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    金黃色葡萄球菌生物被膜形成及檢測方法研究

    2020-12-23 04:19:54趙朵肖娜裴曼君梁冉張文樂唐一通
    教育教學(xué)論壇 2020年47期
    關(guān)鍵詞:金黃色葡萄球菌檢測方法

    趙朵 肖娜 裴曼君 梁冉 張文樂 唐一通

    [摘 要]金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是引起醫(yī)院感染的重要病原菌。金黃色葡萄球菌生物被膜是其重要的毒力因子,臨床上許多感染均與生物被膜相關(guān)。了解金黃色葡萄球菌生物被膜的形成機制與檢測方法,對于控制金黃色葡萄球菌生物被膜感染及耐藥性的形成,制訂有效的預(yù)防措施和治療方案有著重要作用。文章對金黃色葡萄球菌生物被膜的形成及檢測方法進行綜述。

    [關(guān)鍵詞]金黃色葡萄球菌;生物被膜;檢測方法

    [基金項目]2016年湖北省自科基金“MRSA分子分型及臨床常用消毒劑對Sccmec耐藥元件水平轉(zhuǎn)移影響機制研究”(2016CFB319);2017年襄陽市科技研究與開發(fā)項目“耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)快速檢測方法及本地區(qū)MRSA分子流行病學(xué)和耐藥性研究”(襄科計(2017)10號);2018年湖北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目“襄陽市食品中金黃色葡萄球菌污染狀況及耐藥性研究”(鄂教高函[2018]21號)

    [作者簡介]趙 朵(1998—),女,湖北襄陽人,湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)本科生在讀,研究方向為細菌耐藥性;肖 娜(1981—),女,河南確山人,生物化學(xué)與分子生物學(xué)碩士,湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院高級實驗師,研究方向為細菌耐藥性與分子分型;裴曼君(1998—),女,湖北隨州人,湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)本科生在讀,研究方向為細菌耐藥性;梁 冉(1998—),男,湖北襄陽人,湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)本科生在讀,研究方向為細菌耐藥性;張文樂(1997—),女,湖北襄陽人,湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)本科生在讀,研究方向為細菌耐藥性;唐一通(1983—),男,河南開封人,微生物學(xué)博士,湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院副教授(通信作者),主要從事細菌耐藥性研究。

    [中圖分類號] R917[文獻標識碼] A[文章編號] 1674-9324(2020)47-0-03[收稿日期] 2020-05-30

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是臨床上常見病原菌之一,在醫(yī)院感染中居第2位,僅次于由大腸埃希菌引起的感染[1]。生物被膜是金黃色葡萄球菌重要的毒力因子,臨床上許多感染均與生物被膜相關(guān),包括心內(nèi)膜炎、骨髓炎以及與醫(yī)療器材相關(guān)的感染,如人工關(guān)節(jié)、氣管導(dǎo)管、血透置管、血管導(dǎo)管、心臟起搏器和心臟瓣膜等引起的感染。有研究表明金黃色葡萄球菌形成的生物被膜也是導(dǎo)致其耐藥性增強的主要原因之一。因此,了解金黃色葡萄球菌生物被膜的形成及感染機制,對于控制金黃色葡萄球菌生物被膜感染及耐藥性的形成,制訂有效的預(yù)防措施和治療方案有著重要作用。本文對金黃色葡萄球菌生物被膜的形成及檢測方法進行綜述。

    一、生物被膜的形成

    生物被膜是指細菌黏附于接觸表面,分泌多糖基質(zhì)等胞外聚合物等,將其自身包繞其中而形成的大量細菌聚集膜樣結(jié)構(gòu)化群落。生物被膜的形成過程有明顯的階段性特征,首先是細菌菌體黏附在物體表面,然后是群體的積聚和生物膜的成熟,最后在擴散階段通過菌體的傳播引起其他物體表面的污染。金黃色葡萄球菌是一種易形成細菌生物被膜的革蘭氏陽性球菌[2],與其他形成生物被膜細菌相似,其形成生物被膜過程也有黏附與積聚、成熟和擴散等階段性特征。

    (一)細菌黏附與積聚

    細菌黏附于接觸表面,形成單細胞層,是生物被膜形成的基本條件。在這一階段,金黃色葡萄球菌細胞壁錨定蛋白發(fā)揮重要介導(dǎo)作用。多種細胞壁錨定蛋白由金黃色葡萄球菌編碼,該蛋白根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可分為不同種類。其中MSCRAMM家族(Microbial Surface Components Recognizing Surface Adhesive Matrix Molecules)是重要的一類,主要包括纖連蛋白結(jié)合蛋白、聚集因子等。經(jīng)過初期粘附后,細菌激活特定基因分泌大量細胞外基質(zhì)包裹自身,并在其中增殖以逃避抗生素殺傷和宿主自身免疫清除作用,促使黏附更加牢固。多糖胞間黏附素(Polysaccharide Intercellular Adhesion PIA)和胞外DNA等在整個過程中發(fā)揮作用。細菌黏附有許多影響因素,如接觸材料特性、細菌疏水性、細胞外部膜蛋白以及微生物生長特性等。

    (二)生物被膜的成熟

    隨著生物被膜內(nèi)細菌生長和相關(guān)多糖蛋白基質(zhì)的積聚,該階段生物被膜的結(jié)構(gòu)由類似蘑菇狀或堆狀的微菌落組成。成熟的膜結(jié)構(gòu)具有不均一特點,在微菌落周圍圍繞大量管道以運送養(yǎng)分、代謝廢物等。而生物被膜內(nèi)部的微菌落是高度組織的群體,細菌之間可進行群體感應(yīng)的信息交流,檢測群體的菌體密度,從而進行特定基因表達,維持細菌群體的生長代謝穩(wěn)定,并保證營養(yǎng)的輸入和代謝廢物的排出等。在生存環(huán)境發(fā)生改變情況下,生物被膜中的細菌會通過相應(yīng)機制調(diào)節(jié)生長活動以適應(yīng)外部環(huán)境。

    (三)細菌的播散

    生物被膜在成熟階段可以進行擴散和傳播。這一過程可通過局部蔓延、部分脫落或釋放浮游細菌來實現(xiàn)。生物被膜內(nèi)脫落或釋放出來的細菌變?yōu)楦∮尉?,再次定植于惰性材料表面,從而再次?jīng)歷黏附與積聚、成熟和擴散等循環(huán)階段。

    二、生物被膜抗性

    細菌在形成生物被膜后,對抗菌物質(zhì)、熱、酸堿度等物化環(huán)境因素的抵抗力明顯增強。有研究表明,生物被膜內(nèi)細菌較其浮游狀態(tài)細菌對抗生素的耐藥性提高10—1000倍。金黃色葡萄酒生物膜抗性主要有以下原因:

    (一)屏障作用

    細菌黏附聚集形成生物被膜后,在生物被膜的包裹下,可阻擋抗生素和消毒劑等滲入造成對內(nèi)部細菌的損傷和破壞。生物膜外層的多糖復(fù)合物層除可阻止抑菌物質(zhì)滲入外,還可與部分殺菌物質(zhì)結(jié)合從而減弱或消除其對生物膜內(nèi)細菌的殺傷,從而達到耐藥效果。

    (二)延緩細菌生長

    細菌生物膜內(nèi)部的營養(yǎng)物質(zhì)濃度有著梯度變化的特點,處于表層的細菌能夠較易獲取營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣,代謝較為活躍。生物被膜深層細菌由于處于營養(yǎng)缺乏、低氧和大量代謝廢物存在的微環(huán)境中,造成其多處于休眠或亞休眠狀態(tài),代謝緩慢,甚至類似于芽孢菌的分化形式,因此具有更強的生存能力,對外部環(huán)境中的理化因素具有較強的抵抗力。

    (三)密度感應(yīng)系統(tǒng)(QS)調(diào)節(jié)

    密度感應(yīng)系統(tǒng)(QS)是指生物被膜內(nèi)部細菌根據(jù)群體密度的大小利用信號分子進行信息交流,并調(diào)控特定基因的表達使群體行為協(xié)調(diào)的機制。QS系統(tǒng)在BF形成后,信號分子會與某些特定受體結(jié)合,激發(fā)特定基因表達,使整個菌團系統(tǒng)達到平衡[3]。破壞QS系統(tǒng)的表達對于破壞BF形成具有重要意義。

    三、細菌生物被膜形成能力檢測

    (一)剛果紅瓊脂培養(yǎng)基法

    金黃色葡萄球菌生物被膜形成過程中,需黏附在載體表面和分泌大量多糖基質(zhì)PIA,剛果紅能與PIA結(jié)合,培養(yǎng)超過24h,會使剛果紅的顏色褪去,由紅色變?yōu)楹谏玔4]。但是此種方法不能夠區(qū)分生物被膜形成能力的強弱,是一種定性檢測方法。Panda P S等等對剛果紅培養(yǎng)方法進行了改良,對葡萄球菌生物被膜進行檢測具有較好實驗結(jié)果。徐子恒等利用剛果紅培養(yǎng)基定性和結(jié)晶紫染色法定量測定了金黃色葡萄球菌生物被膜。魏蓮花等采用剛果紅平板法對保存的100株金黃色葡萄球菌菌株進行了篩選,并在電鏡下對產(chǎn)生物被膜菌株進行生物膜顯微結(jié)構(gòu)的觀察。

    (二)結(jié)晶紫(CV)染色法

    結(jié)晶紫能與生物被膜表面帶負電荷的表面分子和多糖成分結(jié)合而使生物被膜顯色,因此可以通過測定不同菌株與結(jié)晶紫結(jié)合后的吸光度值對菌株形成生物被膜的能力進行定量的檢測。1985年Christensen等首次采用結(jié)晶紫染色方法對非黏液性鏈球菌生物被膜進行了定量分析。2000年,Stepanovic等對結(jié)晶紫方法進行改進,增加了結(jié)晶紫染色方法對細菌生物被膜定量的準確性,其能夠?qū)ξ⒖装迳锉荒ど锪窟M行較為全面的量化。李冰等[5]利用96孔板培養(yǎng)和結(jié)晶紫法對58株金黃色葡萄球菌的生物被膜形成能力進行了定量檢測,通過檢測不同培養(yǎng)孔中的吸光度值(OD值)的大小對生物被膜形成能力分類為不粘附、弱黏附、中等黏附和強黏附。

    (三)顯微鏡技術(shù)

    1.掃描電子顯微鏡。SEM可用來直接觀察載體表面黏附的金黃色葡萄球菌生物被膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)和表型特征。Clauss等研究表明,SEM檢測金葡菌在多孔材料表面和光滑材料表面上形成生物被膜的能力不同,所需時間也不同。Kumar D等用SEM方法進行細菌生物被膜的定量檢測。SEM技術(shù)雖然分辨率高,但SEM處理樣品時步驟煩瑣,可能會破壞樣品結(jié)構(gòu),圖形缺乏垂直分辨率。同時SEM設(shè)備精密價高,不易于實驗室常規(guī)檢測。

    Pompilio A等用環(huán)境掃描電鏡(E-SEM)在高倍放大下觀察含水和非導(dǎo)電的活細菌生物被膜,可不受人為操作產(chǎn)生的假象的影響。E-SEM雖然能夠在自然狀態(tài)下成像,但對濕樣本分辨率低,并且可能引起樣本損傷。聚焦離子束掃描電子顯微鏡(FIB-SEM)可用于觀察生物膜內(nèi)部結(jié)構(gòu),通過軟件得到連續(xù)圖像切片從而獲得三維重建生物膜模型,但檢測需要真空環(huán)境,并且離子束損壞會降低分辨率。原子力顯微鏡(AFM)可用于確認其他技術(shù)獲得的結(jié)果,確定生物被膜的黏附力,強度,但其觀察范圍小,測定也會帶來樣本的損傷。

    2.激光共聚焦掃描顯微鏡。激光共聚焦掃描顯微鏡通過熒光染料與細菌生物被膜的結(jié)合,在不同波長激光激發(fā)下,能清楚地展現(xiàn)生物被膜中各種組分與結(jié)構(gòu)的差異,并能進行逐層掃描展現(xiàn)生物被膜三維立體結(jié)構(gòu)。該技術(shù)應(yīng)用于觀察生物被膜空間結(jié)構(gòu),分布以及抗菌藥物對細菌細胞活力的影響,形成樣品三維空間結(jié)構(gòu)無須計算機處理。但是檢測翻譯需要熒光團,觀察的分子數(shù)量有限,也容易受到熒光探針和天然熒光的干擾。而且不透光樣品無法觀察[6]。

    (四)質(zhì)譜技術(shù)

    質(zhì)譜成像技術(shù)是一種基于質(zhì)譜分析原理檢測樣品空間分布的分子成像技術(shù)。Ding YZ等[7]利用飛行時間二次離子質(zhì)譜技術(shù)(Time-of-flight secondary ion mass spectrometry,TOF-SIMS)檢測了生物被膜相關(guān)基質(zhì)成分的空間結(jié)構(gòu)和分布,具有高度的分辨率和靈敏度?;|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)能夠用于測定生物被膜中生物大分子的分子量和鑒定表面的蛋白質(zhì),有著操作簡便,結(jié)果直觀的優(yōu)點。Pereira等[8]使用該技術(shù)在聚丙烯表面檢測銅綠假單胞菌生物被膜的形成過程, 不僅能夠顯示生物被膜形成的不同階段,而且能夠用于展示生物被膜分散釋放時間。

    (五)PCR技術(shù)

    在檢測金黃色葡萄球菌生物被膜時,可利用實時熒光定量PCR方法檢測生物被膜形成和調(diào)控相關(guān)基因(atI,icaA,icaD,icaBC,aap,agr)及胞外DNA基因的差異表達情況,在基因水平研究生物被膜的形成的分子機制。

    四、結(jié)論

    目前,對于金黃色葡萄球菌生物被膜形成和耐藥性的研究還有待繼續(xù)深入,雖然具有多種基于不同原理的生物膜被膜檢測技術(shù)和方法,但建立簡便、準確、靈敏的檢測方法,對于生物被膜形成研究以及有效防控生物被膜相關(guān)感染性疾病,是今后的重要研究方向。

    參考文獻

    [1]DeLeo FR,Chambers HF.Reemergence of Antibiotic-Resistant Staphylococcus Aureus in the Genomics Era[J].J Clin Invest,2009, 119(9):2464-2474.

    [2]Moormeier DE,Bayles KW.Mol Microbiol.Staphylococcus Aureus Biofilm:A Complex Developmental Organism[J].2017;104(3):365-376.

    [3]祝司霞.細菌生物膜的結(jié)構(gòu)及形成機制的研究進展[J].沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2015,17(2):115-117.

    [4]李燕,李冬冬,宋真,等.4種方法檢測表皮葡萄球菌生物膜形成能力的應(yīng)用價值探討[J].中國實驗診斷學(xué),2011,15(3): 424-427.

    [5]李冰,劉曉晨,李琳,等.金黃色葡萄球菌生物被膜基因型的分子鑒定[J].現(xiàn)代食品科技,2015,31(7):74-79.

    [6]胡錦松,陳豪泰,張杰,等.細菌生物被膜鑒定方法的研究進展[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2010,40(11):1194-1199.

    [7]Ding YZ,Zhou YF,Yao J,et al.In situ molecular imaging of the biofilm and its matrix[J].Analytical Chemistry,2016,88(22):11244-11252.

    [8]Pereira FDES,Bonatto CC,Lopes CAP,et al.Use of MALDI-TOF mass spectrometry to analyze the molecular profile of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on glass and plastic surfaces[J].Microbial Pathogenesis,2015,86:32-37.

    Abstract: Staphylococcus aureus is an important pathogen causing nosocomial infection. Biofilm is an important virulence factor for Staphylococcus aureus. Many cases of clinical infections are related to biofilm. Understanding the formation mechanism and detection methods of biofilm is very important for controlling the infection and drug resistance, and formulating effective preventive measures and treatment programs. This article reviews the formation and detection methods of Staphylococcus aureus biofilm

    Key words: Staphylococcus aureus; biofilm; detection methods

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