CD3/KIF20A雙特異性抗體介導T淋巴細胞對KIF20A陽性胰腺癌PANC1細胞的抗腫瘤效應

賈原 張俊萍 薛昭君 楊曉玲 馮慧晶 劉鵬敏

山西醫(yī)學科學院山西大醫(yī)院腫瘤中心，太原 030032

腫瘤免疫治療是一類以CD3+T淋巴細胞為主輸注的治療方法，因其不良反應小、特異性強等特點，被公認為是治療胰腺癌的有效途徑之一[1]。針對特異性細胞毒性T淋巴細胞(簡稱T細胞)的胰腺腫瘤抗原的篩選及鑒定成為學術界關注的熱點[1-3]，而針對誘導特異性T細胞的腫瘤抗原的篩選及鑒定也受到學術界廣泛的關注[3]。驅(qū)動蛋白家族成員20A(kinesin family menber 20A, KIF20A)作為一種腫瘤相關抗原，在胰腺癌細胞高表達而在正常細胞中不表達(或低表達)[4-6]，由此在胰腺癌的免疫治療中具有很大的開發(fā)潛力[3]。有研究[7]將KIF20A與CD3單克隆抗體重組成雙特異性抗體，通過同時識別KIF20A和CD3兩個分子標靶，定向趨化遷移CD3+T細胞至KIF20A+腫瘤細胞，加強對腫瘤細胞的殺傷效應。此外，通過靶向同一種細胞上的兩種不同受體，雙特異性抗體可以誘導細胞信號的改變，包括癌癥擴散信號或者炎癥信號[8]。本課題組前期應用維生素C干預樹突樣細胞(dendritic cell, DC)-T細胞(DC-T細胞)[9-10]，本研究制備靶向KIF20A及CD3的雙特異性抗體(CD3/KIF20A雙抗)，并將其裝載于維生素C干預的DC-T細胞，觀察其對KIF20A+胰腺癌細胞的殺傷效應。

材料與方法

一、細胞系及主要試劑

胰腺癌細胞系PANC1購于美國模式培養(yǎng)集存庫(American type culture collection，ATCC)，常規(guī)培養(yǎng)復蘇。鼠抗人CD3單抗、 KIF20A單抗購自美國TaKaRa公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)檢測試劑盒購自美國羅氏公司；CD3標記單抗、FITC標記CD28單抗、PE標記CD8單抗均購自美國BD公司；Traut′s試劑、 4-(N- 馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷 -1- 羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(SULFO-SMCC)購自美國賽默飛世爾科技公司。

二、CD3/KIF20A雙抗的制備及純化鑒定

取1 mg人源CD3單抗溶于500 μl 0.5 mmol/L交聯(lián)劑Traut′s試劑[11]，室溫作用2 h，上Sephrose-G25凝膠層析柱，應用含20 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L DTT的洗脫液(pH 7.2)洗去多余的Traut′s試劑，獲取人源CD3單鏈抗體；取1 mg人源KIF20A單抗，溶于500 μl 0.5 mmol/L交聯(lián)劑Sulfo-SMCC，室溫作用2 h，上Sephrose-G25凝膠層析柱，應用含20 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L DTT的洗脫液(pH 7.2)洗去多余的Sulfo-SMCC，獲取人源KIF20A單鏈抗體；將上述CD3、KIF20A單鏈抗體混合，裝入能透過分子質(zhì)量<10 000的透析袋，置4℃透析18 h，平衡液為20 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl(pH7.2)。透析后在室溫下上Sephrose-G25凝膠層析柱，應用平衡液洗脫，收集CD3/KIF20A雙抗，再重復上凝膠層析柱過濾1次，收集純化的雙抗，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳鑒定后超濾濃縮，獲得人源CD3/KIF20A雙特異性抗體。

三、DC-T細胞培養(yǎng)及分組

抽取健康志愿者外周血20 ml，采用淋巴細胞分離液，以1 900～2 300r/min(離心半徑15 cm)離心10～20 min分離出單核細胞層。吸取單核細胞，加30～50 ml淋巴細胞培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)過夜。次日將懸浮的細胞倒入另一個無菌細胞培養(yǎng)瓶用于培養(yǎng)T細胞，培養(yǎng)液中加入CD3單抗、1 000 U/ml IL-2，培養(yǎng)3～5 d；貼壁的細胞用于培養(yǎng)DC細胞，培養(yǎng)液中加或不加入1 mmol/L維生素C，培養(yǎng)3～5 d，分別獲取維生素C干預的DC(vcDC)或DC。再將vcDC、DC分別與T細胞聯(lián)合培養(yǎng)5～9 d，分別獲取vcDC-T細胞及DC-T細胞。上流式細胞儀檢測各組T細胞亞群及培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12水平。

四、CD3/KIF20A雙抗裝載的T細胞殺傷PANC1細胞的毒性試驗

取對數(shù)生長期PANC1(KIF20A+)作為靶細胞，以5 000個細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜；將10、50、100、300 ng雙抗分別和1×105個T細胞混合作為效應細胞，以效靶細胞20∶1比例共同培養(yǎng)2、6、10 h，倒置顯微鏡下觀察效應細胞對靶細胞的聚集效應，并應用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)法檢測腫瘤細胞殺傷率，即在培養(yǎng)到時間點后用50 μl/孔的冷1640培養(yǎng)液中止反應，1 500 r /min(離心半徑15 cm)離心5 min，收集上清，每孔加入100 μl LDH，室溫避光孵育30 min后每孔加1 mol/L HCl 50 μl終止酶促反應，去除孔中含有的氣泡，1 h內(nèi)上酶標儀檢測各孔波長490 nm處的吸光度值(A490值)，取3孔均值，計算T細胞對PANC1細胞的殺傷率，明確殺傷率最高的雙抗裝載劑量。細胞殺傷率(%)=[(實驗組A490值-效應細胞A490值-靶細胞A490值)/(靶細胞最大A490值-靶細胞A490值) ]×100%。

然后以PANC1(KIF20A+)為靶細胞，以5 000個細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，以效靶細胞20∶1的比例分別加入DC-T細胞或裝載對PANC1細胞殺傷率最高的雙抗劑量的DC-T細胞及vcDC-T細胞，分別共同培養(yǎng)2、4、6、8、10、12 h，各設3個復孔。同樣應用LDH法檢測腫瘤細胞殺傷率。

五、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、化學交聯(lián)CD3/KIF20A雙抗的鑒定

經(jīng)透析及2次Sepharose-G25柱過濾，通過SDS-PAGE凝膠電泳分離得到單一的CD3/KIF20A特異性雙抗體蛋白條帶，分子質(zhì)量為130 000，雙抗的產(chǎn)率約50%。

圖1 各抗體的SDS-PAGE凝膠電泳圖 1 分子量標記；2 CD3單抗；3 KIF20A單抗；4 透析后的CD3/KIF20A雙抗；5 第1次G25柱過濾后的CD3/KIF20A雙抗；6 第2次G25柱過濾后的CD3/KIF20A雙抗； 7 濃縮后的CD3/KIF20A雙抗

二、T細胞、DC-T細胞、vcDC-T細胞的亞群比例及細胞因子分泌水平

vcDC-T細胞組的CD8+CD28+及CD40L細胞亞群比例顯著高于DC-T細胞組及T細胞組，而負性調(diào)節(jié)的Treg細胞亞群比例顯著低于DC-T細胞組及T細胞組；IL-2、IFN-γ、IL-12的分泌量顯著高于DC-T細胞組及T細胞組，而IL-4分泌量顯著低于DC-T細胞組及T細胞組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表1)，說明維生素C干預不僅可以有效提升T細胞的功能，還可將過繼免疫反應與天然免疫效應相結(jié)合。

三、T細胞、DC-T細胞、雙抗DC-T細胞的靶向效應及對PANC1細胞的殺傷率

100 ng CD3/KIF20A雙抗裝載的DC-T細胞對KIF20A+胰腺癌PANC1細胞有明顯的靶向性，顯著地趨向PANC1相對集中的區(qū)域(圖2)。

10、50、100、300 ng雙抗裝載的1×105個T細胞與PANC1細胞(20∶1)共培養(yǎng)2、6、10 h后對腫瘤細胞的殺傷率見圖3，以裝載100 ng雙抗劑量的T細胞殺傷能力最強，裝載率為1 000個細胞裝載1 ng雙抗。

表1 T細胞、DC-T細胞、vcDC-T細胞的亞群比例及細胞因子分泌水平

圖2 PANC1細胞(2A)及DC-T細胞(2B)、100 ng CD3/KIF20A雙抗裝載的DC-T細胞(2C)對PANC1細胞的靶向聚集(×100)

圖3 裝載不同劑量雙抗的T細胞對PANC1細胞的殺傷率

DC-T細胞、雙抗DC-T細胞、雙抗vcDC-T細胞與PANC1細胞(20∶1)共培養(yǎng)2、4、6、8、10、12 h對PANC1細胞的殺傷率見表2。雙抗vcDC-T細胞對PANC1細胞的殺傷率高于雙抗DC-T細胞，雙抗DC-T細胞的殺傷率又高于DC-T細胞，3組間在不同共培養(yǎng)時間點的差異均有統(tǒng)計學意義。提示維生素C對雙抗裝載的T細胞起到增強細胞功能的作用，4 h時雙抗vcDC-T 細胞組的殺傷率較雙抗DC-T組提高20%以上，較DC-T組提高45%以上。

表2 DC-T細胞、雙抗DC-T細胞、雙抗vcDC-T細胞對PANC1細胞的殺傷率(%)

討 論

隨著全球環(huán)境的惡化和人們生活習慣的改變，腫瘤的發(fā)病率越來越高，腫瘤患者的病死率也逐漸上升，故抗腫瘤藥物的市場將不斷擴大[12]。雙特異性抗體是抗體藥物領域中的一個新概念，被視為腫瘤治療的第二代抗體，擁有廣闊前景。2014年6月一份研究報告顯示[11]，2023年雙特異性抗體藥物的市場將達到44億美元。近10年來，應用雙特異性抗體來進行腫瘤治療的研究已經(jīng)取得了一定進展，多家生物醫(yī)藥公司也開展了多種相關藥物的研發(fā)，有力地證明了雙特異性抗體藥物的有效性[13-14]。

KIF是一類具有軸突運輸功能的分子馬達，參與細胞分裂[6]，2005年首次發(fā)現(xiàn)其成員KIF20A在胰腺癌組織中高表達[4]。KIF20A是一種微管相關馬達蛋白，其生物學功能主要參與細胞分裂，以及細胞器或細胞膜的轉(zhuǎn)運等[5-6]。近期越來越多的研究發(fā)現(xiàn) KIF20A的上調(diào)與癌癥相關。一項胰腺癌Ⅰ/Ⅱ期臨床研究[15]結(jié)果顯示，選擇HLA-A24限制性多肽治療的9例胰腺癌患者中4例病情穩(wěn)定，5例療效不理想，疾病有效控制率達44%，表現(xiàn)出較高水平的抗瘤效應。另一項Ⅰ期試驗[16]結(jié)果顯示，入組的29例胰腺癌患者通過1個月多肽疫苗治療后21例病情穩(wěn)定，疾病有效控制率為72%，其中8例腫瘤縮小，1例病情完全緩解，中位生存期為142 d，無進展生存期為56 d，顯示KIF20A作為治療胰腺癌靶標具有良好的選擇性和免疫原性。

本研究應用Trust′s試劑將CD3單抗和KIF20A單抗進行拆分后再拼接，再經(jīng)過解耦聯(lián)、分子篩、耦聯(lián)、透析等方法獲得雙特異性抗體，產(chǎn)率近50%。表明通過選擇商品化的單克隆抗體有明顯的優(yōu)勢。但同時也顯示化學耦聯(lián)率有待提高，以增加雙抗的產(chǎn)率。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)維生素C的干預[9-10]，vcDC-T細胞中的T細胞亞群比例得到優(yōu)化，即CD8+CD28+、CD40L細胞比例增高，Treg細胞比例降低，同時T細胞的細胞因子分泌能力也明顯提升，且IL-12的分泌水平顯著改善，說明維生素C可將獲得性過繼免疫與天然免疫相結(jié)合。本研究進一步將雙特異性抗體與維生素C刺激相結(jié)合，結(jié)果顯示CD3/KIF20A雙抗能增強DC-T細胞的靶向效應和對KIF20A+腫瘤細胞的殺傷能力，雙抗結(jié)合維生素C刺激能進一步增強T細胞的靶向性及趨向性，增強T細胞的殺傷能力，并提高細胞因子的分泌能力，提高治療腫瘤的效能。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突