小鼠脾指數(shù)的影響

表2 鳶尾苷元對輻照小鼠胸腺指數(shù)的影響

2.2 鳶尾苷元對輻照小鼠外周血象的影響

結(jié)果如表3-6所示，X線4Gy輻照可導(dǎo)致小鼠外周血象WBC、RBC、PLT數(shù)量和HGB濃度不同程度下降，其中以WBC降低幅度最為顯著，與對照組比較，模型組第7 d降幅達98.9%，然后逐漸回升，但至第28d降幅仍達58.2%。鳶尾苷元各劑量組使其下降幅度減輕，第7 d時分別降低79.2%、75.6%和71.1%，并促進回升，至第28 d較正常組下降分別為43.1%、36.9%和37.9%，仍顯著低于模型組的58.5%(P<0.05)。其次是PLT，雖然輻照第7 d即顯著低于正常對照組，但以第14 d降幅最大，模型組較對照組降低68.7%，各給藥組呈現(xiàn)一定的保護作用，至第21 d與正常組比較已無顯著性差異，高劑量組起效更早，作用更強。RBC數(shù)量和HGB濃度照射后亦顯著低于正常對照組，第14 d最明顯，但下降幅度較小。接受輻照小鼠雖然各時間點的RBC均顯著低于正常對照組，模型組降幅最大，但只有32.3%，隨后逐漸恢復(fù)，表明輻照對紅系影響相對較輕。各劑量給藥組雖降幅有減輕趨勢，與模型組比較，只有高劑量組有顯著差異。HGB下降幅度更小，最大降幅為26.2%，恢復(fù)較RBC快，至第21 d與正常組比較，中、高劑量組無顯著差異，第28 d各輻照組均無顯著差異。給藥組各時間點雖均高于模型組，但只有鳶尾苷元高劑量組在第21 d與模型組比較有顯著差異。

表3 鳶尾苷元對輻照小鼠外周血WBC的影響

表4 鳶尾苷元對輻照小鼠外周血PLT的影響

表5 鳶尾苷元對輻照小鼠外周血RBC的影響

表6 鳶尾苷元對輻照小鼠外周血HGB的影響

2.3 鳶尾苷元對輻照小鼠BMNCs數(shù)的影響

照射后小鼠 BMNCs 數(shù)減少,造血系統(tǒng)明顯抑制。與模型組比較,鳶尾苷元各劑量組的BMNCs數(shù)一直保持較高水平， 第7 d、14 d均有統(tǒng)計學(xué)差異，第21 d，只有中、高劑量組差具異有顯著性，至第28 d各輻照組基本恢復(fù)正常。表明鳶尾苷元能促進輻射損傷小鼠骨髓造血功能的恢復(fù),見表7 。

表7 鳶尾苷元對輻照小鼠BMNCs 的影響(×106/股骨，

2.4 鳶尾苷元對輻射小鼠骨髓DNA含量的影響

小鼠股骨骨髓 DNA含量的變化如表8所示，輻照后骨髓DNA含量顯著降低(P<0.01)，以輻照后第7 d降幅最大，直到第28 d仍顯著低于正常對照組。鳶尾苷元各劑量組的降幅減小，并顯著高于模型組，表明鳶尾苷可以減輕輻射所致小鼠骨髓 DNA的損傷，并促進其恢復(fù)。

表8 鳶尾苷元對輻照小鼠骨髓 DNA含量的影響

3 討論

3.1 輻照對小鼠造血系統(tǒng)的影響

造血系統(tǒng)具有不斷增殖和快速更新的特點，是電離輻射高度敏感組織。機體遭受輻射損傷后，最早出現(xiàn)的變化就是血液學(xué)改變。造血系統(tǒng)損傷程度和恢復(fù)速度可作為放射性疾病病情和轉(zhuǎn)歸的評估指標[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠接受4Gy X線照射后，外周WBC數(shù)量和骨髓DNA含量變化最為敏感，發(fā)生得早，第7 d即達最低值，且降低幅度大，恢復(fù)緩慢，直到第28 d仍顯著低于正常對照組。其次為PLT，第14 d降幅最大。紅系損傷相對較輕，并且恢復(fù)較快。脾臟是參與機體造血及免疫調(diào)節(jié)的重要器官，也是輻射高度敏感的器官之一。輻照后可見脾臟體積縮小和重量減輕，但恢復(fù)較快，至第28 d基本恢復(fù)正常。胸腺雖為免疫器官，同時也是培育T淋巴細胞的場所，是重要造血器官。當機體受輻照后胸腺質(zhì)量的降低也是反映造血損傷程度的客觀指標。胸腺指數(shù)雖然照射后第7 d即顯著低于正常對照組，但有進行性加重的傾向，至第21 d最低，第28 d各輻照組雖有所恢復(fù)，但仍顯著低于正常，表明輻射對胸腺的損傷更加持久。

3.2 鳶尾苷元對輻照小鼠的防護作用

電離輻射除引起生物分子激發(fā)、電離和化學(xué)鍵斷裂外，還可導(dǎo)致機體內(nèi)水分分解，產(chǎn)生大量自由基，造成生物大分子和生物膜損傷。因此，輻射損傷重要原因就是大量自由基產(chǎn)生導(dǎo)致的氧化損傷[12]。異黃酮是多酚化合物，具有抑制活性氧(ROS)產(chǎn)生、淬滅自由基、減少DNA和膜脂質(zhì)氧化損傷、提高抗氧化酶活性等抗氧化應(yīng)激及抗輻射損傷作用[3,13]。鳶尾苷元為三羥基異黃酮，多酚羥基是其具有抗氧化活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；其4′,7位羥基結(jié)構(gòu)與乙烯雌酚相似，具有雌激素活性。本研究顯示鳶尾苷元可顯著減輕X線輻射損傷小鼠WBC、PLT、RBC、骨髓有核細胞數(shù)和DNA含量的降低程度，并促進其恢復(fù)，對脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)也有促進恢復(fù)的作用，且有劑量依賴傾向，高劑量組效果更明顯。表明鳶尾苷元可以減輕輻射對小鼠造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的損傷，具有輻射損傷防護作用，其作用機制考慮與其抗氧化損傷和植物雌激素活性有關(guān)，有待進一步探索。

3.3 小鼠心臟采血法

外周血象是評價輻射損傷的重要指標，采用全自動血球分析儀檢測全血更為客觀準確，但血液樣本用量較大。小鼠是輻射損傷最常用的實驗動物，采血較難，眼球取血、斷頭取血是其常用的采血方法，不僅取血量少，而且容易引起溶血和凝血。本研究將小鼠麻醉后開腹，剪開膈肌暴露心臟(避免打開胸腔引發(fā)出血)。采用EDTA-K2沖洗后的5 ml注射器，從右心室負壓進針抽血，可確保采血量達1 ml以上，然后置于EDTA-K2抗凝管中輕搖后再行檢測，可以滿足檢測需要。小鼠心臟取血簡便易行，采血量多，準確可靠。

綜上所述，以小鼠為實驗動物，X線4Gy可導(dǎo)致造血系統(tǒng)明顯損傷且無相關(guān)死亡。實驗周期短，費用低，可用于防治輻射損傷藥物的篩選。鳶尾苷元可以減輕輻射對小鼠造血系統(tǒng)的損傷，具有防護作用。但因動物小，不能多次采集樣本，因此不能動態(tài)觀察同一個體外周血象及骨髓的變化。由于個體差異的存在，對輻射損傷實驗結(jié)果分析判斷有一定的影響。