單原子催化劑的生物醫(yī)學應(yīng)用

袁中文，賀利貞，陳填烽

（暨南大學化學系,廣州510632）

單原子催化劑（SACs）是指孤立金屬原子穩(wěn)定在合適載體上的催化劑，目前已發(fā)展成為催化科學領(lǐng)域中最具創(chuàng)新性和發(fā)展最快的研究方向之一［1］.SACs中單原子與載體界面結(jié)合產(chǎn)生的強金屬-支撐相互作用能夠有效阻止單原子遷移和聚集，并促進低配位環(huán)境和電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)，同時充分暴露的活性原子中心使其具有更高的催化活性［2］.2011年，Zhang等［3］首次報道了SACs，實現(xiàn)了單原子Pt穩(wěn)定分散在FeOx載體上用于CO的催化氧化.2017年，F(xiàn)ako等［4］探究了不同載體（氧化物、金屬或氮化碳）對SACs的影響，發(fā)現(xiàn)SACs穩(wěn)定性和活性的特殊性質(zhì)在很大程度上取決于所選擇的基質(zhì).在含氮碳材料上錨定單金屬原子可以得到含有M-Nx-C位點的SACs，其與天然金屬酶的M-Nx位點相似.如，氧肌紅蛋白、辣根過氧化物酶（HRP）和細胞色素P450酶的活性位點在近端配體處含有血紅素b輔因子，類似于鐵基SACs中的FeN4和FeN5位點［5～7］.事實上，SACs具有許多和酶催化劑相似的特征，特別是在幾何和化學結(jié)構(gòu)以及原子水平上的電子結(jié)構(gòu)方面，并且與天然酶和納米酶相比，SACs具有合成策略更簡單、活性中心和形貌可控、配位環(huán)境可調(diào)、催化活性更優(yōu)異、成本低、更容易實現(xiàn)商用以及有利于對催化反應(yīng)機理的研究等優(yōu)勢［8］.SACs也代表著最大限度的金屬原子利用率和金屬催化劑最大使用效率，其優(yōu)異的催化活性和選擇性使其成為近年來生物醫(yī)學領(lǐng)域研究最多的催化劑之一［9］.

近十幾年來，納米酶研究發(fā)展迅速，2007年Yan等［10］意外發(fā)現(xiàn)了具有類過氧化物酶活性的Fe3O4納米粒子；2013年，Wei等［11］賦予了“納米酶”清晰的定義——具有類似酶活性的納米材料.納米技術(shù)和生物醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展使納米酶在疾病治療及診斷領(lǐng)域備受關(guān)注［12，13］.從納米顆粒到量子點、原子簇，隨著納米尺寸的進一步減小，材料表現(xiàn)出的性能也愈發(fā)活潑，特別是SACs將尺度范圍縮小到了單個原子水平，催化反應(yīng)可在每一個原子上進行，因此其類酶活性將得到進一步提高，這使得SACs成為連接納米技術(shù)和生物醫(yī)學的高效催化劑的候選者［14］.然而，隨著金屬粒子尺寸發(fā)展到單原子水平，金屬的表面自由能也急劇升高，原子很容易發(fā)生聚集形成團簇或粒子，因此解決單原子的穩(wěn)定性，以制備原子分散的SACs成為了其發(fā)展的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一［15］.

納米技術(shù)的飛速發(fā)展為SACs的制備提供了強力支持，各種各樣的SACs被設(shè)計合成出來，不同的支撐材料或不同的負載金屬原子賦予了SACs多變的材料性能，其中以碳基材料［16］、二維材料［17，18］或金屬氧化物［19，20］作為載體，荷載貴金屬［21，22］或鐵、鈷、鎳［23～25］單原子的研究尤為廣泛，個別研究報道使用了金屬有機框架（MOF）作為載體［26，27］.先進的表征技術(shù)也促進了SACs的迅猛發(fā)展，使它們在催化領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景［28，29］.目前，SACs在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用正處在起步階段，研究較廣泛的載體主要為氮摻雜碳材料，金屬原子對象主要為鐵原子.表1匯總了近年來SACs在腫瘤治療、抗菌、抗氧化及生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用實例［5～8，30～43］.以已應(yīng)用在催化領(lǐng)域的SACs設(shè)計策略指導未來合成具有生物催化效應(yīng)的多功能材料是一項重要工作，將推動納米材料的進一步發(fā)展和應(yīng)用.

Table 1 Examples of application of SACs in biomedical field in recent years

1 單原子催化劑的生物醫(yī)學應(yīng)用

SACs具有100%的金屬原子利用率以及高催化活性和選擇性，在催化領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景［17］，通過排列氮原子與金屬原子將高活性均勻分散的M-Nx位點錨定在碳基材料上作為仿天然金屬酶的單原子納米酶，或者將自身具有類酶活性的單分散金屬原子固定在適合載體上增強催化活性，在催化生物醫(yī)學領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛在應(yīng)用價值.本文綜述了近年來SACs在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用，包括腫瘤治療、抗菌、抗氧化和生物傳感（圖1）；并對其未來的挑戰(zhàn)和機遇做了簡要概述，以期為開發(fā)新一代具有類酶活性的SACs提供合理策略.

1.1 單原子催化劑在腫瘤治療中的應(yīng)用

Fig.1 Illustration of SACs biomedical applications

惡性腫瘤具有高發(fā)病率和致死率，已成為威脅人類健康和導致人類死亡的重要原因之一［44，45］.目前，傳統(tǒng)的化療、放療和手術(shù)切除三大手段在腫瘤治療中仍扮演著重要的角色，靶向治療［45］和免疫治療［46，47］受到廣泛關(guān)注并在臨床上有重大進展；同時，基于有機或無機納米材料［48，49］的光動力學治療（PDT）、光熱治療（PTT）等納米催化治療方法也逐漸得到應(yīng)用［50～52］.然而，腫瘤部位復雜的環(huán)境通常會導致治療失敗，如，乏氧是實體腫瘤一個重要特征，也是造成放療抵抗及不良預(yù)后的一個重要因素［53］.為克服固體腫瘤的長期乏氧環(huán)境、增強PDT治療效果，Zhao等［30］開發(fā)了生物相容性良好、能持續(xù)催化O2生成的單原子Ru納米PDT平臺OxgeMCC-r SAEs［圖2（A）］.其以普魯士藍類似物Mn3［Co（CN）6］2作為MOF，在Ru3+部分取代框架上的Co位點后經(jīng)過NaBH4還原節(jié)點得到了單原子Ru作為催化中心進行原位產(chǎn)氧；另外在MOF自組裝時將具有光敏能力的二氫卟吩e6（Ce6）進行包封，以PVP形成外保護層，最終得到單原子酶OxgeMCC-r SAEs［圖2（B）］.持續(xù)產(chǎn)氧能力測試表明，OxgeMCC-r SAEs體系在20 min內(nèi)能消耗約50%的H2O2［圖2（C）和（D）］，并且在多次添加H2O2后催化活性保持不變［圖2（E）］，證明該體系具有高且穩(wěn)定的催化性能.隨后，對荷載了小鼠乳腺癌的小鼠進行體內(nèi)PDT實驗，經(jīng)激光照射的OxgeMCC-r SAEs組比其它組顯示出明顯的腫瘤抑制作用［圖2（F）］.免疫熒光染色分析證實了OxgeMCC-r SAE對腫瘤內(nèi)缺氧狀態(tài)的原位改善作用［圖2（G）］，這對PDT治療效果做了很好的解析.由于Mn與6個氮原子配位形成高自旋的Mn-N6，使得該體系具有磁共振成像（MRI）能力，腫瘤部位的MRI測試結(jié)果表明，在OxgeMCC-r SAE體系靜脈給藥6 h后MRI信號強度達到最大值，且在48 h后仍然保留有較強的信號［圖2（H）］，顯示了長時間核磁成像指導下的體內(nèi)治療.這項工作為摻入單原子，聯(lián)合成像治療一體化平臺提供了合理可行的設(shè)計策略.

Fig.2 Self-assembled monoatomic nanozyme OxgeMCC-r SAE enhancing tumor PDT[30]

Fig.3 Tumor therapy of monoatomic iron nano catalysts PSAF NCs[31]and porphyrin-like monoatomic iron nano systems P-MOF[32]

在腫瘤微環(huán)境（TME）中原位催化產(chǎn)生有毒的活性氧（ROS）物種以實現(xiàn)腫瘤治療具有很大的吸引力［54］.為實現(xiàn)高催化活性，提高腫瘤相關(guān)納米催化治療的效果，Shi等［31］開發(fā)了單原子鐵納米催化劑（PSAF NCs）.PSAF NCs由Fe（acac）3@ZIF-8在氬氣流保護下經(jīng)過800℃熱裂解3 h得到，其能夠有效響應(yīng)弱酸性的TME選擇性地原位觸發(fā)腫瘤部位芬頓（Fenton）反應(yīng)產(chǎn)生大量有毒的羥基自由基（·OH），進而引起腫瘤細胞的凋亡、脂質(zhì)過氧化物積累和腫瘤細胞鐵下垂［圖3（A）］.此外，基于PSAF NCs的碳載體的光熱轉(zhuǎn)化特性，溫和的光熱使Fenton催化效果更顯著，可以達到完全消除腫瘤的目的.基于密度泛函理論（DFT）計算，揭示了PSAF NCs的催化機制［圖3（B）］.簡言之，在酸性腫瘤環(huán)境下，質(zhì)子介導OH*形成H2O分子并隨后從催化劑的活性中心釋放，從而使其復活以不斷產(chǎn)生·OH；而中性環(huán)境下留在活性位點的OH*物種難以克服能量障礙而解吸，納米催化劑失活導致催化活性顯著下降，這也預(yù)示了PSAF-NCs將具有很好的腫瘤特異性響應(yīng)和生物安全性.在細胞水平上，對小鼠乳腺癌細胞（4T1）增殖抑制作用進行了系統(tǒng)研究，結(jié)果表明，在酸性培養(yǎng)基下100μmol/L H2O2聯(lián)合200μg/mL PSAF NCs處理組觀察到顯著的增殖抑制效果，而中性培養(yǎng)基對細胞毒性作用則較弱［圖3（C）］，這與DFT計算結(jié)果一致.細胞凋亡潛在機制研究表明，PSAF NCs可能通過鐵下垂和凋亡途徑引起細胞死亡［圖3（D）］.在體內(nèi)實驗中，與生理鹽水組對比，PSAF NCs處理組表現(xiàn)出良好的腫瘤抑制效果［圖3（E）］.在結(jié)合光熱治療后，瘤內(nèi)給藥和靜脈給藥組分別在第5天和第9天完全根除腫瘤［圖3（F）］，說明光熱有效增強了Fenton催化治療效果.此項工作為實現(xiàn)腫瘤納米催化治療設(shè)計腫瘤原位Fenton催化體系提供了有效策略.另一項工作中，Zhou等［32］報道了一種類卟啉單原子Fe（Ⅲ）中心的金屬有機骨架（P-MOF），在近紅外光（808 nm）輻射下，通過PDT/PTT聯(lián)合治療評估了P-MOF在癌癥治療中的性能，同時探究了P-MOF光聲成像PAI性能［圖3（G）和（H）］.這項工作預(yù)示了SACs在腫瘤治療和腫瘤成像方面的巨大潛力.

線粒體氧化還原穩(wěn)態(tài)在許多生物過程中起著關(guān)鍵作用［55］，已發(fā)展成為癌癥治療的一個潛在靶點［56］.一個有效治療腫瘤的策略是，通過提高ROS和降低谷胱甘肽（GSH）水平放大線粒體內(nèi)ROS的水平進而誘導癌細胞凋亡［57］.Au能與GSH形成Au—S鍵而消耗GSH，而具有原子活性分散位點的SACs能顯著提高Au原子的利用效率，增強Au原子和GSH之間的生化反應(yīng)選擇性.Liang等［33］報道了一種單原子分散金納米體系（MitoCAT-g），該體系以碳點為支撐材料負載單原子金，再經(jīng)肉桂醛（CA）以及三苯基膦（TPP）修飾得到［圖4（A）］，其實現(xiàn)了15.3%（質(zhì)量分數(shù)）單分散Au原子的高負載.在細胞水平上研究了MitoCAT-g消耗GSH的能力［圖4（C）］，發(fā)現(xiàn)經(jīng)濃度為64μg/mL的MitoCAT-g處理后線粒體GSH水平下降至12%，而當不經(jīng)CA修飾的體系（TPP-CAT-g）與GSH預(yù)孵育以占據(jù)Au原子時線粒體GSH水平幾乎無變化［圖4（D）］，這表明MitoCAT-g高度分散的Au原子對于GSH消耗具有重要意義.MitoCAT-g經(jīng)內(nèi)吞進入細胞后，CA在酸性環(huán)境下釋放并隨后產(chǎn)生ROS，TPP-CAT-g顆粒通過線粒體與GSH形成Au—S鍵進而消耗GSH，因此MitoCAT-g能夠放大線粒體中的氧化應(yīng)激水平并引起細胞凋亡［圖4（B）］，蛋白質(zhì)印跡法檢測促凋亡蛋白的切割和染色體DNA的斷裂也證實這一觀點［圖4（E）和（F）］.體內(nèi)實驗中使用雌性NOD-SCID小鼠荷載病人來源的肝細胞癌原位移植模型（HCC PDX）［圖4（I）］，生理鹽水組所有小鼠在第43天死亡，而MitoCAT-g治療組在第79天和第94天的存活率則分別為87.5%和75%［圖4（G）和（H）］.另外，對比于其它組，MitoCAT-g處理組Bcl-2和Ki67蛋白的表達減少，而caspase-3和TUNEL（脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記物）的表達則增加［圖4（J）］，證明了MitoCAT-g處理的PDX腫瘤細胞凋亡增強，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性.這項工作證明MitoCAT-g是一種很有前途的安全的抗癌藥物，為開發(fā)小尺度支撐材料的單原子催化劑以及設(shè)計單分散金屬用于高效生化反應(yīng)提供了可行策略.

值得一提的是，硒作為人體必要的微量元素之一，具有抗腫瘤、抗氧化及提高免疫力等多種活性，在防治疾病中發(fā)揮著重要作用［58］.過去十年，我們一直致力于元素態(tài)硒的設(shè)計合成及生物醫(yī)藥應(yīng)用方面的研究［59～65］.基于硒的化學價態(tài)變化特性，合成了零價態(tài)的元素納米硒，構(gòu)建了“治療性納米硒藥物”.通過表面化學修飾提高納米硒粒子的分散性質(zhì)與再加工性能，引入高分叉多糖及多糖-蛋白復合物制備了高穩(wěn)定性的納米硒，通過化學手段對其進行形貌調(diào)控及功能化修飾，以提高納米硒的生物利用度、生物相容性及抗腫瘤活性.在此基礎(chǔ)上，基于納米硒的表面化學特性，進行多重靶向性功能化修飾，并將其作為“治療性載體”負載具有協(xié)同作用的小分子抗腫瘤藥物，實現(xiàn)了協(xié)同治療的效果.同時，深入闡明納米硒藥物的抗腫瘤活性與作用機制，發(fā)現(xiàn)該納米體系可通過調(diào)控P53，TrxR，AKT及MAPKs信號通路來發(fā)揮抗腫瘤活性.在此基礎(chǔ)上，針對腫瘤細胞膜高表達多種蛋白質(zhì)與受體（整合素、葉酸受體及生物素受體等）的特點，將腫瘤靶向性識別多肽共價結(jié)合到納米體系表面，構(gòu)建靶向納米藥物，顯著提高了其對腫瘤細胞和正常細胞之間的選擇性，增強抗腫瘤活性，降低毒副作用，同時能有效逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥，真正實現(xiàn)高效低毒及對腫瘤的精準治療.

Fig.4 Oxidative stress for tumor therapy magnified by carbon dot-supported single-atom dispersed gold system MitoCAT-g[33]

盡管如此，這種由硒原子堆徹而成的硒納米粒子的活性表現(xiàn)欠佳，且其活性隨著納米粒子尺寸的減少而增加［66］.單原子催化劑100%的原子利用效率引起了我們的重點關(guān)注，并推測單原子硒納米體系的設(shè)計將會最大程度地解決硒活性欠佳的問題，這也是基于2019年Wang等［5］工作的合理推測.他們將硒原子分散在多孔碳膜上用作肼燃料電池的電極，表現(xiàn)出比最先進的商用Pt/C催化劑更優(yōu)越的催化活性以及在肼氧化反應(yīng)中的高穩(wěn)定性.他們將2種聚離子液體混合在DMF中，然后經(jīng)滴涂、干燥及NH3浸泡以形成多孔聚離子液體膜，最后在真空條件下熱解得到終體系SeNCM［圖5（A）］.由STEM圖像可以看到單原子硒的存在（紅色圈里的白色亮點）［圖5（C）］.特別的是，這種硒單原子很容易被以共價鍵形式存在的大量C原子穩(wěn)定下來，而不是N摻雜碳原子中的少量N原子，與前述的M-Nx位點大有不同，這與半金屬原子的結(jié)構(gòu)優(yōu)點有關(guān)［圖5（B）］.重要的是硒原子作為SeNCM的催化中心在肼氧化性能指標評估中可與Pt/C相媲美［圖5（D）］，其開路電位、最大電流密度和功率密度與Pt/C相近甚至更優(yōu)，表明單原子硒的催化活性足夠高.這項工作將有助于開發(fā)單半金屬原子的SACs，擴大SACs的適用范圍，為更廣闊的生物醫(yī)學應(yīng)用提供強大的動力.

Fig.5 Synthesis and application of single atom selenium anchoring on porous carbon membrane[7]

1.2 單原子催化劑的抗菌應(yīng)用

病原菌引起的細菌感染是威脅人類健康的棘手問題.最近，Liu等［5］將PMCS單原子納米酶體系用于抗菌促傷口愈合［圖6（A）］，該體系以ZIF-8為前驅(qū)體，采用二氧化硅保護法在氮氣氛圍下經(jīng)過800℃熱裂解2 h，隨后用聚乙二醇-維E修飾制得.通過高角度環(huán)形暗場掃描透射電子顯微鏡（HAADFSTEM）、電子能量損失譜（EELS）及擴展X射線吸收精細結(jié)構(gòu)（EXAFS）等表征手段證實了單原子Zn的存在［圖6（B）～（D）］.通過測定酶對底物H2O2的米氏常數(shù)（KM）評估了PMCS納米體系的催化性能，結(jié)果證明PMCS與HRP催化能力相當.通過電子自旋共振（ESR）檢測驗證了·OH產(chǎn)生情況［圖6（F）］.另外，利用密度泛函理論（DFT）計算探究了不飽和活性Zn位點與H2O2作用的可能催化機制［圖6（E）］，即首先H2O2分子被吸附在PMCS的活性部位并迅速被激活，隨后的溶血途徑使H2O2分解形成2個OH*，1個OH*從活性部位逸出形成·OH，另1個OH*保留，該過程的總自由能為0.24 eV［圖6（G）］，在室溫下容易克服從而發(fā)生反應(yīng).體外實驗結(jié)果表明，在H2O2參與下，PMCS在體外對銅綠假單胞菌的生長的抑制率為99.87%［圖6（H）］.在體內(nèi)治療銅綠假單胞菌感染的小鼠創(chuàng)面，經(jīng)PMCS處理的小鼠在第6天傷口完全愈合［圖6（I）］，組織學染色結(jié)果也證實了傷口愈合程度［圖6（J）］.這項工作預(yù)示了SACs作為抗菌傷口愈合劑的潛在應(yīng)用.

抗生素的濫用造成了細菌多藥耐藥（MDR）的問題［67］，而能產(chǎn)生ROS的相關(guān)材料對于增強殺菌活性克服耐藥具有顯著效果，但其催化活性受到材料本身限制［68，69］.利用SACs的高活性和高選擇性等特性，Shi等［34］開發(fā)了一種以無定形碳為載體負載鐵單原子的納米催化劑（SAF-NCs）.基于“包裹高溫熱解”策略，F(xiàn)e單原子進入并取代ZIF-8的Zn位點形成的Fe-N4位點，這類似血紅素的單鐵原子活性位點，能夠有效產(chǎn)生·OH，聯(lián)合碳材料本身的近紅外光熱效果能夠起到良好的殺菌作用［圖7（A）］.在體內(nèi)實驗中，利用碳材料在808 nm激光下產(chǎn)生輕度光熱效果［圖7（B）］，SAF-NCs聯(lián)合NIR對大腸桿菌（革蘭氏陰性菌E.coli）和金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌S.aureus）小鼠體內(nèi)感染模型具有良好的抑制效果［圖6（C）和（D）］，在第7天出現(xiàn)持續(xù)性傷口閉合和結(jié)痂，分別占傷口面積的59.3%和58.3%，而對照組只有約40%.另外，這項工作還特別揭示了SAF-NCs誘導細胞膜破壞的機理，在大腸桿菌懸浮液中細菌細胞劇烈變形，顯示機械應(yīng)力誘導的細胞死亡［圖7（E）］；對于金黃色葡萄球菌細胞，細胞結(jié)構(gòu)的生物完整性被破壞，顯示出典型的類膜破裂細胞死亡命運［圖7（F）］.總的來說，這項工作強調(diào)了SAF-NCs的良好生物相容性以及顯著的抗菌活性，預(yù)示了SACs在仿自然酶活性位點具有巨大的潛力.

Fig.6 Monoatomic zinc nanozyme system PMCS used for antibacterial wound healing[5]

Fig.7 Monoatomic iron nano systems SAF-NCs combined with light and heat for antibacterial therapy[34]

傳統(tǒng)納米酶存在活性位點密度低和催化機制復雜的問題［70，71］，增加活性位點密度和探究類酶活性的本源將有利于提高催化活性和理解催化本質(zhì).Huang等［6］報道了一種能模擬細胞色素P450的單原子納米酶（FeN5SA/CNF）［圖8（A）］，以Zn基MOF包裹鐵酞菁（FePc）作為前驅(qū)體，在氮氣氛圍下經(jīng)過900℃的熱裂解得到具有FeN5/C位點的體系.對比于上文所述的Fe-N4位點，F(xiàn)eN5位點的形成理論研究表明，在MOF和鐵酞菁的煅燒過程中四方平面FeN4位點被保留下來，而含氮有機配體的二級結(jié)構(gòu)單元轉(zhuǎn)化為吡啶氮碳納米結(jié)構(gòu)并隨后與四方FeN4位點在碳納米框架的限制范圍內(nèi)發(fā)生重建形成更具熱力學穩(wěn)定的FeN5/C位點［72］.作者發(fā)現(xiàn)這種FeN5位點類似于細胞色素P450的活性中心，具有顯著的類氧化酶（OXD）活性，是金屬含量正常的Fe-N4催化劑的17倍，并且不同中心金屬原子對類酶活性也有不同的影響［圖8（D）］.對FeN5SA/CNF的類OXD活性增強的催化機理進行DFT計算［圖8（B）］表明，第一步的O2吸附是電子從活性中心轉(zhuǎn)移到被吸附中間產(chǎn)物的活性的關(guān)鍵步驟.不同吸附構(gòu)型的催化劑對O2的吸附能力（吸附能ΔG*O2）不同，F(xiàn)eN5的G*O2最高，強吸附削弱了O—O鍵使反應(yīng)更容易進行，表現(xiàn)出最高的類OXD活性，而FeN4相對活性最低.此外，與MnN5相比，CoN5的G*O2相近而G*O較高，導致由*OOH向*O轉(zhuǎn)變的勢壘較高，因而MnN5更容易激活*OOH的O—O鍵［圖8（C）］，催化活性更高.通過計算得知，類OXD活性的順序為FeN5-SA/CNF＞MnN5-SA/CNF＞CoN5-SA/CNF＞FeN4-SA/CNF.體外抗菌實驗表明，與對照組相比，經(jīng)FeN5SA/CNF處理的大腸桿菌細胞的存活率明顯降低，從SEM圖像可以看出細菌受到嚴重損傷，細胞形態(tài)喪失，此結(jié)果與熒光染色一致［圖8（E）］.此外，在高濃度（500μg/mL）的FeN5SA/CNF環(huán)境下，細胞系中未觀察到明顯的毒性［圖8（F）］，表明FeN5SA/CNF是一種具有高度生物相容性的殺菌納米酶.采用Balb/c小鼠的實際傷口感染模型評價FeN5SA/CNF的實際抗菌效果［圖8（G）和（H）］，在治療4天后，與對照組相比，F(xiàn)eN5SA/CNF治療組小鼠的潰瘍情況明顯緩解，傷口愈合加速，蘇木精和伊紅（H&E）傷口切片染色也證明了這一點，角質(zhì)形成細胞從正常組織轉(zhuǎn)移到創(chuàng)面，治療后正常皮膚表皮逐漸變得完整并增厚.這項工作為單原子納米酶提供了另一個可行設(shè)計方案，為具有OXD活性的單原子材料的抗菌應(yīng)用做出催化機理的解析.

Fig.8 Monatomic iron nanozyme system FeN5 SA/CNF mimics cytochrome P450 for wound healing in mice[6]

1.3 單原子催化劑在抗氧化領(lǐng)域的應(yīng)用

氧化應(yīng)激和許多疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，ROS或活性氮（RNS）物種的大量產(chǎn)生和積累會導致氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡［73］，因此開發(fā)能夠防止或減少活性氧氮物種（RONS）產(chǎn)生從而緩解細胞氧化應(yīng)激損傷的抗氧化劑具有重要意義.Li等［8］報道了一種單原子鐵納米體系（Fe-SAs/NC），通過將鐵酞菁包埋在ZIF-8框架中，以熱裂解的方式得到.實驗表明，該體系具有類過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，可用于清除H2O2和·O2-以保護細胞免受氧化應(yīng)激［圖9（A）］.相比于沒有單分散鐵原子位點的純ZIF-8熱裂解體系（NC），單原子體系的產(chǎn)氧能力和·O2-清除能力更強［圖9（B）和（C）］，這也證明了單原子鐵在模擬CAT和SOD中的重要性.在與HeLa細胞共孵育后Fe-SAs/NC在胞漿中積累［圖9（D）］，在β-拉帕酮［β-Lap，遇到HeLa細胞內(nèi)高表達的NAD（P）H醌氧化還原酶1（NQO1）則被激活產(chǎn)生大量ROS］處理的細胞中，F(xiàn)e-SAs/NC表現(xiàn)出優(yōu)越的ROS清除能力［圖9（E）］.進一步地，Lin等［35］通過機械和熱裂解的方法合成了含有原子分散Fe-N4位點的單原子酶體系（Fe-N/C SACs），其表現(xiàn)出類過氧化物酶（POD），OXD，CAT和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等多酶活性［圖9（F）］.作者基于材料的類CAT和GPx活性的特點進行了細胞水平上的驗證，發(fā)現(xiàn)Fe-N/C SACs能有效清除HeLa細胞內(nèi)ROS，保護細胞免受氧化應(yīng)激［圖9（G）］，并具有良好的生物相容性［圖9（H）］.

Fig.9 Multi-enzyme activities of monatomic iron nano systems Fe-SAs/NC[8]and Fe-N/C SACs[35]

RONs能夠干擾細胞信號傳導、破壞生物分子和結(jié)構(gòu)，進而引起細胞功能紊亂導致器官衰竭和死亡［74］.目前，大多數(shù)納米酶用作抗氧化劑時存在催化活性相對較低且對·NO幾乎沒有清除能力的問題［75，76］.Qu等［36］開發(fā)了一種新的單原子酶（Co/PMCS）用于膿毒癥治療［圖10（A）］，將Co摻雜到ZIF-8中形成Co，Zn共摻雜雙金屬MOF，然后在氮氣流保護下經(jīng)過900℃熱裂解3 h得到Co/PMCS.Co/PMCS具有出色的RONs清除能力［圖10（B）和（C）］，能夠模擬SOD，CAT和GPx等多種酶而有效消除H2O2和

·O2

-［圖10（D）～（F）］；同時通過氧化還原循環(huán)有效地降低·OH；最重要的是，該體系可以通過共卟啉中心的協(xié)同作用有效清除·NO.體內(nèi)實驗表明，在LPS誘導的小鼠膿毒癥模型中，Co/PMCS靜脈給藥組在第14天后，促炎細胞因子TNF-α和IL-6的水平均顯著降低［圖10（G）］，肝細胞損傷程度以及腎功能損害程度也恢復到正常水平，表明Co/PMCS可以有效降低炎癥水平，恢復膿毒癥小鼠的多種機體功能.在大腸桿菌誘發(fā)的菌血癥小鼠模型中，與用PBS處理的對照組對比，Co/PMCS處理組的促炎因子水平顯著降低［圖10（H）］，小鼠的肝、肺、腎、腸和血液中的細菌數(shù)明顯更低［圖10（I）］，同樣說明了該單原子體系的抗氧化緩解炎癥的能力.這項工作增強了應(yīng)用單原子納米酶對抗氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的信心.

外傷性腦損傷后會原位產(chǎn)生大量RONs，引發(fā)一系列生化反應(yīng)和神經(jīng)炎癥，導致神經(jīng)元長期損傷［77］.為了解決這個問題，Zhang等［37］通過在CeO2納米簇上荷載Pt單原子開發(fā)了單原子Pt/CeO2納米酶繃帶［圖11（A）］，Pt/CeO2表現(xiàn)出多酶活性［圖11（B）］.DFT計算結(jié)果表明，Pt單原子更傾向于穩(wěn)定在CeO2（111）晶面上并誘導晶格膨脹和擇優(yōu)分布，顯著提高了CeO2的內(nèi)生催化活性［圖11（C）］.通過比較束縛在Pt/CeO2（111）晶面上的自由基的能量與未束縛在Pt/CeO2（111）晶面上的自由基和自由基單元的自由能總和，計算體系的能量差.·NO和·OH被吸附在Pt/CeO2（111）晶面的能量差分別為0.16和0.13 eV，相對較低的能量差表明Pt/CeO2體系對這些自由基具有較高的催化活性.相比之下，ONOO-和·O2-分別顯示出0.24和0.28 eV的相對高能量差，表明催化過程中的相對高能量消耗［圖11（D）］.Pt/CeO2納米酶的RONs清除效率檢測結(jié)果顯示，該體系對ONOO-，·OH和·NO的清除率分別達到86%，100%和100%，而對CeO2簇的清除率僅為36%，37%和19%［圖11（E）］，這些數(shù)據(jù)與上述能量差計算結(jié)果符合，也證明了單原子Pt在催化劑中的重要作用.體外抗炎活性測試表明，Pt/CeO2可以降低由H2O2誘導的炎癥因子，包括白細胞介素IL-1β，IL-6和腫瘤壞死因子（TNF）-α［圖11（H）］，這說明納米酶繃帶能降低神經(jīng)元細胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)指標.從動物層面看，治療8天后傷口大小和面積在接受繃帶治療后均顯著減少至健康水平，而未經(jīng)治療的小鼠僅表現(xiàn)出50%的恢復［圖11（F）和（G）］.這項工作為單原子催化用于非侵入性治療TBI提供了一個可行的范例.同時，上述幾個關(guān)于單原子策略抗氧化的范例也為SACs在生物醫(yī)學和氧化應(yīng)激相關(guān)疾病（如神經(jīng)退行性疾病、關(guān)節(jié)炎及腦中風等）的治療提供了可行的策略及前瞻性實踐.

Fig.10 Monoatomic cobalt nanozyme system Co/PMCS used for the treatment of sepsis and bacteremia[36]

Fig.11 Monoatomic platinum nanozyme bandage Pt/CeO2 for the treatment of traumatic brain injury[37]

1.4 單原子催化劑在生物傳感中的應(yīng)用

選擇性和靈敏性是評價生物傳感器的重要指標，SACs的高選擇性和高催化活性優(yōu)勢有利于開發(fā)生物傳感器.Lin等［38］通過900℃熱裂解Fe（acac）3@ZIF-8得到了單原子納米酶體系（Fe-N-C SAN），表現(xiàn)出高達57.76 U/mg的比活性，這與HRP表現(xiàn)相當.以對苯二甲酸（TA）作為熒光指示劑，二氫乙啶（DHE）作為熒光探針分別證實了Fe-N-C SAN的類CAT和OXD活性［圖12（A）和（B）］.作者基于SACs的高催化活性和穩(wěn)定性，將Fe-N-C SAN應(yīng)用于丁酰膽堿酯酶（BChE）活性的高效檢測，開發(fā)了一種用智能手機集成的紙上生物測定法，可更便捷地檢測BChE活性［圖12（C）］.類似地，Huang等［39］開發(fā)了一種尺寸可控的Fe-N/C納米酶，基于該體系的類OXD活性實現(xiàn)了堿性磷酸酶（ALP）的高敏檢測.在ALP存在下，抗壞血酸2-磷酸酯（AAP）水解生成抗壞血酸（AA），而AA能有效抑制TMB的氧化［圖12（D）］.他們據(jù)此原理開發(fā)了一種新的比色分析方法，制備了一種新型的ALP活性篩選比色生物傳感器平臺，實現(xiàn)了0.05～100 U/L（4個數(shù)量級）范圍內(nèi)的ALP高敏檢測［圖12（E）］.

Fig.12 Monatomic iron nanozyme system Fe-N-C SAN used for butyryl cholinesterase(BChE)[38]and Fe-N/C for alkaline phosphatase(ALP)detection[39]

二維（2D）材料在生物傳感領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景［78］，Lin等［40］以FeCl2、葡萄糖和雙氰胺為前驅(qū)體，通過高溫煅燒制備了具有類POD活性的2D單原子酶（Fe-N-C SAzyme）［圖13（A）］，實現(xiàn)了超靈敏和高選擇性地原位檢測活細胞H2O2.檢測過程中，佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）作為H2O2誘導劑被用來刺激HeLa細胞產(chǎn)生H2O2，單原子酶的Fe-Nx活性位點能有效催化H2O2生成·OH，而·OH將TMB氧化成oxTMB被監(jiān)測，最終完成Fe-N-C酶對HeLa細胞產(chǎn)生的H2O2的原位檢測［圖13（B）］）.該體系通過典型的比色法應(yīng)用于H2O2的超靈敏和特異性檢測.實驗發(fā)現(xiàn)與100 mmol/L H2O2相比，濃度為500 mmol/L的Zn2+，Mn2+，Ca2+，葡萄糖和抗壞血酸（AA）等均未引起明顯的顏色變化，表明Fe-N-C酶對H2O2的檢測具有良好的選擇性［圖13（C）］，且在0.5～100 mmol/L范圍內(nèi)，H2O2濃度與吸光度值之間呈良好的線性關(guān)系，表明其較高的靈敏性［圖13（D）］.同樣是類POD活性，Du等［41］開發(fā)了一種基于鐵原子錨定在N摻雜碳納米管上的單原子納米酶體系（CNT/FeNC）［圖13（E）］.該體系充分暴露的Fe-Nx-C位點以及原子分散產(chǎn)生的尺寸效應(yīng)為其提供了顯著的類POD活性，可實現(xiàn)5 min內(nèi)以135次循環(huán)的周轉(zhuǎn)數(shù)催化H2O2生成·OH，比傳統(tǒng)的Fe3O4納米酶高出約4500倍.此外，紙張荷載的單原子分散CNT/FeNC體系（SDCP）被開發(fā)為一系列生物測試的信號元件，用于H2O2，葡萄糖和抗壞血酸的超靈敏檢測［圖13（F）～（H）］.抗干擾測試實驗結(jié)果表明，SDCP在生物測定上具有優(yōu)越的選擇性.這兩項工作展現(xiàn)了SACs在傳感領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛力.

Fig.13 Single atomic iron nanozyme system Fe-N-C[40]and CNT/FeNC[41]for sensitive detection

Lee等［42］在石墨烯中嵌入Fe-N4位點，合成了具有仿天然HPR中血紅素輔因子的單原子納米酶體系（Fe-N-rGO）［圖14（A）］，其POD催化速率是未嵌入Fe-N4位點石墨烯的約700倍［圖14（B）］，且Fe-N4位點可選擇性地提高類POD的活性，而不增強其它類酶活性［圖14（C）］.作者基于Fe-N-rGO對H2O2出色的選擇性和敏感性，將其應(yīng)用于乙酰膽堿（Ach）和癌細胞定量測試.對Ach檢測的線性范圍為50～1000 nmol/L，檢出限（LOD）低至20 nmol/L［圖14（D）］；在測定人血清中Ach含量時結(jié)果與Ach的添加量一致，變異系數(shù)范圍為2.4%～4.0%，回收率為98.8%～108.9%.對于H2O2的檢測，以能在N-甲酰甲基-亮氨酸-苯丙氨酸（fMLP）刺激下產(chǎn)生H2O2的3個細胞株為模型，通過吸收強度計算在一定量fMLP刺激下每個細胞產(chǎn)生的H2O2的含量［圖14（E）和（F）］，最終定量檢測同樣含量fMLP刺激下的細胞數(shù)以完成對細胞數(shù)的檢測.最近，Wu等［43］報道的單鐵位點納米酶（Fe SSN）能有效將H2O2活化為·OH，從而實現(xiàn)對葡萄糖的高靈敏檢測.他們采用“犧牲模板法”，即先將MgO與鐵前驅(qū)體和有機配體混合得到Fe（phen）x/MgO，在高溫熱裂解后通過酸洗除去MgO，最后得到Fe SSN［圖15（A）］.如圖15（B）所示，在H2O2存在下，F(xiàn)e SSN可有效氧化TMB得到藍色ox-TMB，聯(lián)合葡萄糖氧化酶（GOx）發(fā)生級聯(lián)催化反應(yīng)以實現(xiàn)對葡萄糖的高靈敏檢測.更具實際意義的是，他們通過將級聯(lián)反應(yīng)各要素嵌入瓊脂糖基的水凝膠開發(fā)了一款生物傳感器，使葡萄糖的檢測更加可視化［圖15（C）］.

通過上面6個單原子在生物傳感的應(yīng)用實例可以發(fā)現(xiàn)，研究者均利用了單原子鐵中心的催化活性，而其它金屬單原子體系則鮮見報道，因此在生物傳感方面SACs尚存在待挖掘的潛力.

Fig.14 Monatomic iron nanozyme system Fe-N-rGO used for quantitative testing of acetylcholine(Ach)and cancer cells[42]

Fig.15 Single iron site nanozyme for ultrasensitive glucose detection[43]

2 總結(jié)與展望

本文綜述了SACs生物醫(yī)學應(yīng)用領(lǐng)域，包括腫瘤治療、抗菌、抗氧化和生物傳感等方面的最新進展.SACs之所以能在生物醫(yī)學領(lǐng)域受到足夠的關(guān)注，與其自身的低配位環(huán)境和電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)、充分暴露的活性金屬中心、高催化活性與選擇性、高原子利用率、結(jié)構(gòu)上的精細性以及對催化機制研究的簡便性等優(yōu)勢密不可分.綜述實例也預(yù)示了SACs在生物醫(yī)學領(lǐng)域巨大的潛在應(yīng)用前景，但目前仍存在如下挑戰(zhàn)：

（1）已報道的大多數(shù)具有類酶活性的SACs局限于碳基納米催化劑［79］，SACs的主要合成方法仍是熱裂解法，經(jīng)過高溫煅燒的材料特別是碳材料的水溶性、生物相容性較差，需要經(jīng)過強酸或堿進一步處理活化或經(jīng)PEG等進一步修飾［31］，這會對催化劑原有結(jié)構(gòu)造成一定的破壞且不能獲得足夠理想的活性位點，但同時，支撐材料通常表現(xiàn)出很好的酸堿穩(wěn)定性，預(yù)示著在腸胃疾病方面的潛在應(yīng)用.

（2）盡管目前已報道了多種用于生物醫(yī)學領(lǐng)域的SACs，但普遍缺乏對于納米體系的藥代動力學以及毒理學的研究，僅停留在較為表面的材料活性以及應(yīng)用效果層面，這不利于SACs的全面評價和臨床轉(zhuǎn)化.希望科學家們能夠重視SACs的“一切行為”，當然這還有很長的路要走.

（3）MOF作為一種相對新型的多孔材料，在諸多領(lǐng)域均展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景［80］，鑒于Wang等［30］利用貴金屬部分取代MOF節(jié)點金屬得到單原子體系的研究，因此未來可在MOF方向開展更多的工作，一方面可避免熱裂解帶來的問題，另一方面MOF種類的多樣性為設(shè)計更多符合需求的單原子體系提供了可能，但仍然要考慮到穩(wěn)定性以及高荷載等問題.

（4）單原子策略為尋找高活性和高選擇性的納米酶提供了合理的新途徑，盡管目前SACs的生物醫(yī)學應(yīng)用還處于初級階段［79］.如主要應(yīng)用于腫瘤治療、抗菌和生物傳感等領(lǐng)域，而在抗炎、成像診斷、免疫治療、聯(lián)合治療及神經(jīng)退行性疾病等方面的報道甚少.如何合理利用金屬與材料的特性整合各自性質(zhì)開發(fā)多功能或多模式成像等材料是值得考慮的問題.

（5）目前應(yīng)用于生物醫(yī)學領(lǐng)域的主要為Fe，Au和Zn基SACs，特別是M-Nx-C納米結(jié)構(gòu)，且在生物傳感方面多為碳基的單原子鐵納米體系，而對稀有金屬、半金屬或貴金屬原子催化劑的研究則較少，預(yù)計貴金屬以單原子分散存在時可能衍生出更顯著的性能，這需要進一步探索.另外，SACs最大限度地提高了金屬的原子效率，這為稀有貴金屬的高效利用提供了有利條件，因此，開發(fā)貴金屬原子SACs用于生物醫(yī)學領(lǐng)域具有廣泛的前景.

（6）用于生物醫(yī)學領(lǐng)域的SACs的金屬原子負載量目前仍有很大的提升空間，開發(fā)更加合理高效的合成方法是未來努力的一個方向［81］.同時，還應(yīng)該考慮支撐材料的尺寸問題，因為隨著尺寸的減小，金屬物種的自由能會進一步增大，分散原子聚集的趨勢增大，因此在克服原子聚集的基礎(chǔ)上最大程度地提高負載量還需進行大量嘗試.另外，雜原子（硼、硫等）摻雜以及多金屬摻雜的SACs在生物醫(yī)學上報道甚少，合理取舍將能發(fā)揮最大的功效.

（7）SACs中暴露的、精確的活性位點為精確的理論計算以及更好地理解物質(zhì)之間相互作用的本質(zhì)提供了理想的平臺.然而，在進行DFT計算的時候也應(yīng)注意到金屬原子需要被均勻地負載到支撐材料上，在這個問題上，由于2D材料在表面積以及電子轉(zhuǎn)移方面具有獨特的優(yōu)勢［17］，能作為一個良好的平臺，在未來的SACs設(shè)計中應(yīng)予以重視，如黑磷、硼烯等.

（8）在臨床轉(zhuǎn)化上，生物安全性以及生產(chǎn)規(guī)模化是需要考慮的重要問題，改善材料的生物相容性和生物可降解性將會是未來突破的重點.研究不應(yīng)僅停留在實驗室階段，克服一切困難推動實驗成果向臨床轉(zhuǎn)化還有很長的路要走.