鄰近標(biāo)記方法表征細(xì)胞-細(xì)胞相互作用

馬維繹，劉士博，陳 鵬

（1.北京大學(xué)元培學(xué)院；2.化學(xué)與分子工程學(xué)院,北京100871）

機(jī)體的穩(wěn)態(tài)維持、免疫應(yīng)答和發(fā)育等多種生理過(guò)程都離不開(kāi)被精準(zhǔn)調(diào)控的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，對(duì)于該相互作用的表征能夠幫助揭示生物學(xué)原理［1，2］，指導(dǎo)臨床療法的研發(fā)［3，4］.以腫瘤免疫為例，從系統(tǒng)整體層面理解機(jī)體內(nèi)各類(lèi)型免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞彼此復(fù)雜的細(xì)胞通訊和調(diào)控，并由此尋找新一代癌癥藥物靶點(diǎn)和新療法備受關(guān)注［5］.基于對(duì)T細(xì)胞與癌細(xì)胞相互作用的認(rèn)識(shí)，已發(fā)展出鑒定T細(xì)胞受體與其特異識(shí)別的多肽-主要組織相容性復(fù)合體的方法［6，7］，該方法有望幫助患者鑒定出個(gè)性化的腫瘤響應(yīng)的T細(xì)胞亞群.基于巨噬細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中其它組分的相互作用，已制備出可以局部誘導(dǎo)、增強(qiáng)抗腫瘤免疫的嵌合抗原受體巨噬細(xì)胞（CAR-M）［8，9］.

對(duì)于細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，多樣化的表征方法亟待開(kāi)發(fā).對(duì)于同一個(gè)生物問(wèn)題可以在不同層面考察，從基本的分子特征，其構(gòu)成的細(xì)胞生理活性，至細(xì)胞三維組裝為組織或微環(huán)境，再至機(jī)體的全局調(diào)控和疾病發(fā)生.相應(yīng)地，細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的解析可以依據(jù)單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序由算法來(lái)推斷［10，11］，也可以進(jìn)一步比較翻譯出的蛋白，由膜蛋白間相互作用的數(shù)據(jù)來(lái)推測(cè)［12］.上升一個(gè)層次，可以利用顯微鏡成像等方法直接觀(guān)察不同類(lèi)細(xì)胞的分布和連接［13，14］，結(jié)合組織透明化方法［15］，三維和原位的細(xì)胞表型分析逐漸成為可能［16，17］.再向上一個(gè)層次，則是臨床觀(guān)察到的復(fù)雜細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的集成結(jié)果.酶介導(dǎo)的鄰近標(biāo)記方法，作為一種人為增加相互作用追蹤標(biāo)記的手段，與現(xiàn)有檢測(cè)方法相輔相成，是很有發(fā)展?jié)摿Φ幕瘜W(xué)生物學(xué)切入角度.

本文綜合評(píng)述了基于鄰近標(biāo)記酶實(shí)現(xiàn)跨細(xì)胞標(biāo)記的多種設(shè)計(jì)及其應(yīng)用范圍、優(yōu)點(diǎn)和缺陷，包括用于檢測(cè)已知的細(xì)胞對(duì)之間相互作用的Split酶方法［18，19］、分置酶和相應(yīng)底物肽段的方法［20，21］，以及用于檢測(cè)已知細(xì)胞與未知細(xì)胞之間相互作用的低底物特異性標(biāo)記酶的跨細(xì)胞標(biāo)記方法［22～24］，并對(duì)鄰近標(biāo)記方法在混合細(xì)胞群體中有時(shí)空分辨率的相互作用檢測(cè)進(jìn)行了展望.

1 鄰近標(biāo)記與鄰近標(biāo)記酶

1.1 鄰近標(biāo)記方法的基本原理

兩個(gè)細(xì)胞彼此鄰近可能是隨機(jī)事件，可能是組織中有生物學(xué)意義的細(xì)胞空間組裝需要，也可能是兩個(gè)細(xì)胞正在發(fā)生相互作用.隨機(jī)事件理論上可以根據(jù)已有的生物學(xué)原理和重復(fù)實(shí)驗(yàn)排除，后兩者有時(shí)難以準(zhǔn)確分開(kāi).例如，細(xì)胞的解剖學(xué)位置可能影響其生理功能，即影響著它的相互作用組學(xué)［25］.一些鄰近標(biāo)記方法僅在確實(shí)存在細(xì)胞-細(xì)胞相互作用時(shí)才能檢出信號(hào).T細(xì)胞與表面呈遞有相應(yīng)抗原的靶細(xì)胞在相互作用時(shí)會(huì)發(fā)生細(xì)胞膜及膜蛋白的互換，屬于胞啃作用的一種情況［26］，這可以視為一種天然的鄰近標(biāo)記結(jié)果.Li等［7］利用相互作用后靶細(xì)胞表面殘留的T細(xì)胞受體和T細(xì)胞膜蛋白，在表達(dá)各種抗原的癌細(xì)胞庫(kù)中鑒定出特定T細(xì)胞可識(shí)別的對(duì)應(yīng)抗原.而另一些鄰近標(biāo)記方法具有更強(qiáng)的普遍性，對(duì)一定距離內(nèi)可能反應(yīng)的底物均有標(biāo)記.例如，Geri等［27］發(fā)展了μMap技術(shù)，利用藍(lán)光照射下銥催化劑經(jīng)Dexter能量轉(zhuǎn)移機(jī)理促使卡賓生成，而卡賓作為易于淬滅的碳?xì)滏I插入試劑，可對(duì)微環(huán)境中蛋白實(shí)現(xiàn)小范圍、高精度的標(biāo)記.該技術(shù)被拓展到突觸內(nèi)跨細(xì)胞標(biāo)記，證實(shí)了標(biāo)記結(jié)果對(duì)相互作用蛋白對(duì)的高選擇性（圖1）.此外，還有許多化學(xué)、生物方法可實(shí)現(xiàn)鄰近標(biāo)記，本文重點(diǎn)討論酶介導(dǎo)的鄰近標(biāo)記反應(yīng).

Fig.1 Non-enzymatic proximity labeling via Dexter energy transfer

1.2 鄰近標(biāo)記酶概述

酶介導(dǎo)的鄰近標(biāo)記的主要原理是，在一定的環(huán)境條件下，某些酶能夠催化小分子底物，即標(biāo)記探針，共價(jià)連接至酶附近一定半徑內(nèi)的內(nèi)源蛋白［28～30］.當(dāng)這些酶被固定在特定細(xì)胞類(lèi)別、亞細(xì)胞區(qū)域或特定蛋白的分布位點(diǎn)等，可以給周?chē)^大概率參與相互作用的蛋白打上標(biāo)記，供進(jìn)一步進(jìn)行生化或蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定.

目前，已有多種酶被進(jìn)化或工程化以適用于鄰近標(biāo)記體系，其中一些酶對(duì)被標(biāo)記的底物蛋白序列要求少，或其標(biāo)記反應(yīng)是基于活性物質(zhì)的擴(kuò)散，因此，常用于未知相互作用蛋白的捕捉.如，工程化的大豆抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APEX2）在過(guò)氧化氫存在下，可氧化連有生物素的酚類(lèi)底物為酚氧自由基，在幾分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)哺乳動(dòng)物活細(xì)胞內(nèi)鄰近蛋白的標(biāo)記［31］.辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的生化檢測(cè)應(yīng)用極為廣泛，其同樣利用酚氧自由基擴(kuò)散進(jìn)行標(biāo)記，近期被用于原位研究神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中時(shí)空分辨的表面蛋白質(zhì)組［32］.生物素鄰近標(biāo)記鑒定（BioID）方法不需要氧化劑輔助，底物生物素和腺苷三磷酸（ATP）在酶催化下可形成高活性中間體生物素-AMP，該中間體擴(kuò)散并與周?chē)患?jí)胺反應(yīng)，使蛋白帶有生物素標(biāo)記［33］.TurboID和miniTurbo 2種酶與BioID中所用的酶同源，但鄰近標(biāo)記反應(yīng)速率大幅提升［29］.基于細(xì)菌Pup蛋白修飾的相互作用標(biāo)記（PUP-IT）技術(shù)可用于研究膜受體的相互作用蛋白，其利用Pup蛋白連接酶（PafA）在附近蛋白的賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈上進(jìn)行類(lèi)泛素化修飾（Pupylation）［24］.還有一些鄰近標(biāo)記酶識(shí)別特定的底物序列可用于檢驗(yàn)是否發(fā)生特定相互作用，并追蹤該相互作用發(fā)生的時(shí)間、空間和時(shí)空變化.如，BioID中所用生物素標(biāo)記酶的野生型前身大腸桿菌生物素連接酶（BirA）需要至少14個(gè)氨基酸的特定肽段作為底物［34］.大腸桿菌硫辛酸連接酶（LplA）經(jīng)定向進(jìn)化篩選，可以將硫辛酸或類(lèi)似結(jié)構(gòu)的探針高效且特異地連接到13肽底物序列［35］.分選酶（Sortase）是一類(lèi)半胱氨酸轉(zhuǎn)肽酶，能識(shí)別蛋白C端Leu-Pro-Xxx-Thr-Gly（LPXTG）序列和N端寡聚甘氨酸，可標(biāo)記生物素在內(nèi)的多種探針?lè)肿樱?6］.此外，還有多種類(lèi)似的轉(zhuǎn)肽酶被發(fā)現(xiàn)并工程化［37，38］.

上述鄰近標(biāo)記酶大多并非來(lái)源于動(dòng)物細(xì)胞，因而這些標(biāo)記反應(yīng)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源生化反應(yīng)有較高的正交性，即標(biāo)記結(jié)果的背景干擾較低.另外，從標(biāo)記內(nèi)容考慮，蛋白-蛋白相互作用不僅僅發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)部，當(dāng)相互作用發(fā)生在細(xì)胞界面，即考慮細(xì)胞表面蛋白的相互作用組，可能包含細(xì)胞-細(xì)胞相互作用時(shí)彼此靠近的、來(lái)自2個(gè)不同細(xì)胞的配體-受體相互作用.將鄰近標(biāo)記酶置于此處，有望記錄并推導(dǎo)出細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的信息.

2 對(duì)已知細(xì)胞相互作用的標(biāo)記

現(xiàn)有數(shù)據(jù)較為充實(shí)的跨細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)有著相近的思路：選定關(guān)注的相互作用兩方，將酶本身或者酶和底物分別置于2個(gè)相互作用的細(xì)胞，在相互作用原位進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，有時(shí)可銜接下游的生理生化表征.

2.1 Split鄰近標(biāo)記酶

一種直截了當(dāng)?shù)脑O(shè)計(jì)是原位組合出可檢測(cè)的信號(hào)分子，其中代表性的是Split綠色熒光蛋白（sGFP）的設(shè)計(jì)［39，40］.雖然其并非原位生成鄰近標(biāo)記酶，但為后續(xù)設(shè)計(jì)提供了重要的基礎(chǔ)和參照.Split蛋白的兩部分重組并形成有生理功能蛋白的過(guò)程，也可以視為因底物靠近而發(fā)生的自催化反應(yīng).2007年，F(xiàn)einberg等［39］發(fā)展了跨突觸相互作用分子的GFP重構(gòu)（GRASP），該方法將互補(bǔ)的2個(gè)sGFP片段分別融合表達(dá)在不同細(xì)胞跨膜蛋白的胞外區(qū)上，2個(gè)sGFP片段均無(wú)熒光，僅當(dāng)它們所在的膜蛋白受體跨過(guò)細(xì)胞間隙彼此充分靠近時(shí)才能產(chǎn)生熒光信號(hào)［圖2（A）］.當(dāng)體外混合培養(yǎng)分別表達(dá)2個(gè)sGFP片段的原代肌細(xì)胞和神經(jīng)元時(shí)，可在細(xì)胞交界處檢出GFP熒光.研究［39］還證實(shí)，在線(xiàn)蟲(chóng)中無(wú)論對(duì)于廣泛分布的CD4蛋白，還是突觸前膜定點(diǎn)分布的蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP-3A）或突觸后膜定點(diǎn)分布的神經(jīng)膠質(zhì)素蛋白（NLG），GRASP方法均可給出符合各組分位置特異性的熒光信號(hào).該方法也有一些缺陷，如2個(gè)互補(bǔ)sGFP片段之間親和力較高，其自發(fā)結(jié)合可能錯(cuò)誤報(bào)告一些并未發(fā)生的相互作用；另外，一對(duì)相互作用蛋白僅組合生成1個(gè)GFP分子，其熒光亮度有限，限制了該方法的靈敏度.

Fig.2 Sensitive visualization of cell-cell interactions with split proteins

為應(yīng)對(duì)這些問(wèn)題，Martell等［18］設(shè)想用具有信號(hào)擴(kuò)增能力的酶代替GFP.他們選擇可在胞外環(huán)境發(fā)揮作用、檢測(cè)靈敏度極高的HRP，經(jīng)進(jìn)化篩選得到一對(duì)Split HRP片段（sHRP）.它們表達(dá)在細(xì)胞表面時(shí)，彼此自發(fā)結(jié)合的趨勢(shì)很低，而且需要血紅素作為輔助因子介導(dǎo)其跨細(xì)胞重構(gòu).他們以神經(jīng)細(xì)胞突觸處膜蛋白（Neurexin，NRX）和NLG的相互作用驗(yàn)證這一鄰近標(biāo)記體系.與sGFP設(shè)計(jì)類(lèi)似，sHRP片段分別融合表達(dá)在NRX和NLG末端，可在存在相互作用的細(xì)胞界面生成有活性的HRP；然后固定細(xì)胞，提供HRP標(biāo)記反應(yīng)條件，此時(shí)HRP快速將周?chē)鞍椎瓦x擇性地標(biāo)記大量生物素.因?yàn)橛谢钚缘腍RP僅存在于跨細(xì)胞蛋白-蛋白相互作用處，所以抗生物素的熒光分子可以清晰地對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用界面成像［圖2（B）］.若并列定量比較sHRP與sGFP設(shè)計(jì)在神經(jīng)元突觸間隙的標(biāo)記效果，sHRP呈現(xiàn)更高的熒光強(qiáng)度和信噪比.他們還驗(yàn)證了sHRP片段可在活體動(dòng)物內(nèi)跨突觸重構(gòu)，經(jīng)組織切片的標(biāo)記和成像，可指示跨突觸細(xì)胞接觸位點(diǎn).最近，Cho等［19］將Split TurboID方法用于研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)-線(xiàn)粒體接觸位點(diǎn)的蛋白調(diào)控，實(shí)現(xiàn)了有條件的、空間特異的鄰近標(biāo)記.該工作主要研究的是胞內(nèi)2個(gè)有膜細(xì)胞器之間的相互作用，同時(shí)，對(duì)質(zhì)膜包被的細(xì)胞之間的相互作用的表征也有所啟示.通過(guò)篩選找到全長(zhǎng)TurboID分割的位點(diǎn)，引入小分子結(jié)合調(diào)控結(jié)構(gòu)域，使得新的TurboID標(biāo)記系統(tǒng)的活性控制需要如下條件：（1）兩片段靠近；（2）體系中有雷帕霉素（Rapamycin）.沒(méi)有雷帕霉素時(shí)，體系有微弱活性；加入雷帕霉素后，標(biāo)記量顯著增加［圖2（C）］.與sHRP方法對(duì)固定后樣品的顯微鏡成像相比，該方法中酶的重構(gòu)和標(biāo)記反應(yīng)均發(fā)生在活細(xì)胞相互作用原位，除時(shí)空特異性的優(yōu)勢(shì)外，被標(biāo)記的蛋白可以通過(guò)生物素標(biāo)記富集并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定.研究者根據(jù)多個(gè)對(duì)照組質(zhì)譜定量結(jié)果比較，篩選得到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線(xiàn)粒體接觸時(shí)局部富集的多個(gè)蛋白［圖2（D）］.他們還實(shí)現(xiàn)了利用G蛋白偶聯(lián)受體接受另一個(gè)細(xì)胞信號(hào)時(shí)Arrestin的胞內(nèi)結(jié)合，重構(gòu)有活性的TurboID，在一側(cè)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記相互作用界面附近的蛋白.若設(shè)計(jì)Split TurboID片段在相互作用間隙重構(gòu)并標(biāo)記雙方細(xì)胞，其面臨的一個(gè)問(wèn)題是Split TurboID片段重構(gòu)后反應(yīng)活性較全長(zhǎng)TurboID顯著降低（如上文用于質(zhì)譜鑒定的樣品標(biāo)記時(shí)間是4 h）.對(duì)于動(dòng)態(tài)變化較快的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，其標(biāo)記量可能較低.而對(duì)于位置相對(duì)恒定的細(xì)胞或組織，單側(cè)細(xì)胞胞內(nèi)標(biāo)記的設(shè)計(jì)既指示了相互作用的雙方和具體界面范圍，也可能輔助胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的鑒定，同時(shí)有望發(fā)展為無(wú)需編輯送信號(hào)細(xì)胞的一種跨細(xì)胞標(biāo)記方法.另外，Split蛋白片段在重構(gòu)后通常不能可逆地分開(kāi)，這可能影響活細(xì)胞的生理活動(dòng)并干擾相互作用檢測(cè).

2.2 分置酶和相應(yīng)底物肽段

許多基于酶和特異性底物序列的跨細(xì)胞標(biāo)記方法也被陸續(xù)發(fā)展出來(lái)，如生物素標(biāo)記細(xì)胞間接觸（BLINC）方法［20］中，生物素連接酶BirA及其相應(yīng)15肽底物序列分別融合表達(dá)在突觸處膜蛋白NRX和NLG上，當(dāng)2個(gè)細(xì)胞靠近，這組膜蛋白的自發(fā)結(jié)合使酶附近底物序列濃度增加，BirA在底物序列上標(biāo)記生物素［圖3（A）］.將BLINC方法從人胚胎腎細(xì)胞推廣到神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，Ting等［20］通過(guò)改變體積較大的鄰近標(biāo)記酶（35000）在膜受體上插入的位置，使用更強(qiáng)的啟動(dòng)子增加標(biāo)記酶的表達(dá)量及串聯(lián)多個(gè)底物多肽序列等方法來(lái)增加標(biāo)記效率，這些策略可以為發(fā)展鄰近標(biāo)記工具提供參考.酶介導(dǎo)的相互作用依賴(lài)性探針連接（ID-PRIME）方法最初被用于研究活細(xì)胞內(nèi)時(shí)空分辨的蛋白-蛋白相互作用［30］，然后拓展成為標(biāo)記跨細(xì)胞蛋白-蛋白相互作用的工具［20］.該方法的設(shè)定與BLINC十分相似，替換了其中的酶和底物，從而得到更穩(wěn)定、可重復(fù)性高的標(biāo)記效果［圖3（B）～3（F）］.同時(shí)，由于LplA可以識(shí)別與其天然底物類(lèi)似的、帶有生物正交反應(yīng)官能團(tuán)的小分子（疊氮甲基吡啶衍生物），與Click反應(yīng)銜接，即可在相互作用細(xì)胞上共價(jià)連接報(bào)告熒光團(tuán)［圖3（B）］.BLINC和ID-PRIME這2個(gè)方法標(biāo)記反應(yīng)均比較快（30 min以?xún)?nèi)），但靈敏度有待提升.現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道通常依靠帶有酶和底物肽段的膜蛋白的過(guò)表達(dá)［20］，而這可能影響這些膜蛋白原本的生理功能.該工作中NRX和NLG的過(guò)表達(dá)使神經(jīng)元有時(shí)在非突觸位置形成2個(gè)細(xì)胞緊貼的結(jié)構(gòu)［圖3（C）星號(hào)處］.同時(shí)，酶對(duì)對(duì)側(cè)細(xì)胞上過(guò)表達(dá)的底物肽段的親和力，可能影響2個(gè)細(xì)胞相互作用的動(dòng)力學(xué)，降低檢測(cè)結(jié)果的可信度.

Sortase作為鄰近標(biāo)記酶也有類(lèi)似的使用方法.以細(xì)胞膜表面自然暴露的N端多個(gè)甘氨酸的膜蛋白作為底物，體系中游離的Sortase可以快捷地在細(xì)胞膜表面修飾小分子探針和納米抗體［41］.在細(xì)胞-細(xì)胞相互作用模型中，雖然Sortase被固定在一側(cè)細(xì)胞膜，但原則上仍可以標(biāo)記類(lèi)型十分廣泛的底物，而不受限于生物素（BirA及其衍生的酶）、酚類(lèi)化合物（HRP、APEX2等過(guò)氧化物酶）和特定脂肪酸衍生物（LplA）等.2018年，Pasqual等［22］發(fā)展了通過(guò)細(xì)胞間接觸處的Sortase反應(yīng)標(biāo)記相互作用的免疫細(xì)胞（LIPSTIC）技術(shù)，可以在活體動(dòng)物內(nèi)使用Sortase作為鄰近標(biāo)記酶捕捉T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的相互作用.他們制備了CD40L上融合表達(dá)Sortase的OT-Ⅱ細(xì)胞（識(shí)別卵清蛋白抗原的CD4+T），所有CD40上融合表達(dá)G5（5個(gè)連續(xù)的甘氨酸，Sortase識(shí)別的底物序列）的轉(zhuǎn)基因小鼠，以及從這些小鼠體外分離出的、被導(dǎo)入卵清蛋白抗原肽段的DC細(xì)胞.當(dāng)T細(xì)胞與DC在淋巴結(jié)等位置相互作用時(shí)，CD40L與CD40結(jié)合，Sortase將外加的帶有LPXTG多肽序列的生物素底物連接到對(duì)側(cè)的抗原特異性的DC表面.他們比較了DC呈遞的抗原種類(lèi)（是否與T細(xì)胞識(shí)別的抗原相符）、相互作用的時(shí)間階段及對(duì)DC被標(biāo)記量的影響，其結(jié)果與現(xiàn)有其它手段觀(guān)察到的相互作用進(jìn)程相符.與通過(guò)原位標(biāo)記熒光團(tuán)來(lái)報(bào)告相互作用相比，利用該方法可以分離出參與相互作用的細(xì)胞，從而在下游的分析得到更多信息.例如，對(duì)小鼠中在不要求抗原特異的識(shí)別階段被標(biāo)記的內(nèi)源DC，分別表征了標(biāo)記量高低的2個(gè)亞群轉(zhuǎn)錄組的差異，從而輔助對(duì)此階段相互作用機(jī)理的推測(cè).該工作選取的相互作用對(duì)CD40-CD40L，是眾所周知的參與T細(xì)胞和DC細(xì)胞作用的分子，對(duì)其相互作用的各階段性質(zhì)已有相對(duì)充分的了解，在這一體系的鄰近標(biāo)記更多是驗(yàn)證性結(jié)果.其后續(xù)可能的一個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)是表征生物學(xué)原理尚不清晰的配體-受體對(duì)的跨細(xì)胞相互作用，闡釋新的、有生理意義的相互作用的動(dòng)態(tài)變化，甚至鑒定到新的相互作用對(duì)，這將更加充分地發(fā)揮酶介導(dǎo)的鄰近標(biāo)記方法的優(yōu)勢(shì).無(wú)論是帶有Sortase的膜蛋白，還是其相應(yīng)受體，均需要被轉(zhuǎn)基因編輯，使其帶有酶和底物序列，天然地阻礙了該系統(tǒng)用于未知細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的鑒定.

Fig.3 Trans-cellular labeling with BirA and LplA[20]

3 對(duì)未知細(xì)胞相互作用的標(biāo)記

迄今，已有一些工作試圖將鄰近標(biāo)記的對(duì)象拓展到未知細(xì)胞.原理上考慮，從標(biāo)記已知細(xì)胞上的已知底物肽段到未知細(xì)胞的膜蛋白：或者放寬酶的底物范圍，使用對(duì)底物序列特異性要求較低的鄰近標(biāo)記酶；或者讓帶有特異底物序列的細(xì)胞種類(lèi)增多，如將底物序列融合表達(dá)在所分布細(xì)胞類(lèi)型更普遍的膜蛋白上.流式細(xì)胞術(shù)中細(xì)胞被抗體染色的熒光強(qiáng)度指示細(xì)胞表面特定抗原的數(shù)量，可以為靶點(diǎn)選擇提供指導(dǎo)［27］.Chen等［23］發(fā)展了酶介導(dǎo)的細(xì)胞間鄰近標(biāo)記（EXCELL）技術(shù)，用于在活細(xì)胞中記錄其未知相互作用細(xì)胞［圖4（A）］.野生型Sortase對(duì)3個(gè)以上的甘氨酸活性較高，而該工作篩選得到了對(duì)N端單個(gè)甘氨酸的蛋白底物識(shí)別效率更高的Sortase突變體mgSrtA，考慮到數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)胞表面膜蛋白中N端含有單個(gè)甘氨酸的蛋白數(shù)量遠(yuǎn)大于有多個(gè)甘氨酸的蛋白的數(shù)量［41］，標(biāo)記未知細(xì)胞時(shí)，mgSrtA理論上比野生型Sortase有更高的標(biāo)記效率.Liu等［24］發(fā)展的PUP-IT技術(shù)也適用于胞外蛋白相互作用體系［圖4（B）］.他們利用Jurkat細(xì)胞系上CD28受體簡(jiǎn)略地實(shí)施了跨細(xì)胞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，在顯微鏡下觀(guān)察到與Jurkat相互作用的細(xì)胞上局部有明顯的標(biāo)記信號(hào).該方法中PafA僅在賴(lài)氨酸側(cè)鏈上修飾，與APEX2等可自由基標(biāo)記多種氨基酸殘基技術(shù)相比，在質(zhì)譜數(shù)據(jù)上便于回溯.另一潛在優(yōu)點(diǎn)是，所用的酶和底物均可以轉(zhuǎn)基因并表達(dá)的方式處在標(biāo)記位點(diǎn)附近，避開(kāi)了動(dòng)物模型中底物不易遞送的問(wèn)題（但可能有伴隨的酶活控制的需要，而且PafA約為60 kDa，對(duì)被轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)壓力較大）.PUP-IT的標(biāo)記時(shí)間約36 h，較Sortase的1 h長(zhǎng)許多，且二者均長(zhǎng)于一些變化較快的細(xì)胞接觸的時(shí)間.這些未知細(xì)胞標(biāo)記方法需要應(yīng)對(duì)的另一個(gè)問(wèn)題是，它們往往對(duì)載有酶的細(xì)胞自身有很大標(biāo)記量，這是由于其自身細(xì)胞膜上的很多蛋白也是鄰近的底物.如果要對(duì)對(duì)側(cè)相互作用細(xì)胞被標(biāo)記的蛋白進(jìn)行生化和質(zhì)譜分析，需要排除自我標(biāo)記的信號(hào)，如預(yù)先根據(jù)細(xì)胞表面的特異抗原進(jìn)行流式分選或抗體篩選.

Fig.4 Trans-cellular labeling with sortase and PafA

目前，人們?nèi)栽诓粩嚅_(kāi)發(fā)新的跨細(xì)胞標(biāo)記手段來(lái)表征細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，其設(shè)計(jì)框架不局限于上述類(lèi)別，同時(shí)這些方法的應(yīng)用也將逐漸被拓展到活體動(dòng)物層面，以標(biāo)記有生理學(xué)意義的而非人為設(shè)置的相互作用.

4 鄰近標(biāo)記酶的活性調(diào)控

在鄰近標(biāo)記設(shè)計(jì)方法中，既使用酶活高、底物范圍廣（即可標(biāo)記未知的相互作用細(xì)胞）的鄰近標(biāo)記酶，又不對(duì)酶的活性加以限制的設(shè)計(jì)尚少見(jiàn)報(bào)道，推測(cè)其標(biāo)記結(jié)果會(huì)有極高的非特異背景，給數(shù)據(jù)分析帶來(lái)較大困難.而對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的研究，其時(shí)空特異性信息對(duì)標(biāo)記結(jié)果的生物學(xué)意義的解讀至關(guān)重要.最直接的應(yīng)對(duì)方法是控制酶能否接觸到標(biāo)記反應(yīng)必需的某種底物.例如，在使用HRP時(shí)，利用HRP分泌上膜前無(wú)活性，設(shè)計(jì)無(wú)法滲透跨過(guò)細(xì)胞膜的生物素-酚類(lèi)底物探針，從而確保胞內(nèi)蛋白極少被標(biāo)記；利用過(guò)氧化氫短暫存在于體系中，從而確保標(biāo)記時(shí)間明確、標(biāo)記量穩(wěn)定［32］.另外一些工作利用抗生素分子拉近了2個(gè)結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域而將鄰近標(biāo)記酶拉近細(xì)胞表面（即調(diào)整了接近細(xì)胞膜蛋白底物序列的概率［24］）.對(duì)于體外培養(yǎng)的細(xì)胞和極薄的組織切片，添加和移除底物都較為方便.但若是考慮到三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞組裝體，小分子如過(guò)氧化氫可高效滲透，但多肽和蛋白探針的遞送便困難許多［42］，其擴(kuò)散不均勻可能增加標(biāo)記結(jié)果的偏倚程度.對(duì)于活性高而底物選擇性很低的許多鄰近標(biāo)記酶，如HRP，APEX2和TurboID，它們都各自有Split的版本［18，19，43］，有時(shí)還與小分子誘導(dǎo)靠近的方法聯(lián)合以控制酶活.對(duì)于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的蛋白，一類(lèi)通用的方法是調(diào)控啟動(dòng)子活性，可以與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［44］、抗生素［45］和光［46］等相關(guān)聯(lián).但這類(lèi)刺激響應(yīng)需要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，往往時(shí)間控制在幾十小時(shí)的量級(jí).對(duì)于活體動(dòng)物層面的實(shí)驗(yàn)，前述可體內(nèi)應(yīng)用的鄰近標(biāo)記方法LIPSTIC［22］當(dāng)且僅當(dāng)細(xì)胞生理活動(dòng)需要CD40L表達(dá)時(shí)，其標(biāo)記酶才會(huì)被一并誘導(dǎo)表達(dá)在細(xì)胞膜表面，從而將標(biāo)記的時(shí)間窗口與有生理意義的相互作用建立了一定的關(guān)聯(lián).Wang等［47］利用特定水解酶的組織特異性，人為設(shè)計(jì)化學(xué)保護(hù)基團(tuán)，使非天然糖得以組織特異地代謝插入，即組織特異地引入了生物正交反應(yīng)官能團(tuán)，該方法可轉(zhuǎn)化用于控制鄰近標(biāo)記酶的空間分布.更通用的生物正交蛋白活性控制方法［48］也可作為鄰近標(biāo)記酶活性控制的參考.

5 總結(jié)與展望

本文綜述了目前多樣化的鄰近標(biāo)記方法，并討論了其應(yīng)用范圍、優(yōu)勢(shì)和缺陷.整體而言，高活性的鄰近標(biāo)記酶是鄰近標(biāo)記領(lǐng)域較常用的工具，在合理、精準(zhǔn)的酶活性控制下，可作為細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的報(bào)告手段.其中一些方法可應(yīng)用于組織和活體動(dòng)物，而組織中的鄰近標(biāo)記需要克服的主要困難之一是標(biāo)記探針的遞送.若被標(biāo)記細(xì)胞自身帶有可轉(zhuǎn)化為標(biāo)記物的底物，可能導(dǎo)致標(biāo)記信號(hào)背景較高.若需要外加底物探針，活體動(dòng)物中可通過(guò)體循環(huán)給藥，其缺點(diǎn)是小分子探針可能很快被代謝排出，而大分子底物組織滲透性卻有限.可針對(duì)已知細(xì)胞的遷移路徑局部給藥，如通過(guò)細(xì)胞間接觸處的Sortase反應(yīng)標(biāo)記相互作用的免疫細(xì)胞（LIPSTIC）技術(shù)［22］；或是將目標(biāo)細(xì)胞誘導(dǎo)到特定位置并集中給藥，如在活體樹(shù)突狀細(xì)胞代謝中插入非天然糖［49］.

有空間分辨率的組織蛋白質(zhì)組學(xué)分析可能是鄰近標(biāo)記的重要發(fā)展方向之一.鄰近標(biāo)記結(jié)果提供了細(xì)胞層面的空間組裝信息，為相互作用事件引入可檢測(cè)、可富集的分子特征，而提取和分析這些信息的方法也隨著鄰近標(biāo)記方法的發(fā)展而發(fā)展.目前占主導(dǎo)的方法是顯微鏡成像［13，14，50～52］和基于單細(xì)胞的分析，如流式熒光染色表型分析［53］或通量更高的單細(xì)胞測(cè)序［10，11，54］.蛋白由于其擴(kuò)增難度高，翻譯后修飾多樣，往往難以在組織等非均一多細(xì)胞體系層面進(jìn)行單細(xì)胞檢測(cè).鄰近標(biāo)記過(guò)程中，被標(biāo)記蛋白多是精確空間范圍的膜蛋白，在一定程度上排除了大量胞內(nèi)蛋白的干擾，增強(qiáng)了質(zhì)譜檢測(cè)的可行性［27］.不同于單細(xì)胞層面分析反映整個(gè)細(xì)胞平均化的性質(zhì)，時(shí)空分辨率的蛋白質(zhì)組學(xué)分析可反映單個(gè)細(xì)胞內(nèi)局域不均勻的性質(zhì)，提供相互作用界面局部的分子排布信息，如免疫突觸處膜蛋白的組成和比例.

與現(xiàn)有的成像和測(cè)序技術(shù)相比，鄰近標(biāo)記方法有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值.鄰近標(biāo)記方法可用于記錄歷史相互作用信息.若要研究細(xì)胞-細(xì)胞相互作用對(duì)細(xì)胞生理狀態(tài)的影響，研究者不僅需要分析相互作用時(shí)的信息，也需要追蹤后續(xù)發(fā)生的和互相作用導(dǎo)致的變化，如對(duì)于細(xì)胞的生理影響，不僅需要相互作用時(shí)刻的信息，也需要對(duì)相互作用帶來(lái)的下游變化，如對(duì)于抗原激活后的抗原特異的T細(xì)胞表達(dá)特定細(xì)胞因子進(jìn)行多重表型分析.若表征時(shí)刻不是相互作用仍然發(fā)生的時(shí)刻，成像則無(wú)法反映.類(lèi)似地，可供推斷相互作用的轉(zhuǎn)錄組信息也可能在相互作用后迅速衰減，并被別的生理調(diào)節(jié)所掩蓋.相比之下，若相互作用伴隨鄰近標(biāo)記，細(xì)胞便持續(xù)地帶有可被檢測(cè)的、指示相互作用對(duì)象的特征，這一特征與多種分析手段，如膜蛋白上調(diào)下調(diào)、細(xì)胞因子分泌、吞噬/殺傷作用等相結(jié)合，有助于研究者區(qū)分特定相互作用細(xì)胞對(duì)的生理效應(yīng).鄰近標(biāo)記方法還可用于記錄特定范圍內(nèi)細(xì)胞群的相互作用.研究者人為選定的細(xì)胞群帶有鄰近標(biāo)記工具，理想條件下僅有此群細(xì)胞的相互作用細(xì)胞可被標(biāo)記，這對(duì)于研究生物標(biāo)記物共享程度較高的細(xì)胞相互作用系統(tǒng)，如先天性免疫細(xì)胞的調(diào)控原理有重要意義.如在某類(lèi)巨噬細(xì)胞上固定鄰近標(biāo)記酶再回輸體內(nèi)，那么被此類(lèi)巨噬細(xì)胞激活的T細(xì)胞帶標(biāo)記，而被另一類(lèi)巨噬細(xì)胞激活的T細(xì)胞無(wú)標(biāo)記.若這兩類(lèi)T細(xì)胞在檢測(cè)時(shí)均未與巨噬細(xì)胞黏附，且由于巨噬細(xì)胞極多的細(xì)分亞型，這兩類(lèi)T細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組上可能出現(xiàn)大多數(shù)位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄拷貝數(shù)接近，少數(shù)有差異.鄰近標(biāo)記的信息可以幫助將這少數(shù)差異與兩類(lèi)巨噬細(xì)胞作用關(guān)聯(lián)起來(lái)，指示免疫調(diào)控機(jī)理方面的研究.