間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)人凍融卵巢組織移植后低氧期保護(hù)作用的研究進(jìn)展

程姣姣 阮祥燕 杜 娟 谷牧青

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100026)

世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)[1]數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)2018年新發(fā)癌癥患者達(dá)428.5萬(wàn)例。隨著腫瘤治療學(xué)的進(jìn)步，癌癥患者的生存率有了極大提高。與此同時(shí)，年輕癌癥患者在臨床痊愈后對(duì)生育要求也越來(lái)越迫切，78.3%～90.0%的年輕癌癥患者有生育及再生育的強(qiáng)烈需求[2]。放射治療(以下簡(jiǎn)稱放療)和細(xì)胞毒類抗癌藥物的應(yīng)用在挽救癌癥患者生命的同時(shí)，難以避免地造成卵巢功能不可逆的損傷[3]。接受10～15 Gy照射劑量的青春期前女孩未來(lái)發(fā)生早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)的風(fēng)險(xiǎn)為30%～70%，高劑量烷化劑的應(yīng)用使化學(xué)藥物治療(以下簡(jiǎn)稱化療)后閉經(jīng)的發(fā)生率高達(dá)40%～80%[4-5]，骨髓移植患者POI發(fā)生率可高達(dá)70%～100%，故生育力保護(hù)非常重要。

對(duì)于需要接受性腺毒性療法的女性，可以選擇多種生育力保存方法，即胚胎凍存、卵母細(xì)胞凍存和卵巢組織凍存，卵巢組織凍存是近年全球防治醫(yī)源性POI的一種重要的生育力保護(hù)方法[6-7]，可在一片組織中保存成百上千個(gè)卵細(xì)胞，不依賴于患者的生理周期，無(wú)須超促排卵，不會(huì)延誤癌癥的最佳治療時(shí)間，不僅能夠有效保存患者生育力，還能在一定程度上恢復(fù)卵巢的內(nèi)分泌功能[8]，是青春期前女孩和需要立即抗癌治療患者的唯一選擇[9]。全球已有超過(guò)145個(gè)活產(chǎn)嬰兒通過(guò)此技術(shù)誕生[10]，在過(guò)去10年中嬰兒出生數(shù)呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，研究[11]顯示高達(dá)95%的患者移植后卵巢功能恢復(fù)，但僅63%的卵巢組織移植后能存活1年，由于卵巢組織移植沒有血管吻合，因此移植物經(jīng)歷了缺氧和局部缺血的過(guò)程，持續(xù)3～5 d才能觀察到進(jìn)行性血管重建，從第7天開始可以看到功能性血管[12]，從第10天開始可以進(jìn)行有氧代謝重建，卵巢組織在移植后的早期有很多卵泡丟失[13]，因此移植需要進(jìn)一步優(yōu)化。本文主要從應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)化凍融卵巢組織移植，改善凍存卵巢組織移植早期低氧期卵泡丟失等的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 卵巢組織凍存移植后早期低氧期損傷

卵巢組織凍存是一項(xiàng)工作密集型的技術(shù)，包括卵巢取材手術(shù)、組織的處理、冷凍和長(zhǎng)期保存，移植物必然是一種非常有限的資源，而且對(duì)于患者來(lái)說(shuō)，往往是一種最后的選擇，因此減少卵泡丟失，從而在移植物中保留盡可能多的原始卵泡很重要。對(duì)新鮮和凍融卵巢組織比較的研究[14]顯示，卵泡存活率和功能相似。卵巢組織凍存移植過(guò)程丟失的卵泡中，據(jù)估計(jì)至少有75%是在移植過(guò)程中丟失，因?yàn)橐浦参镌谛碌沫h(huán)境中重新血管化并恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)，因此移植后的優(yōu)化工作可能會(huì)對(duì)最終的卵泡儲(chǔ)備產(chǎn)生很大的影響。

1.1 卵巢移植后早期卵泡的丟失

竇狀卵泡在卵巢處理過(guò)程中會(huì)被機(jī)械地去除，較小的生長(zhǎng)卵泡因極易受到冷凍和復(fù)蘇的影響可能會(huì)在凍存復(fù)蘇過(guò)程中丟失。移植后卵泡丟失的機(jī)制主要是缺血和激活，移植物中卵泡的存活依賴于缺血、缺氧初期新生血管組織，移植物在低氧環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣由周圍組織通過(guò)擴(kuò)散提供，時(shí)間約為3～5 d[11]，在血運(yùn)重建能夠?yàn)橐浦参锾峁┏浞值难鯕夂蜖I(yíng)養(yǎng)前，時(shí)間可能需要長(zhǎng)達(dá)7～10 d[15]。在血管生成期，移植物受到缺血再灌注損傷，導(dǎo)致炎性反應(yīng)介質(zhì)、自由基和活性氧的產(chǎn)生[16]，缺血再灌注損傷主要通過(guò)影響生長(zhǎng)卵泡的顆粒細(xì)胞導(dǎo)致卵泡丟失，而原始卵泡由于處于休眠狀態(tài)，細(xì)胞代謝率較低，比較不容易受到缺血損傷的影響，在血管化較差的卵巢外側(cè)皮質(zhì)中，它們習(xí)慣于相對(duì)低氧的環(huán)境[17]。原始卵泡在移植物中過(guò)度募集可能是由于組織處理、凍融以及移植后缺血導(dǎo)致生長(zhǎng)卵泡的廣泛丟失所致，生長(zhǎng)中的卵泡通過(guò)分泌抑制因子，主要是抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone, AMH)在抑制原始卵泡激活方面起著重要作用[18]。移植后立即發(fā)生的原始卵泡大量丟失同時(shí)伴隨著早期生長(zhǎng)卵泡數(shù)量的顯著增加和過(guò)渡性和早期生長(zhǎng)卵泡顆粒細(xì)胞增生的增加[14, 19]。在卵巢組織移植患者中，早期也觀察到AMH顯著升高，隨后恢復(fù)到低水平，有時(shí)檢測(cè)不到[20]。

Hippo信號(hào)和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)信號(hào)是原始卵泡激活的主要調(diào)節(jié)信號(hào)[21]，有研究[22]通過(guò)卵巢碎片化或藥物治療，包括第10號(hào)染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失基因(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)抑制劑和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)激活劑通過(guò)破壞Hippo信號(hào)來(lái)促進(jìn)體外原始卵泡的激活，從而促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)，以便能夠用于體外受精(in vitro fertilization, IVF)，這也就是體外激活(in vitro activation, IVA)。卵泡激活的多少直接影響移植物的原始卵泡的儲(chǔ)備，移植物中原始卵泡的誘導(dǎo)激活在短期內(nèi)增加了生長(zhǎng)卵泡的數(shù)量，但導(dǎo)致移植物壽命縮短，這可能適用于立即獲取成熟卵泡體外受精，但犧牲了移植物的整體生育潛力和長(zhǎng)期的內(nèi)分泌功能。對(duì)51例POI患者進(jìn)行了IVA，總共有5例(10%)妊娠和3例(6%)活產(chǎn)。一般來(lái)說(shuō)，POI患者自然妊娠率為5%～10%，因此IVA的成功率可能低于完全不干預(yù)的效果[23]。卵巢組織凍存移植目前主要用于癌癥患者，一旦病情臨床痊愈后，會(huì)將卵巢組織自體移植，移植目的是盡可能長(zhǎng)時(shí)間地恢復(fù)卵巢功能，通過(guò)激活失去大量原始卵泡會(huì)適得其反[24]。相比之下，IVA目前目標(biāo)是針對(duì)卵巢儲(chǔ)備極低，對(duì)控制性卵巢刺激反應(yīng)差的女性，加速激活的目的是在移植后立即刺激少數(shù)剩余的卵泡生長(zhǎng)[25]。

1.2 卵巢組織移植后的功能

目前卵巢組織移植后95%的患者能恢復(fù)卵巢功能，但移植物存活時(shí)間各不相同[26]，某些情況下單次移植物可維持功能數(shù)年，連續(xù)妊娠多達(dá)4次，而其他移植物可能在幾個(gè)月內(nèi)停止功能，決定移植物壽命的是移植后移植物中存活下來(lái)的原始卵泡的最終數(shù)量，分析卵泡丟失的原因?qū)τ谧畲笙薅妊娱L(zhǎng)移植物壽命和優(yōu)化卵巢組織凍存移植技術(shù)是必要的[27]。

卵巢移植物中成熟血管的快速形成對(duì)于限制缺血性損傷和移植后高比例卵泡儲(chǔ)備的耗竭非常重要?？紤]到移植后存活的卵泡數(shù)量減少，但卵巢移植物確實(shí)可以存活數(shù)年，從而可用于重復(fù)懷孕和活產(chǎn)。在人類生殖過(guò)程中，卵泡激活和喪失的速率是非線性的，受卵巢內(nèi)外信號(hào)的調(diào)節(jié)，控制著招募、生長(zhǎng)、選擇和閉鎖速率之間的復(fù)雜相互作用[28]。卵巢內(nèi)對(duì)卵泡募集的調(diào)節(jié)包括PI3K-PTEN通路、KIT配體、AMH、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)蛋白家族成員等。此外，研究[29]顯示卵巢的結(jié)構(gòu)和原始卵泡的密度起著自我調(diào)節(jié)的作用，因此休眠卵泡池的減少會(huì)降低招募的速度。卵巢外因素的影響在研究[30]中也得到了證實(shí)，接受單側(cè)卵巢切除術(shù)的患者，其絕經(jīng)年齡僅比正常絕經(jīng)年齡早1～2年，在卵巢儲(chǔ)備降低的情況下，身體調(diào)整卵泡重新募集率以保存卵泡的這種能力，也可能在卵巢移植中發(fā)揮作用。在移植急性期后，卵巢內(nèi)外的調(diào)節(jié)因子都可能通過(guò)調(diào)節(jié)招募速率來(lái)識(shí)別和響應(yīng)移植物的有限儲(chǔ)備，以減少卵泡激活和丟失，并最大限度地延長(zhǎng)移植物的壽命。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞的研究應(yīng)用

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)可以分離自骨髓、外周血、牙髓和臍帶，MSCs具有分化為幾種細(xì)胞譜系的能力，例如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞，眾所周知，MSCs在組織再生、血管生成和傷口修復(fù)上具有很大的能力[31]，不論來(lái)源如何，MSCs都通過(guò)分泌各種生物活性分子和細(xì)胞因子來(lái)支持細(xì)胞增生和存活[32]。MSCs的再生和抗凋亡作用是由于它們大量的生物活性分子，包括角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, FGF)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)，BMP-4，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor 1, IGF-1)和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)等，它們是重要的卵泡生成調(diào)節(jié)劑[33]。根據(jù)MSCs與共培養(yǎng)細(xì)胞之間的交互作用，利用MSCs作為飼養(yǎng)細(xì)胞提供了長(zhǎng)期且適當(dāng)?shù)呐苑置跔I(yíng)養(yǎng)因子來(lái)源。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, UCMSCs)是一種有前途的干細(xì)胞來(lái)源，用于基于細(xì)胞的治療[34]。在多種疾病模型中，如糖尿病[35]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[36]等，UCMSCs已顯示出通過(guò)免疫調(diào)節(jié)促進(jìn)組織修復(fù)，并且UCMSCs已在臨床上用于治療新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy of newborn, HIE)[37]。

脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adipose tissue-derived stem cells, ASCs)最早由Zuk等[38]描述，從人脂肪抽吸物中分離出并構(gòu)成具有多種譜系分化能力的MSCs。由于采用微創(chuàng)手術(shù)易于收獲脂肪以及細(xì)胞密度高，它們?cè)谠偕t(yī)學(xué)中的應(yīng)用正在普及。實(shí)際上，目前正在進(jìn)行或已經(jīng)完成了許多評(píng)估ASCs安全性和有效性的臨床試驗(yàn)(Ⅰ～Ⅱ和Ⅲ期)[39]，對(duì)研究[40-41]，已證實(shí)了它們具有多系分化潛能、通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子并分化為功能性血管來(lái)促進(jìn)血管生成的能力。ASCs的自分泌/旁分泌因子稱為分泌體(secretome)，參與受損組織的再生過(guò)程，誘導(dǎo)血管生成，減少細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，分泌體可能是一種新的細(xì)胞療法，治療效果與注射活細(xì)胞相當(dāng)，甚至優(yōu)于注射活細(xì)胞，稱為無(wú)細(xì)胞療法(cell-free therapy)[42]。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞在卵巢組織移植中應(yīng)用的研究

在過(guò)去的十年中，卵巢組織移植的主要挑戰(zhàn)之一是延長(zhǎng)移植組織的壽命和質(zhì)量，以便為希望懷孕的癌癥幸存者提供改善妊娠結(jié)局的機(jī)會(huì)。異種移植模型研究[43]采用生長(zhǎng)因子(growth factor, GF)如VEGF，抗氧化劑如N-乙酰半胱氨酸[44]、促紅細(xì)胞生成素[45]、維生素E、褪黑激素和類固醇激素等方法，但迄今為止，尚未見到可向臨床轉(zhuǎn)化的顯著改善，還有在食蟹猴自體卵巢移植模型中研究了在移植之前準(zhǔn)備血管床[46]。有研究[47-48]采用各種來(lái)源的MSCs，利用其促血管生成、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)特性，2018年Manavella等[49]描述了一種利用ASCs促進(jìn)異種移植人卵巢組織血運(yùn)重建的方法，在卵巢組織移植前兩周采用高濃度ASCs來(lái)提前準(zhǔn)備移植部位，可以提高移植物內(nèi)部的氧合和血運(yùn)重建率，并提高卵泡存活率和減少細(xì)胞凋亡。Manavella等[49]觀察到移植后7 d卵泡平均存活率為62%，與添加ASCs相關(guān)的早期血管化和氧合增加可以解釋卵泡丟失的減少。采用ASCs的移植程序是朝著潛在解決卵巢組織移植后大量卵泡丟失問題邁出的有希望的一步?？傊?，證明了在移植后早期卵巢組織的含氧和血管形成率更高，這與增加的卵泡存活率和減少的細(xì)胞凋亡相關(guān)。未來(lái)的研究應(yīng)集中于闡明卵巢組織移植中MSCs的作用機(jī)制，以期于臨床應(yīng)用[50]。

臨床前實(shí)驗(yàn)[51]表明，缺氧處理的ASCs在創(chuàng)面愈合、心肌細(xì)胞再生和軟骨修復(fù)等方面具有較好的效果，表明其在缺血性疾病和軟骨缺損的治療方面具有巨大的應(yīng)用潛力，低氧處理的MSCs可能會(huì)減少卵巢組織移植早期的卵泡丟失。研究[52]顯示，缺氧對(duì)包括ASCs在內(nèi)的MSCs的有益作用主要?dú)w因于低氧誘導(dǎo)因子-1a(hypoxia-inducible factor -1a, HIF-1a)，缺氧上調(diào)HIF-1a，進(jìn)而增強(qiáng)MSCs的活性、 增生、可溶性因子的分泌、軟骨形成潛能、遷移和植入潛能。在常氧條件下，HIF-1α被抑癌基因產(chǎn)物泛素化，翻譯后被胞質(zhì)中的蛋白酶體降解，抑制HIF-1α介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。但缺氧條件下，HIF-1α與血管緊張素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)合受到抑制，導(dǎo)致HIF-1α穩(wěn)定并移位到細(xì)胞核內(nèi)。HIF-1α與HIF-1β發(fā)生二聚反應(yīng)，形成HIF-1復(fù)合物，該復(fù)合體將與靶基因啟動(dòng)子中稱為缺氧反應(yīng)元件(hypoxia-responsive elements, HREs)的DNA序列結(jié)合。關(guān)于低氧條件培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞后與卵巢組織共移植是否可促進(jìn)卵泡的存活和減少凋亡尚未見報(bào)道。

4 小結(jié)與展望

卵巢組織凍存移植作為一種生育力保護(hù)方法，被越來(lái)越多地用于性腺毒性治療的年輕女性，世界各地也出現(xiàn)越來(lái)越多的懷孕和活產(chǎn)。卵巢組織移植的目標(biāo)是盡可能長(zhǎng)時(shí)間地恢復(fù)卵巢功能，以實(shí)現(xiàn)多次排卵和妊娠，并恢復(fù)內(nèi)分泌功能。因此優(yōu)化的重點(diǎn)在于減少移植物中的卵泡損失，以此作為延長(zhǎng)移植物壽命和生育力的基礎(chǔ)。減少缺血損傷和/或減少卵泡激活的藥理學(xué)方法可以潛在地減少移植后的卵泡丟失，目前研究[50-52]表明間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)移植物的血管形成，減少卵泡的損耗，從而提高移植物的存活時(shí)間，為患者提供更大的長(zhǎng)期獲益，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證和研究其作用機(jī)制，以及研究低氧預(yù)處理間充質(zhì)干細(xì)胞是否更加優(yōu)化卵巢組織移植。