基于SERS納米探針的細(xì)胞內(nèi)硝基還原酶檢測

鄭有為，田 菲，張 倩，徐 迪，楊國海，渠陸陸

（江蘇師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,徐州221116）

癌細(xì)胞的增殖和生長會(huì)導(dǎo)致耗氧量的增加，進(jìn)而使細(xì)胞處于缺氧環(huán)境［1］.細(xì)胞缺氧會(huì)影響細(xì)胞的有氧呼吸，進(jìn)而損害線粒體的氧化磷酸化，使得ATP的產(chǎn)生減少甚至停止，導(dǎo)致細(xì)胞受損，危害人體健康［2，3］.因此，開發(fā)一種能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測細(xì)胞缺氧產(chǎn)生和發(fā)展進(jìn)程的有效方法，對癌癥的早期診斷治療具有重大意義.研究表明，細(xì)胞缺氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中某些還原酶，如硝基還原酶（NTR）、偶氮還原酶及心肌黃酶等［4，5］的含量異常增高.其中，對NTR的檢測已經(jīng)成為研究細(xì)胞缺氧的熱點(diǎn)［6～8］.NTR是一種能夠催化還原芳香硝基為芳香胺的酶.在缺氧條件下，以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）作為電子供體，可使細(xì)胞內(nèi)NTR催化芳香硝基化合物發(fā)生單電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生硝基陰離子自由基，最終被還原為羥胺或氨基.細(xì)胞缺氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NTR含量升高，因此NTR可作為檢測腫瘤細(xì)胞缺氧狀態(tài)的重要標(biāo)志物.

近年來，已開發(fā)了一系列基于NTR催化還原反應(yīng)的熒光探針用于缺氧檢測［9～11］.Zhang等［12］報(bào)道了一種用于監(jiān)測缺氧環(huán)境和檢測活體腫瘤細(xì)胞中NTR的雙光子探針.Xu等［13］設(shè)計(jì)了一種新型的“開關(guān)”熒光探針，通過間接檢測腫瘤細(xì)胞在低氧條件下的NTR含量來實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的成像.Guo等［14］開發(fā)了一種長波長熒光探針，可在低氧條件下進(jìn)行高靈敏、高選擇性地NTR檢測，并能在內(nèi)源性干擾最小的情況下進(jìn)行低氧細(xì)胞成像.但是，熒光探針存在穩(wěn)定性差、易光漂白等缺陷，因此一些基于表面拉曼增強(qiáng)散射（SERS）的傳感器被開發(fā)用于細(xì)胞缺氧的研究.SERS技術(shù)可以避免光漂白現(xiàn)象的產(chǎn)生，且能提供更準(zhǔn)確的分子指紋信息［15～18］.Jiang等［19］開發(fā)了一種SERS納米傳感器用于監(jiān)測缺氧細(xì)胞的氧化還原電位.Ma等［20］利用可激活的SERS納米探針對缺氧誘導(dǎo)的肺腫瘤細(xì)胞和組織的細(xì)胞內(nèi)酸化進(jìn)行定量監(jiān)測，實(shí)現(xiàn)了對缺氧細(xì)胞內(nèi)pH動(dòng)態(tài)變化的監(jiān)測.迄今，基于SERS技術(shù)傳感對細(xì)胞缺氧的研究較多，但是用于缺氧細(xì)胞中NTR的研究較少.

本文設(shè)計(jì)了一種基于SERS技術(shù)的Au NPs@p-NTP納米探針，該探針可用于檢測缺氧細(xì)胞中的NTR，其制備過程和傳感原理如Scheme 1所示.在NTR催化還原反應(yīng)的基礎(chǔ)上，選用對硝基苯硫酚（p-NTP）作為硝基芳族底物.由于金納米粒子（Au NPs）具有高的SERS增強(qiáng)效應(yīng)，因此將p-NTP修飾到Au NPs表面，制備了SERS納米探針（Au NPs@p-NTP）.在缺氧條件下，以NADH作為電子供體，可以將p-NTP還原為對氨基苯硫酚（p-ATP）.NTR的活性和含量對催化還原反應(yīng)具有一定影響，由于p-NTP和p-ATP在SERS光譜中呈現(xiàn)出不同的特征峰，所以可以通過觀察SERS光譜的變化來監(jiān)測氧化還原反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而檢測NTR的含量.

Scheme 1 Preparation of Au NPs@p-NTP nanoprobe(A)and sensing mechanism of Au NPs@p-NTP nanoprobe in cells(B)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

氯化鉀（KCl）、氯化鈉（NaCl）、氯化鎂（MgCl2）、氯化鈣（CaCl2）、氫氧化鈉（NaOH）、硼酸（H3BO3）、磷酸（H3PO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）和磷酸氫二鈉（Na2HPO4）均為分析純，以及氯金酸三水合物（HAuCl4·3H2O，純度≥99.9%）、檸檬酸鈉（純度98%）、對氨基苯硫酚（p-ATP，純度≥90%）和對硝基苯硫酚（p-NTP，純度95%）均購自阿拉丁試劑公司（上海）；硝基還原酶（NTR，純度≥90%）、L-絡(luò)氨酸（L-tyrosine，純度≥98%）、牛血清白蛋白（BSA，30%±2%）、葡萄糖氧化酶（GOD，100～250 U/mg）、辣根過氧化酶（HRP，≥250 U/mg）、L-還原型谷胱甘肽（GSH，純度≥98%）、L-半胱氨酸（Cys，純度≥98%）和β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，純度≥95%）購自美國Sigma Aldrich Chemicals公司；A549（肺腺癌上皮細(xì)胞）購自Key Gen Biotech有限公司（上海）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4）由KCl（2.7 mmol/L）、NaCl（136.7 mmol/L）、KH2PO4（1.41 mmol/L）和Na2HPO4（8.72 mmol/L）配制而成；實(shí)驗(yàn)中所用超純水（電阻率＞18 MΩ/cm）均由Milli-Q純化系統(tǒng)（美國Mil-lipore公司）純化所得.

NanoDrop 2000c型紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis，美國Thermo Fisher公司）用來獲得納米結(jié)構(gòu)的紫外-可見吸收光譜；使用JEM-2100型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）在200 kV加速電壓下進(jìn)行透射電子顯微鏡（TEM）成像；拉曼光譜用Via Renishaw型拉曼顯微鏡（英國Renishaw公司）測得（激發(fā)波長785 nm，激光功率2 mW，激光光斑尺寸2μm，曝光時(shí)間3 s）；用680型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）進(jìn)行噻唑藍(lán)（MTT）測試.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 Au NPs的合成參照文獻(xiàn)［21］方法，以檸檬酸鹽為還原劑制備Au NPs.室溫下，在100 mL去離子水中加入HAuCl4（4.8 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%），劇烈攪拌下迅速將溶液加熱至沸騰；將檸檬酸三鈉溶液（10 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%）逐滴加到沸騰溶液中，持續(xù)攪拌使溶液保持微沸至顏色不再變化，以確保HAuCl4被完全還原.將反應(yīng)體系從熱源移開并冷卻至室溫，制得的Au NPs溶液保存于4℃冰箱中，備用.

1.2.2 Au NPs@p-NTP納米探針的制備將p-NTP溶液（500μL，5.0×10-4mol/L）逐滴加入到Au NPs（1 mL）溶液中，將混合溶液于室溫靜置1 h后，以8000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，以除去未與Au NPs結(jié)合的p-NTP，重新分散所得溶液即為Au NPs@p-NTP納米探針溶液.

1.2.3 SERS檢測為了保持酶活性，將NTR粉末溶解在超純水中，并在-20℃條件下儲(chǔ)存.將氮?dú)夥謩e通入NADH溶液、NTR溶液以及Au NPs@p-NTP納米探針溶液中以除去溶液中的氧氣.在緩沖液中加入除氧后的NADH溶液、NTR溶液和Au NPs@p-NTP納米探針溶液各10μL，混合均勻后通入氮?dú)獬パ鯕?分別對Au NPs@p-NTP納米探針溶液、p-ATP溶液、p-NTP溶液以及反應(yīng)后的混合溶液進(jìn)行SERS檢測.隨后，將不同濃度的NTR溶液、NADH溶液和Au NPs@p-NTP納米探針溶液在緩沖液中混合，對混合溶液除氧后進(jìn)行SERS檢測.

將Au NPs@p-NTP納米探針溶液（10μL）分別與不同離子、活性物質(zhì)（如NO，·OH，等）及其它生物樣品混合，測定混合溶液的SERS光譜，以考察該探針的選擇性.加入的干擾物質(zhì)最終濃度為1μmol/L.通過亞硝酸鈉與鹽酸反應(yīng)制備NO；將硫酸亞鐵銨溶液（0.1 mmol/L）與H2O2（1 mmol/L）反應(yīng)制備·OH；將焦性沒食子酸（0.1 mL，1 mmol/L）滴加到2.98 mL Tris-HCl緩沖溶液中，在25℃的恒溫水浴箱中孵育20 min制備

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及SERS信號(hào)收集在37℃下，將A549細(xì)胞株培養(yǎng)在含有DMEM介質(zhì)的培養(yǎng)基中，并補(bǔ)以10%胎牛血清、青霉素（100μg/mL）和鏈霉素（100μg/mL）.分別在常氧下的加濕培養(yǎng)箱（95%空氣和5%CO2）和不同的缺氧（80%N2+15%O2+5%CO2；85%N2+10%O2+5%CO2；90%N2+5%O2+5%CO2；94%N2+1%O2+5%CO2）條件下培養(yǎng).將Au NPs@p-NTP納米探針添加到培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h；除去培養(yǎng)基后，分別對不同缺氧程度下細(xì)胞進(jìn)行拉曼信號(hào)采集.

1.2.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT法）在96孔培養(yǎng)板中接種A549細(xì)胞，接種密度為1×105個(gè)細(xì)胞/孔，然后于37℃下培養(yǎng)24 h.棄去培養(yǎng)基后，將含有不同濃度梯度的Au NPs@p-NTP納米探針溶液的培養(yǎng)液依次加入到每個(gè)孔中，分別孵育不同時(shí)間.然后，棄去孔中培養(yǎng)液，將各孔用PBS緩沖液洗滌3次，分別加入MTT試劑（10μL，5 mg/mL）.將培養(yǎng)板繼續(xù)在37℃下孵育4 h后，去除孔中的溶液，然后向每孔中分別加入100μL DMSO.為了溶解由活細(xì)胞形成的晶體，將96孔板在室溫下振蕩15 min.最后，置于酶標(biāo)儀下于490 nm處讀取每個(gè)孔的吸光度值，并通過公式（Atest/Acontrol）×100%計(jì)算相對細(xì)胞活性（%）.

2 結(jié)果與討論

2.1 Au NPs@p-NTP納米探針的表征

由TEM照片［圖1（A）］可以觀察到Au NPs為球形結(jié)構(gòu)，平均粒徑約為70 nm.紫外-可見吸收光譜（UV-Vis）［圖1（B）］顯示，Au NPs的特征吸收峰在546 nm處，加入p-NTP后在280 nm處出現(xiàn)1個(gè)新峰，并且特征吸收峰紅移至550 nm，表明Au NPs表面修飾了p-NTP.Zeta電位分析結(jié)果［圖1（C）］顯示，Au NPs的電位值為-42.59 mV，當(dāng)p-NTP修飾在Au NPs上，p-NTP中吸電子基團(tuán)—NO2導(dǎo)致電位值變?yōu)?20.21 mV，進(jìn)一步證明p-NTP被修飾在Au NPs表面.

為了驗(yàn)證該探針可用于檢測NTR，分別采集了Au NPs@p-NTP納米探針以及在無氧且NADH存在條件下，加入NTR反應(yīng)后的探針溶液的SERS光譜.由圖1（D）可見，Au NPs@p-NTP納米探針在855 cm-1（C—H伸縮模式），1076 cm-1（C—S伸縮模式），1344 cm-1（O—N—O伸縮模式）和1568 cm-1（酚環(huán)模式）處出現(xiàn)特征峰［22～24］.加入NTR反應(yīng)后，納米探針在855，1344和1568 cm-1處的特征峰消失，1076 cm-1處的特征峰升高，在1486和1587 cm-1處出現(xiàn)新的特征峰，并且其與p-ATP的SERS光譜幾乎一致.上述結(jié)果表明，在NTR的催化還原作用下，p-NTP的硝基被還原為氨基.

2.2 Au NPs@p-NTP納米探針的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

Fig.1 TEM image of Au NPs(A),UV-Vis spectra(B)and zeta-potentials(C)of Au NPs(a)and Au NPs@p-NTP nanoprobe(b),SERS spectra(D)of Au NPs@p-NTP nanoprobe(a),p-ATP(b)and mixed solution after adding probe and NTR(c)

Fig.2 SERS spectra of Au NPs@p-NTP nanoprobe continuously measured 26 times(A),SERS intensity at 1344 cm-1 in 26 measurements(B),SERS spectra of Au NPs@p-NTP nanoprobe in 1 h(C)and SERS intensity at 855 and 1344 cm-1 in 1 h(D)

納米粒子聚合形成“熱點(diǎn)”可以大幅增強(qiáng)SERS信號(hào)，但是“熱點(diǎn)”的隨機(jī)性分布會(huì)導(dǎo)致基底的重現(xiàn)性差，從而降低SERS技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值［25］.因此，SERS信號(hào)的重現(xiàn)性是評估納米探針的重要參數(shù)之一.因此，對Au NPs@p-NTP納米探針進(jìn)行了連續(xù)26次的SERS檢測，以考察Au NPs@p-NTP納米探針的重現(xiàn)性，發(fā)現(xiàn)在1344 cm-1處所獲得的譜圖均能很好地重疊，信號(hào)強(qiáng)度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差約為10.4%，表明制備的探針具有優(yōu)異的重現(xiàn)性［圖2（A）和（B）］.進(jìn)一步在正常條件下和高濃度GSH（2 mmol/L）生理?xiàng)l件下對制備的Au NPs@p-NTP納米探針進(jìn)行連續(xù)1 h的SERS檢測，以考察該納米探針的穩(wěn)定性.結(jié)果［圖2（C）和（D）及圖S1（見本文支持信息）］表明，在不同時(shí)間內(nèi)，在855和1344 cm-1處均可以觀察到特征峰，并且信號(hào)強(qiáng)度無明顯變化，說明Au NPs@p-NTP納米探針具有良好的穩(wěn)定性.

2.3 Au NPs@p-NTP納米探針傳感檢測NTR

在缺氧狀態(tài)及存在NADH的條件下，將不同濃度的NTR溶液與探針溶液均勻混合，對混合后的溶液進(jìn)行SERS光譜檢測.如圖3（A）所示，隨著NTR濃度的升高，1587 cm-1處的特征峰強(qiáng)度逐漸增大，1568 cm-1處的特征峰強(qiáng)度逐漸降低，且I1587/I1568與NTR濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系［圖3（B）］，檢出限為18 ng/mL.因此，可以利用Au NPs@p-NTP納米探針對NTR進(jìn)行定量檢測.

Fig.3 SERS spectra of Au NPs@p-NTP nanoprobe reacted with different concentrations of NTR(from bottom to top:0.018,0.03,0.06,0.1,0.2,0.5,1.0μg/mL)(A),linear relationship between SERS intensity ratio of 1587 cm-1 vs.1568 cm-1 and NTR concentration(B),SERS response of Au NPs@p-NTP nanoprobe in the presence of NADH and various species(C)and SERS intensity ratio of 1587 cm-1 vs.1076 cm-1 in various species(D)

此外，分別在Au NPs@p-NTP納米探針溶液中加入NTR，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，GOD，HRP，GSH，Cys，H2O2，NO，BSA，絡(luò)氨酸，·OH及等多種陽離子，活性物質(zhì)及其它生物相關(guān)樣品，以考察Au NPs@p-NTP納米探針對NTR的選擇性.圖3（C）為納米探針溶液在添加不同樣品后的SERS光譜.SERS譜峰強(qiáng)度和峰位移在加入不同樣品后均未發(fā)生明顯改變［圖3（D）］，而在加入NTR后，855及1344 cm-1處特征峰峰值明顯下降，并在1486及1587 cm-1處出現(xiàn)新的特征峰，表明Au NPs@p-NTP納米探針對NTR具有高度選擇性.

2.4 缺氧細(xì)胞中的NTR檢測

為了驗(yàn)證Au NPs@p-NTP納米探針的細(xì)胞毒性，進(jìn)行了MTT測試.將A549細(xì)胞與探針溶液孵育不同的時(shí)間后，測定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度，進(jìn)行細(xì)胞相對存活率的計(jì)算，結(jié)果顯示細(xì)胞與Au NPs@p-NTP納米探針經(jīng)過12 h孵育后存活率仍然高達(dá)91.4%（圖4），證明Au NPs@p-NTP納米探針的細(xì)胞毒性很低，適用于細(xì)胞內(nèi)檢測.

為了證明Au NPs@p-NTP納米探針對腫瘤細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)NTR的檢測應(yīng)用能力，在37℃下，將A549細(xì)胞分別在常氧（20% O2）和不同的低氧（15%，10%，5%和1%O2）條件下生長，并在這些條件下分別與探針孵育4 h，隨后進(jìn)行SERS檢測.如圖5（A）所示，在常氧條件下，在1568 cm-1處的特征峰強(qiáng)度未發(fā)生明顯降低.隨著O2濃度的降低，在1587 cm-1處出現(xiàn)新的特征峰，并隨著缺氧量的增加強(qiáng)度明顯增加［圖5（B）］，說明該探針可以指示細(xì)胞內(nèi)缺氧的程度.因此，可以在細(xì)胞中孵育Au NPs@p-NTP納米探針后，采用SERS對細(xì)胞中NTR含量進(jìn)行分析，從而判斷細(xì)胞缺氧程度.

Fig.4 Cell viability after incubation of probe solution with A549 cells at different time

Fig.5 SERS spectra of Au NPs@p-NTP nanoprobe incubated with A549 cells under normoxic(20%O2)and different hypoxic(15%,10%,5%,and 1% O2)conditions for 4 h(A)and SERS intensity at I1587/I1568 as function of different hypoxic(B)

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)了一種基于SERS檢測技術(shù)的Au NPs@p-NTP納米探針，該探針通過將p-NTP修飾到Au NPs表面制備而成，并用于檢測缺氧細(xì)胞中NTR的含量，通過SERS光譜的變化可測定低氧狀態(tài)下NTR的含量及活性，并表現(xiàn)出優(yōu)異的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性.Au NPs@p-NTP探針對A549具有較低的毒性，在細(xì)胞中孵育可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的NTR活性的特異性檢測.本文設(shè)計(jì)的納米探針能夠監(jiān)測NTR在缺氧細(xì)胞中的變化，為篩選和優(yōu)化腫瘤藥物提供了新的策略.

支持信息見http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20200346.