多肽熒光傳感器檢測(cè)銅離子

阿 麗，王 勇，2

（1.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院；2.現(xiàn)代分析科學(xué)江西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌330031）

銅是水中一種微量的金屬元素，在生物體的新陳代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但過(guò)量的銅對(duì)生物體危害極大.銅離子污染的環(huán)境水常被用作生活用水或灌溉用水，直接影響生物體的生長(zhǎng)和發(fā)育，因此探索快速、靈敏、選擇檢測(cè)水樣中銅離子的方法對(duì)于環(huán)境監(jiān)測(cè)具有重要意義［1，2］.目前，環(huán)境水中銅離子的檢測(cè)方法有原子吸收光譜法［3］、電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法［4］和電感耦合等離子體-質(zhì)譜法等［5］，然而這些方法操作復(fù)雜，樣品處理較為煩瑣且成本較高.相比較而言，熒光光譜法由于靈敏度高、操作簡(jiǎn)單和響應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn)近年來(lái)受到廣泛關(guān)注［6］.然而，銅離子本身不具有熒光，因此不能使用直接熒光分析方法進(jìn)行定量檢測(cè)，這就需要采用借助于熒光探針的間接熒光法來(lái)對(duì)銅離子進(jìn)行檢測(cè).這種間接熒光法檢測(cè)銅離子通常選擇性不佳，因此迫切地需要開(kāi)發(fā)出分子識(shí)別受體結(jié)合熒光探針實(shí)現(xiàn)銅離子的選擇靈敏檢測(cè).

多肽因易于制備、成本相對(duì)較低、生物相容性優(yōu)良、水溶性好及對(duì)分析物具有高親和力等優(yōu)點(diǎn)而成為優(yōu)良的分子識(shí)別受體［7］.據(jù)文獻(xiàn)［8～12］報(bào)道，精氨酸、組氨酸和賴氨酸對(duì)銅離子有高親和力，基于此，本文設(shè)計(jì)了羅丹明B標(biāo)記的多肽序列（RBP）作為識(shí)別銅離子的選擇性生物受體，發(fā)現(xiàn)低濃度的銅離子能夠猝滅該多肽的熒光，據(jù)此構(gòu)建了檢測(cè)銅離子的傳感器，檢測(cè)原理如Scheme 1所示.

Scheme 1 RBP-based fluorescent detection of Cu2+

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

羅丹明B標(biāo)記的多肽（RNRHTHLRTRPRK-Rhodamin B，RBP，結(jié)構(gòu)見(jiàn)Scheme 2）購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司，每條多肽標(biāo)記1個(gè)羅丹明B熒光團(tuán)，標(biāo)記過(guò)程中羅丹明B熒光團(tuán)通過(guò)羧基與多肽末端賴氨酸側(cè)鏈的氨基進(jìn)行鍵合；三羥甲基氨基甲烷購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；羅丹明B、醋酸和醋酸鈉購(gòu)自上海試劑廠；鹽酸、六水合硝酸銅購(gòu)自西隴化工股份有限公司（汕頭）；所用化學(xué)試劑均為分析純.用醋酸鈉和醋酸配制100 mmol/L pH=3～6的緩沖溶液；用三羥甲基氨基甲烷和鹽酸配制100 mmol/L pH=7～8的緩沖溶液.實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.

Scheme 2 Chemical structure of the RBP

F-4600型熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）；UV-2550型分光光度計(jì)（日本島津公司）；C11367-11型熒光壽命測(cè)試儀（日本濱松光子學(xué)公司）；MOS-450型多功能圓二色光譜儀（法國(guó)Bio-Logic公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 熒光測(cè)定銅離子在含1.0μmol/L RBP的醋酸鈉/醋酸緩沖液（10 mmol/L，pH=5）中加入不同濃度的銅離子，混合均勻后于室溫下反應(yīng)3 min，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè).

1.2.2 湖水中銅離子的預(yù)處理及測(cè)定水樣取自南昌市潤(rùn)溪湖，先將水樣在10000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上層液用0.22μm濾膜過(guò)濾，按照1.2.1節(jié)方法對(duì)銅離子進(jìn)行測(cè)定.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同pH下RBP多肽對(duì)銅離子的熒光行為

圖1（A）和（B）分別為在不同pH的10 mmol/L醋酸鈉/醋酸緩沖液中有、無(wú)銅離子存在時(shí)的RBP多肽的熒光光譜.可見(jiàn)，無(wú)論有無(wú)銅離子存在，在激發(fā)波長(zhǎng)為550 nm處，RBP多肽的熒光發(fā)射強(qiáng)度均隨著緩沖液pH值的增大而降低，其原因可能是增加pH加大了RBP多肽分子的聚集程度.基于RBP多肽分子的等電點(diǎn)值（pI=12.71），RBP多肽分子在整個(gè)研究的pH范圍內(nèi)（pH=3.0～8.0）均帶正電，而增加溶液pH值將導(dǎo)致RBP多肽分子中的氨基去質(zhì)子化，從而有利于RBP分子的聚集，這將有利于羅丹明B的非熒光二聚體或聚集體的形成，從而增強(qiáng)其熒光猝滅［13，14］.由圖1（C）和（D）可見(jiàn)，當(dāng)緩沖溶液pH=5.0時(shí)，在600 nm處無(wú)銅離子存在下的RBP多肽熒光發(fā)射強(qiáng)度（F0）與有銅離子存在下的RBP多肽熒光強(qiáng)度（F）之差最大，因此選擇pH=5.0作為熒光檢測(cè)銅離子的最優(yōu)條件.

2.2 反應(yīng)時(shí)間的選擇

考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)Cu2+檢測(cè)的影響，結(jié)果表明，將3.0μmol/L的Cu2+加入到RBP溶液中時(shí)，RBP的熒光發(fā)生猝滅，反應(yīng)3 min即可達(dá)到穩(wěn)定.因此，選擇反應(yīng)時(shí)間為3 min.

2.3 銅離子的熒光檢測(cè)

圖2（A）為向pH=5.0的10 mmol/L醋酸鈉/醋酸緩沖液中加入不同濃度銅離子后RBP多肽的熒光光譜.可見(jiàn)，隨著銅離子濃度的增加，RBP多肽的熒光強(qiáng)度逐漸減小.有、無(wú)銅離子存在下的RBP多肽熒光強(qiáng)度比（F/F0）與銅離子濃度（c，μmol/L）之間存在2個(gè)良好的線性關(guān)系［圖2（B）］，這2個(gè)線性范圍分別為0.0005～0.01μmol/L和0.1～7μmol/L，相應(yīng)的線性回歸方程分別為F/F0=0.96-22.56c，相關(guān)系數(shù)為0.999；F/F0=0.74-0.04c，相關(guān)系數(shù)為0.996.根據(jù)3倍信噪比估算出銅離子的檢出限為0.29 nmol/L，此檢出限遠(yuǎn)低于世界衛(wèi)生組織和美國(guó)環(huán)境保護(hù)署對(duì)水中銅離子最大污染水平的規(guī)定［15］.

Fig.1 Fluorescence spectra of RBP(1.0μmol/L)without(A)and with(B)Cu2+(3.0μmol/L)in 10 mmol/L buffer solutions with different pH values,effects of pH on the fluorescence intensity(C)and net fluorescence intensity(D)of RBP with or without Cu2+

Fig.2 Fluorescence emission spectra of RBP with different concentrations of Cu2+(A)and plot of F/F0 ersus Cu2+concentration(B)

2.4 熒光傳感機(jī)理研究

圖3（A）為在pH=5.0的10 mmol/L醋酸鈉/醋酸緩沖液中有、無(wú)銅離子存在時(shí)羅丹明B的熒光光譜.可見(jiàn)，加入銅離子后羅丹明B的熒光光譜幾乎無(wú)變化，說(shuō)明銅離子誘導(dǎo)RBP多肽的熒光猝滅不是由RBP多肽中的羅丹明B單元與銅離子的相互作用導(dǎo)致，而可能是因?yàn)镽BP多肽中的多肽單元和銅離子的結(jié)合導(dǎo)致.因此，進(jìn)一步利用共振光散射和紫外-可見(jiàn)吸收光譜探究了RBP多肽與銅離子的相互作用.由圖3（B）可見(jiàn)，加入銅離子后，RBP多肽的共振光散射增強(qiáng)，說(shuō)明銅離子的加入促進(jìn)了RBP多肽的聚集.此外，由圖3（C）可見(jiàn)RBP多肽在562 nm處有強(qiáng)吸收譜帶，低濃度銅離子在此波長(zhǎng)范圍無(wú)吸收，當(dāng)銅離子加入到RBP多肽溶液中后吸收譜帶藍(lán)移557 nm，這說(shuō)明銅離子促進(jìn)了RBP多肽的聚集，RBP多肽的聚集很可能增強(qiáng)羅丹明B的非熒光二聚體或聚集體的形成［16，17］.同時(shí)，紫外-可見(jiàn)吸收光譜也表明，熒光猝滅機(jī)理與RBP多肽和銅離子之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移或它們之間的內(nèi)濾效應(yīng)無(wú)關(guān).另外，實(shí)驗(yàn)還測(cè)定了有、無(wú)銅離子存在時(shí)RBP多肽的熒光壽命，發(fā)現(xiàn)RBP多肽的熒光壽命約為2.11 ns，而加入銅離子后RBP多肽的熒光壽命幾乎無(wú)變化，約為2.04 ns，進(jìn)一步說(shuō)明熒光猝滅機(jī)理可能是因?yàn)殂~離子與RBP多肽結(jié)合，從而誘導(dǎo)羅丹明B的非熒光二聚體或聚集體的形成.將圓二色光譜進(jìn)一步用于有、無(wú)銅離子存在時(shí)RBP多肽的結(jié)構(gòu)表征.由圖3（D）可見(jiàn)，RBP多肽在200，206和214 nm處的紫外區(qū)間有強(qiáng)的負(fù)譜帶，而在196 nm處顯示強(qiáng)的正譜帶，這些譜帶歸屬于多肽的β折疊和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)［18］；當(dāng)加入銅離子后，200和206 nm處的譜帶強(qiáng)度減弱而224和240 nm處的譜帶強(qiáng)度增強(qiáng)，說(shuō)明銅離子的加入增加了RBP多肽的α螺旋和β轉(zhuǎn)角的含量，而減少了β折疊和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的含量［18］，此外，還表明銅離子的加入可能導(dǎo)致RBP多肽結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而使羅丹明B熒光團(tuán)彼此接近形成非熒光二聚體或聚集體.

Fig.3 Fluorescence spectra of Rhodamine B without and with Cu2+(3.0μmol/L)in 10 mmol/L NaAc/HAc buffer solution(A);resonance light scattering spectra of RBP without and with Cu2+in 10 mmol/L NaAc/HAc buffer solution(B);UV-Vis absorption spectra of RBP(45μmol/L)and Cu2+(7.0μmol/L)alone,as well as their mixture(C)and CD spectra of RBP(5.0μmol/L)without and with Cu2+(7.0μmol/L)(D)

2.5 傳感器的選擇性

為了評(píng)價(jià)此RBP多肽熒光傳感器對(duì)銅離子的選擇性，測(cè)試了加入不同金屬離子（Ag+，Sn2+，Ba2+，Ni2+，Cd2+，Cr3+，Pb2+，Mn2+，Al3+，Hg2+，Ca2+，Zn2+，K+，F(xiàn)e3+，F(xiàn)e2+，Li+）后RBP多肽的熒光響應(yīng)［圖4（A）］.由圖4（B）可見(jiàn)，加入銅離子后F/F0顯著減小，而加入其它金屬離子所導(dǎo)致的F/F0的變化很小，表明基于RBP的熒光傳感器對(duì)銅離子有高選擇性.此外，考察了RBP多肽與銅離子作用的共存離子效應(yīng)，測(cè)試了在RBP多肽中加入Cu2+和上述其它金屬離子后RBP多肽的熒光響應(yīng)［圖4（C）］.由圖4（D）可見(jiàn)，在RBP多肽中同時(shí)加入Cu2+和其它不同金屬離子后的F/F0值與僅加入Cu2+的接近，進(jìn)一步說(shuō)明此熒光傳感器對(duì)銅離子有高選擇性.

2.6 實(shí)際水樣分析

為了評(píng)價(jià)該熒光傳感器檢測(cè)實(shí)際樣品中的實(shí)用性，對(duì)南昌市潤(rùn)溪湖的水樣進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)水樣中含有0.002μmol/L的銅離子，隨后將不同濃度的銅離子加入到湖水樣中評(píng)價(jià)了該方法的可靠性.由表1可見(jiàn)，添加值和測(cè)量值接近，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜4.4%，說(shuō)明該方法可用于水樣中銅離子的檢測(cè).

Fig.4 Fluorescence emission spectra of RBP(1.0μmol/L)without(blank)or with each metal ion(3.0μmol/L)(A);F/F0 value without(blank)or with each metal ion(3.0μmol/L)(B);fluorescence emission spectra of RBP(1.0μmol/L)without(blank)or with Cu2+in the presence of each metal ion(3.0 μmol/L)(C);F/F0 value without(blank)or with Cu2+in the presence of each metal ion(3.0μmol/L)(D)

Table 1 Determination of Cu2+in spiked water samples(n=3)

3 結(jié) 論

基于銅離子對(duì)羅丹明B標(biāo)記的多肽的熒光猝滅作用，構(gòu)建了一種用于檢測(cè)銅離子的高選擇、高靈敏熒光傳感器.該傳感器檢測(cè)銅離子的線性范圍為5×10-4～1×10-2μmol/L和0.1～7μmol/L，檢出限為0.29 nmol/L，可用于實(shí)際水樣中銅離子的檢測(cè).預(yù)期此熒光傳感原理結(jié)合選擇性多肽可用于構(gòu)建檢測(cè)食品或環(huán)境中其它有毒有害物質(zhì)的傳感器.