多個(gè)GEO芯片聯(lián)合分析篩選鼻咽癌易感基因

王曉瓊，金巧智，陳武兵，蔡志毅

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 耳鼻喉科，浙江 溫州 325027；2.臺(tái)州市立醫(yī)院 耳鼻咽喉科， 浙江臺(tái)州 318000）

鼻咽癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，高發(fā)于中國兩廣及江浙一帶[1]。鼻咽癌的臨床特征是:惡性程度高、解剖位置隱蔽、癥狀不典型，容易被忽視和誤診，4年遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率為30%～40%，5年生存率僅為70%[2]。研究表明，鼻咽癌的發(fā)病與多種因素有關(guān)，包括遺傳易感性、環(huán)境因素、飲食和EB病毒感染[3]。目前鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，臨床上常采用調(diào)強(qiáng)放射治療和同步放化療，但鼻咽癌患者的總體生存率并沒有明顯提高。因此，探求其動(dòng)態(tài)發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)降低復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率具有重要意義?；蛐酒夹g(shù)和生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析腫瘤相關(guān)基因及其調(diào)控機(jī)制是當(dāng)前功能基因組學(xué)的一種重要研究手段[4-5]。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)挖掘鼻咽癌相關(guān)基因芯片，分析其差異表達(dá)基因并構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而挖掘關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 資料 基因表達(dá)譜芯片篩選及數(shù)據(jù)處理利用美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）平臺(tái)下的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）檢索含有人源鼻咽癌樣本的芯片，選取基因芯片GSE12452、GSE13597、GSE64634，見表1。利用R語言軟件包Affy（version 1.50.0，http://bioconductor.org/help/search/index.html?q=affy/）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá)值背景矯正和表達(dá)譜數(shù)據(jù)的歸一化預(yù)處理，包括原始數(shù)據(jù)格式的轉(zhuǎn)換，缺失值補(bǔ)充，背景矯正，以及用分位數(shù)法進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 差異表達(dá)基因篩選 采用R語言Limma數(shù)據(jù)包對(duì)鼻咽癌與正常組織進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，|FC（fold change）|≥1.5（|log2FC|≥0.585）；并將探針名轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名，分別繪制差異表達(dá)基因火山圖。篩選出共同差異表達(dá)基因，根據(jù)log2FC值對(duì)基因進(jìn)行排序，然后進(jìn)行Rank分析（FDR＜0.05，矯正方法為bonferroni矯正法），繪制共同差異基因log2FC熱圖。

表1 3套鼻咽癌基因芯片基本信息

1.3 基因功能富集和注釋 基于前述所得差異表達(dá)基因，通過DAVID在線軟件（https://david.ncifcrf.gov），依據(jù)基因本體（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)功能注釋。同時(shí)利用京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異基因信號(hào)通路的富集。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用STRING10（http://www.string-db.org）構(gòu)建差異基因編碼蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，統(tǒng)計(jì)互作網(wǎng)絡(luò)鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目，篩選出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因。通過MCODE插件（MCODE分?jǐn)?shù)＞2）對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，獲得蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵蛋白質(zhì)簇并在Cytoscape中進(jìn)行可視化顯示，進(jìn)一步通過基因功能富集得到關(guān)鍵基因蛋白質(zhì)簇功能注釋。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選 篩選GSE12452 中獲得1 994個(gè)差異基因（964個(gè)上調(diào)，1 030個(gè)下調(diào)）；GSE13597中獲得518個(gè)差異基因（293個(gè)上調(diào)，225個(gè)下調(diào)）；GSE64634共獲得617個(gè)差異表達(dá)基因（227個(gè)上調(diào)，390個(gè)下調(diào)），各個(gè)芯片差異表達(dá)基因表達(dá)情況，見圖1-3。取在≥3個(gè)數(shù)據(jù)集中有交集的差異表達(dá)基因116個(gè)，其中上調(diào)基因69個(gè)，下調(diào)基因47個(gè)，見圖4。對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，根據(jù)差異基因的平均log2FC值對(duì)基因進(jìn)行排序，通過Rank分析得到40個(gè)明顯差異基因，繪制差異基因log2FC熱圖，見圖5。

圖1 GSE12452芯片中鼻咽癌組織與正常鼻咽組織差異基因火山圖

圖2 GSE13597芯片中鼻咽癌組織與正常鼻咽組織差異基因火山圖

圖3 GSE64634芯片中鼻咽癌組織與正常鼻咽組織差異基因火山圖

圖4 3套基因芯片差異基因匯總及交集

圖5 3套鼻咽癌基因芯片共同顯著差異表達(dá)基因

2.2 差異表達(dá)基因功能富集及通路分析 對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集分析，這些基因富集（FDR較正后aP ＜0.05）在細(xì)胞分裂（cell division）、蛋白結(jié)合（protein binding）、紡錘體（spindle）、細(xì)胞外外泌體（extracellular exosome）上，見表2和圖6。對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG通路分析，主要涉及6個(gè)通路（FDR較正后bP＜0.05）:細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、小細(xì)胞肺癌、錯(cuò)配修復(fù)、人T細(xì)胞白血病病毒1感染、ECM-受體相互作用通路，見表3和圖7。

2.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的篩選 用STRING10分析差異基因所對(duì)應(yīng)的蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖8；得到35個(gè)與≥29個(gè)蛋白有相互作用的蛋白，見圖9。再進(jìn)一步分析網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和基因簇，結(jié)果顯示蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中存在3個(gè)比較重要的基因簇。第1個(gè)基因簇關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)為增殖性細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和微小染色體維持蛋白2（minichromosome maintenance 2，MCM2），該基因簇生物功能主要富集于細(xì)胞核、細(xì)胞核質(zhì)、有絲分裂細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換、基因復(fù)制等通路；第2個(gè)基因簇關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)為核分裂周期蛋白80（nuclear division cycle 80，NDC80）、細(xì)胞周期素B1（cyclin B1，CCNB1）、細(xì)胞周期分裂蛋白20（cell division cycle 20，CDC20），該基因簇功能主要有凝聚核染色體外動(dòng)粒、濃縮核染色體動(dòng)粒、有絲分裂主軸裝配檢查點(diǎn)、有絲分裂紡錘體裝配；第3個(gè)基因簇包括復(fù)制因子復(fù)合體4（replication factor C subunit 4，RFC4）、復(fù)制因子復(fù)合體5（replication factor C subunit 5，RFC5）、氧化應(yīng)激反應(yīng)因子（Obg like ATPase 1，OLA1），該基因簇主要與腺嘌呤核苷三磷酸結(jié)合以及DNA復(fù)制相關(guān)，見圖10和表4。

表2 鼻咽癌組織與正常鼻咽組織差異表達(dá)基因GO富集注釋結(jié)果

圖6 鼻咽癌組織與正常鼻咽組織差異表達(dá)基因GO富集

表3 鼻咽癌組織與正常鼻咽組織差異表達(dá)基因KEGG通路注釋結(jié)果

圖7 鼻咽癌組織與正常鼻咽組織差異表達(dá)基因KEGG通路富集結(jié)果

3 討論

圖8 鼻咽癌組織與正常鼻咽組織差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖9 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目

圖10 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因簇分析

隨著基因芯片的迅速發(fā)展，利用基因芯片篩選差異表達(dá)基因，并分析其功能是當(dāng)前研究癌癥發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的一種新的有效方法。本研究選取GEO中3個(gè)鼻咽癌基因表達(dá)的芯片數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)進(jìn)行鼻咽癌相關(guān)基因篩選，共篩選到116個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)功能的進(jìn)一步分析，而其中根據(jù)log2FC值排序得到最顯著上調(diào)、下調(diào)的20個(gè)基因。其中乳鐵蛋白（lactotransferrin，LTF）在鼻咽癌組織中顯著下調(diào)，這與文獻(xiàn)報(bào)道LTF在鼻咽癌組織中低表達(dá)一致[9]，LTF可能通過抑制AKT信號(hào)通路[9]、MAPK信號(hào)通路[10]等抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖分裂。而前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2），也稱為環(huán)加氧酶，在鼻咽癌組織則顯著上調(diào)，目前文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為PTGS2作為一種潛在的癌基因，在鼻咽癌中表達(dá)上調(diào)，主要與在細(xì)胞有絲分裂發(fā)生過程中合成的前列腺素類物質(zhì)有關(guān)，被認(rèn)為主要負(fù)責(zé)炎癥反應(yīng)，而且PTGS2的抑制劑塞來昔布藥物也被證明能減少鼻咽癌中血管的生成[11]。但是包括SCGB1A1（secretoglobin family 1A1）在內(nèi)的其他差異基因在鼻咽癌組織中的作用及其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

通過GO富集、KEGG分析結(jié)果顯示以上差異基因的功能主要富集在細(xì)胞分裂的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合活性，定位富集在紡錘體以及細(xì)胞外外泌體等生物學(xué)過程中，主要參與細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、小細(xì)胞肺癌、錯(cuò)配修復(fù)、人T細(xì)胞白血病病毒1感染、ECM-受體交互等信號(hào)通路。值得注意的是其中37個(gè)差異基因富集定位在細(xì)胞體外泌體上。外泌體是攜帶著如核酸、蛋白質(zhì)、脂類和糖類等的生物活性分子，它廣泛存在于體液中，被認(rèn)為可以通過傳遞信息影響靶細(xì)胞的功能，激活細(xì)胞信號(hào)通路，可以在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用[11]。目前觀點(diǎn)認(rèn)為患者的血清、尿液、精液、唾液等均檢測出外泌體，而這些外泌體來自癌細(xì)胞[12]。本次研究中通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)37個(gè)基因與細(xì)胞外泌體相關(guān)，其中以CCAT6（CCT-alpha6）基因?yàn)槔?，在外泌體數(shù)據(jù)庫（ExoCarta）[13]中分析，CCAT6編碼形成的蛋白TCP 1復(fù)合物（CCT）廣泛存在于人體尿液、血液中，可以作為肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等的潛在生物標(biāo)志物。但是本研究所選用的是基因芯片取材于鼻咽癌組織和正常鼻腔黏膜組織，因此需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定以上在細(xì)胞外外泌體富集的基因是否可以作為潛在基因，成為非侵入性生物標(biāo)志物，用于鼻咽癌患者的早期檢測。

表4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因簇功能注釋

用STRING10對(duì)差異基因進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，位于中心節(jié)點(diǎn)的基因有包括RFC4、拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNA topoisomerase II alpha，TOP2A）、PCNA、CCNB1、有絲分裂阻滯缺陷2樣蛋白1（mitotic arrest deficient 2 like 1，MAD2L1）、NDC80 等35個(gè)基因。進(jìn)一步進(jìn)行基因簇及關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)挖掘顯示，差異基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)存在3個(gè)關(guān)鍵基因簇，主要和有絲分裂細(xì)胞周期、基因復(fù)制、有絲分裂、腺嘌呤核苷三磷酸結(jié)合等相關(guān)。其中第一關(guān)鍵基因簇中，網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因PCNA編碼的PCNA蛋白是一種DNA聚合酶δ的輔助蛋白，在G1中期、S期時(shí)高表達(dá)，而從G2/M期至G1期時(shí)開始下降，涉及DNA的復(fù)制和修復(fù)的過程[14]。莫浩亢等[15]則發(fā)現(xiàn)PCNA在鼻咽癌中高表達(dá)，且與鼻咽癌放療敏感性有關(guān)，而MCM2作為MCMs家族的一員，是一種與DNA復(fù)制有密切關(guān)系且可作為增殖細(xì)胞的特殊標(biāo)志物。多篇文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)MCM2在鼻咽癌中高表達(dá)，與鼻咽癌細(xì)胞增殖相關(guān)，常提示預(yù)后不良[16-17]。第二個(gè)基因簇中CCNB1則可以和CDC20復(fù)合形成成熟促進(jìn)因子（maturation promoting factor，MPF），MPF對(duì)細(xì)胞能否能進(jìn)入M期起決定性作用。而CCNB1還可以通過紡錘體微管的作用來促進(jìn)細(xì)胞分裂，且已經(jīng)作為抗腫瘤靶點(diǎn)在多種腫瘤中進(jìn)行研究[18]。本研究還發(fā)現(xiàn)RFC4基因與鄰近45個(gè)基因蛋白有連結(jié)，RFC4基因編碼復(fù)制因子復(fù)合體（RFC）的第四大亞基，RFC主要參與促進(jìn)PCNA與ATP的結(jié)合，同樣參與DNA的修復(fù)[19]。研究發(fā)現(xiàn)RFC4在結(jié)直腸癌中、肝癌中高表達(dá)，且與不良預(yù)后有關(guān)[20-21]，而ARAI等[21]發(fā)現(xiàn)下調(diào)RFC4的表達(dá)可以增強(qiáng)多柔比星和喜樹堿在肝細(xì)胞癌中的細(xì)胞毒性作用。

綜上所述，本研究采用生物信息學(xué)方法分析已有的鼻咽癌芯片數(shù)據(jù)，篩選出潛在的鼻咽癌中表達(dá)上調(diào)下調(diào)顯著的基因，還通過建立蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析得到關(guān)鍵基因簇和關(guān)鍵基因節(jié)點(diǎn)，包括基因PCNA、MCM2、CCNB1、RFC4。但因本研究僅涉及生物信息學(xué)分析，以上潛在功能基因與鼻咽癌的相關(guān)性及相關(guān)機(jī)制研究仍需在臨床樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。