• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    獸用生物制品活菌計數(shù)方法改進的研究

    2020-12-22 02:08:28張一幟王秀麗劉元杰辛凌翔任小俠彭小兵李旭妮彭國瑞李俊平羅玉峰
    中國獸藥雜志 2020年11期
    關鍵詞:移液器計數(shù)法活菌

    張一幟,張 媛,李 建,王秀麗,劉元杰,王 楠,徐 磊,辛凌翔,任小俠,劉 博,魏 津,馬 欣,彭小兵,李旭妮,彭國瑞,李俊平, 羅玉峰

    (中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081)

    活菌計數(shù)是細菌類活疫苗質量標準中重要的檢驗參數(shù),與疫苗的保護效果關系緊密[1]。 現(xiàn)行獸用細菌類生物制品檢驗中的活菌計數(shù)方法依照《中國獸藥典》(2015 年版三部)附錄3405“活菌計數(shù)法”執(zhí)行[2],但其中有部分內容過于籠統(tǒng),試驗成立條件缺乏科學標準,以至于全國各疫苗生產企業(yè)檢驗人員對方法的要求有理解上的差別,造成企業(yè)間乃至同企業(yè)人員間檢驗結果經常出現(xiàn)差異,最終影響細菌活疫苗質量的評判。 因此,本研究擬參照國內外活菌計數(shù)相關規(guī)程,通過試驗比對研究,對“活菌計數(shù)法”進行修訂,使該方法要求更明確,普適性更高,從而減少操作誤差,提升“活菌計數(shù)法”的規(guī)范性、可操作性及檢驗結果可靠性。

    目前美國農業(yè)部獸醫(yī)生物制品檢驗所依照的美國聯(lián)邦法規(guī)第九卷(9 CFR)中,對于活菌計數(shù)方法有著明確要求[3],并于2015 年完善修訂了標準操作規(guī)程(BBSOP0019.04)[4]。 相對于我國所用的活菌計數(shù)方法,主要有兩點不同:①在將稀釋液滴加于平板這一操作中,所使用的儀器量程不同,我國采用1 mL 量程的吸管滴加0.1 mL 菌液,而美國采用100 ~200 μL 量程的移液器滴加0.1 mL 菌液;②在滴加菌液后,我們目前所用方法是靠傾斜和轉動將菌液分散,而美國使用無菌涂布器將菌液涂布開。 本研究針對當前活菌計數(shù)法三個方面關鍵點,參考美國農業(yè)部獸藥生物制品中心公開的SOP(BBSOP0019.04)和多位檢驗員的操作建議,對于平板干濕程度、滴加平板儀器、菌液分散方法進行單變量比對試驗,提出操作更方便、更精準、容錯率更高的“活菌計數(shù)法”的修訂方案,并進一步提出以標準差(s)衡量結果的有效性及提供參考值。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料 待檢樣品、吸管(1 mL、5 mL、10 mL)、試管(18 mm ×18 cm)、15 mL 離心管、50 mL離心管、培養(yǎng)皿(直徑9 cm)、無菌涂布器、200 μL移液器和配套吸頭;待檢樣品所需稀釋液及固體培養(yǎng)基(本實驗所用稀釋液及固體培養(yǎng)基均購自北京中海生物科技有限公司)參照表1。

    表1 不同細菌產品活菌計數(shù)用稀釋液及適宜培養(yǎng)基對應表Tab 1 Correspondence table of diluent and suitable medium for different bacterial products plate count

    1.2 儀器設備 微波爐、恒溫水浴箱、生物安全柜、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、渦旋振蕩儀、電動移液器、廢棄液體及吸管存放用容器。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 培養(yǎng)平板制備 根據待檢樣品種類選取相應瓊脂培養(yǎng)基加熱融化,冷卻至50 ~60 ℃后于生物安全柜中加入相應營養(yǎng)成分(37 ℃預熱)后制備平板,每付培養(yǎng)皿加入瓊脂15 ~20 mL。 待平板凝固后進行預培養(yǎng)或裝入塑封袋4 ℃保存。

    1.3.2 稀釋菌液 按待檢產品質量標準所規(guī)定的每頭(羽)份樣品應至少含有的活菌數(shù)或科研實驗要求確定樣品的稀釋倍數(shù)。 先進行放大稀釋,再進行10 倍系列稀釋,稀釋過程中通過使用渦旋振蕩器或上下顛倒混勻保證菌液稀釋液充分混勻,最終稀釋度選擇每付培養(yǎng)皿上生長的菌落數(shù)40 ~200 CFU 為宜。

    1.3.3 滴平板 用1 mL 吸管或200 μL 移液器分別從最終稀釋管中吸取菌液,滴于3 個平板上,100 μL/平板。 之后轉動平板或用無菌涂布器將菌液涂均勻(3 個平板用同一個涂布器的同一邊進行涂布,涂布時注意不要將菌液涂布到平板邊緣)。之后蓋上平板蓋正置于培養(yǎng)箱中,30 min 后將平板倒置,培養(yǎng)至適宜時間。

    1.3.4 計算菌數(shù) 肉眼觀察并計數(shù)平板中的菌落,算出3 個平板的平均菌落數(shù),再乘以總體稀釋度(包括放大稀釋和連續(xù)稀釋)倍數(shù),再乘以10(每付平板滴加菌液0.l mL),即為每1.0 mL 原樣品中所含的菌數(shù),再除以疫苗的頭(羽)份數(shù),即為每頭(羽)份疫苗中所含有的活菌數(shù)。

    1. 3. 5 數(shù) 據統(tǒng)計 使用GraphPad Prism 6. 0(GraphPad, La Jolla, CA, USA) 軟件以及SPSS 16.0軟件對于實驗結果進行統(tǒng)計學分析,其中以平均值±標準平均誤差() 表示。 數(shù)據分析采用t檢驗法來比較各組間差異。 其中ns (P>0.05),即no significant,表示無顯著差異,?(P<0.05)表示有顯著差異,??(P<0.01) 表示差異十分顯著。

    2 結果與分析

    2.1 活菌計數(shù)法相關步驟的優(yōu)化

    2.1.1 平板干濕程度 《中國獸藥典》(2015 年版三部)附錄3405 收錄的“活菌計數(shù)法”對于平板干濕程度沒有提出明確要求。 檢驗員們的多年操作經驗均認為平板干濕程度對于活菌計數(shù)試驗至關重要。 為確定平板干濕程度,考慮到操作方法的普適性和易操作性,本研究采取將制備平板完成后(平板凝固)進行預培養(yǎng),以預培養(yǎng)時間量化平板干濕程度。 本次試驗使用仔豬副傷寒沙門氏菌活疫苗參考品進行活菌計數(shù),馬丁瓊脂平板在制備完成凝固后(倒板后30 min),轉移至培養(yǎng)箱進行預培養(yǎng)0.5 ~48 h 不等(圖1)。 分別取出預培養(yǎng)不同時間的馬丁瓊脂平板進行活菌計數(shù),將適宜濃度的菌液滴加至平板上,轉動傾斜引導菌液在平板上均勻分散之后放入培養(yǎng)箱中,在不開蓋的情況下正置30 min后倒置培養(yǎng)24 h,觀察各個平板中菌落是否出現(xiàn)堆疊、是否在邊緣生長并記錄計數(shù)結果。

    圖1 不同預培養(yǎng)時間平板進行活菌計數(shù)結果(0.5 ~48 h)Fig 1 Bacterial plate count results on plates with different pre-culture time (0.5 ~48 h)

    結果顯示平板預培養(yǎng)12 ~24 h 后進行活菌計數(shù)試驗能夠順利計數(shù),菌落分布無異常情況。 而預培養(yǎng)小于12 h 的平板會因過濕而導致菌落堆疊、菌落貼邊生長,最終無法計數(shù)。 預培養(yǎng)48 h 由于平板過干,菌液無法充分分散,部分菌落出現(xiàn)重疊情況,從而影響計數(shù)結果。 因此平板最好預培養(yǎng)12 ~24 h后再進行活菌計數(shù)試驗。

    2.1.2 滴加菌液 將稀釋液滴加于平板這一操作步驟,目前采用1 mL 量程的吸管滴加0.1 mL 菌液的方法,而美國與歐洲使用100 ~200 μL 量程的移液器滴加0.1 mL 菌液。 在正確合規(guī)的操作下,引用誤差越小,準確度越高,而引用誤差是絕對誤差的最大值與儀表量程的比值,即與儀器量程負相關[5]。 從儀器規(guī)格來看,選用量程更符合使用體積的儀器更為精確。

    為驗證兩種滴加菌液方法對于活菌計數(shù)試驗的影響,本研究分別使用兩種方法進行多次活菌計數(shù)試驗,所用樣品及其他步驟完全相同,將所得結果進行統(tǒng)計學分析。 結果說明使用移液器滴加菌液方法與傳統(tǒng)方法無顯著性差異,可以互相替代,而且移液器滴加菌液方法的標準差和標準誤均小于傳統(tǒng)方法,說明移液器方法的離散程度更低,隨機誤差更小(表2 和圖2)。

    表2 不同儀器滴加菌液活菌計數(shù)結果統(tǒng)計表Tab 2 Bacterial plate count statistics with different instruments

    圖2 不同儀器滴加菌液活菌計數(shù)結果Fig 2 Bacterial plate count results with different instruments

    2.1.3 菌液分散 將稀釋液滴加于平板這一操作步驟,我國目前采用傾斜和轉動平板將菌液分散,而美國與歐洲使用無菌涂布器將菌液涂布開。 為驗證兩種菌液分散方法對于活菌計數(shù)試驗的影響,本研究分別按照傳統(tǒng)旋轉傾斜法和涂布法進行菌液分散,進行多次活菌計數(shù)試驗,所用樣品及其他步驟完全相同,將所得結果進行統(tǒng)計學分析。 結果顯示使用涂布器分散菌液方法與傳統(tǒng)方法無顯著性差異,可以互相替代,而且涂布器分散菌液方法的標準差和標準誤均小于傳統(tǒng)方法,說明涂布法的離散程度更低,隨機誤差更?。ū? 和圖3)。

    表3 不同菌液分布方式活菌計數(shù)結果統(tǒng)計表Tab 3 Bacterial plate count statistics in different distribution methods

    圖3 不同菌液分布方式活菌計數(shù)結果Fig 3 Bacterial plate count results in different distribution methods

    2.2 修訂方法與傳統(tǒng)方法比對 本研究第一部分通過單變量試驗確定了平板適宜預培養(yǎng)的時間,之后驗證使用移液器滴加菌液和用涂布器分散菌液可以替代原方法,且結果的離散程度小于原方法。在原方法的基礎上,使用移液器滴加菌液和用涂布器分散菌液,在此我們稱之為“修訂方法”。 第二部分我們使用修訂方法與目前的傳統(tǒng)方法進行比對。將同一樣品分別使用傳統(tǒng)方法和修訂方法進行比對試驗,結果顯示兩種方法沒有顯著性差異,可以互相替代,而且修訂方法的標準差和標準誤均小于傳統(tǒng)方法,說明修訂方法的離散程度更低,隨機誤差更小(表4 和圖4)。

    圖4 活菌計數(shù)傳統(tǒng)方法與修訂方法比對結果Fig 4 Comparison between traditional method and revised method for bacterial plate count

    表4 活菌計數(shù)傳統(tǒng)方法與修訂方法比對結果統(tǒng)計表Tab 4 Comparison between traditional method and revised method for bacterial plate count

    2.3 結果平行性條件優(yōu)化 在《中國獸藥典》(2015 年版三部)附錄3405 收錄的“活菌計數(shù)法”中,在重檢要求中對于結果平行性方面做出了規(guī)定:“如果有片狀菌落生長,或同一稀釋度平板間菌落相差50%以上時,應重檢。”其中對于活菌計數(shù)結果平行性的要求表述過于籠統(tǒng),(最大值-最小值)/N≥50%則該次檢驗不成立,而其中N 并沒有明確指出是什么值,是否是平均值或其他具體某一個樣本數(shù)值,以至于該評判標準在實際應用中會產生標準不一的問題。 “最大值-最小值”在統(tǒng)計學中稱為極差,是用來反映刻畫一組數(shù)據的離散程度和變異范圍,但由于極差只指明了測定值的最大離散范圍而不包括全部測量值的信息,并且極差易受極端值影響,因此不能反映其間樣本的分部情況。此外,從公式(最大值-最小值)/N 值可以看出,數(shù)值大小與N 的關系成反比。 在活菌計數(shù)結果在規(guī)定范圍(40 ~200)內的情況下,N(一般取平均值)越低,(最大值-最小值)/N 值越大,即此種方法對于數(shù)據離散性的衡量會因N 值大小不同產生差異。

    本研究提出使用標準差作為衡量活菌計數(shù)結果平行性的指標[6]。 為確定既符合現(xiàn)行平行性要求,又符合活菌計數(shù)結果實際情況的標準差值,我們將本研究中進行活菌計數(shù)的數(shù)據(表5)以及多位檢驗員驗證活菌計數(shù)修訂方法的數(shù)據(均符合當前數(shù)據平行性規(guī)定)(表6、表7)進行整理,計算每組結果(3 個平板為一組)的標準差和傳統(tǒng)方法中提出的“(最大值-最小值)/平均值”。

    表5 本研究活菌計數(shù)結果平行性指標分析-1Tab 5 Analysis of the parallel index of the bacterial plate count in this study-1

    表6 本研究活菌計數(shù)結果平行性指標分析-2Tab 6 Analysis of the parallel index of the bacterial plate count in this study-2

    如表5 -表7 所示,各組結果的極差/平均值均在50%以內,符合現(xiàn)行結果平行性要求。 而各組標準差值均小于20,且浮動范圍較為集中于15 ~5 之間,占整個樣本量的74%。 這說明即使在操作符合規(guī)定的情況下,每次檢驗的3 個結果之間還是會出現(xiàn)差距,這是由試驗當中的隨機誤差所引起的,而標準差正是衡量此隨機誤差的一把尺子,應當符合隨機誤差的基本規(guī)律——呈正態(tài)分布。 使用SPSS16.0 軟件對于標準差數(shù)據進行兩種正態(tài)分布檢驗(Shapiro - Wilk 檢驗及Kolmogorov - Smirnov檢驗),結果均為顯著(Sig >0. 05 即正態(tài)分布)(圖5 -圖7),這證實了前文中的觀點,說明標準差可以作為衡量活菌計數(shù)結果平行性的標準,并能夠有效地描述隨機誤差。

    圖5 標準差數(shù)據正態(tài)分布檢驗結果-1Fig 5 Normal distribution test results of Standard Deviation data-1

    圖6 標準差數(shù)據正態(tài)分布檢驗結果-2Fig 6 Normal distribution test results of Standard Deviation data-2

    圖7 標準差數(shù)據正態(tài)分布檢驗結果-3 Fig 7 Normal distribution test results of Standard Deviation data-3

    表7 本研究活菌計數(shù)結果平行性指標分析-3Tab 7 Analysis of the parallel index of the bacterial plate count in this study-3

    3 討論與結論

    國內外目前對活細菌的計數(shù)有許多方法,其中滴板計數(shù)是一種比較常用且簡便的計數(shù)方法。 該方法根據估算對于液體菌液進行2 ~10 倍梯度稀釋,之后將終稀釋液滴加到計數(shù)板上,在顯微鏡下計數(shù),之后乘以相應的稀釋倍數(shù),能夠快速即時測得菌液中的活菌數(shù)量[7]。 Seo EY 等利用熒光顯微技術對于大量細菌進行快速計數(shù)[8]。 Bogomolny E等建立了利用固體激光器使用光學方法實時測定活細菌數(shù)量的方法,結果穩(wěn)定、高效、精確[9]。London R 等開發(fā)了自動化生長微生物直接檢測技術,通過微生物熒光標記和激發(fā)熒光,能夠快速自動區(qū)分不同的原核、真核微生物并即時完成計數(shù)[10]。 這些先進方法或需要使用昂貴的儀器試劑,或需要對不同細菌的估算值進行更多的數(shù)據積累。

    本研究針對當前活菌計數(shù)法的三個方面關鍵點,參考美國農業(yè)部獸藥生物制品中心公開的SOP(BBSOP0019.04)和多位檢驗員的操作建議,通過單變量比對試驗改進了活菌計數(shù)平板的干濕度要求,使得檢驗用平板干濕程度能夠實現(xiàn)均勻分散且不易流邊,同時排除了之前方法當中的生物安全隱患;確定了滴平板儀器,使用量程更適合、精確度更高、操作更方便的儀器進行菌液的滴加,減少了系統(tǒng)誤差并且使得操作更為簡單;選擇涂布器進行菌液分散,也使得整個方法更易操作,菌落分散均勻且不易流邊。

    原方法中對于各平板結果平行性的要求較為模糊,缺少統(tǒng)計學支撐。 本研究提出使用標準差衡量活菌計數(shù)結果的平行性,標準差是離均差平方的算數(shù)平均數(shù)的平方根,即方差的算術平方根,是反映一組數(shù)據離散程度最常用的一種量化形式,是表示精確度的重要指標。 當使用活菌計數(shù)方法進行檢測時,由于檢測方法總是有誤差的,所以檢測值并不是其真實值。 設定一個只取決于檢測值與真實值之間的差距,而與真實值大小無關的穩(wěn)定性指標,才是評價檢測方法最有決定性的指標,從而保證每批檢驗結果的準確可靠[11]。 進一步通過實驗統(tǒng)計數(shù)據證實,活菌計數(shù)實驗中隨機誤差所引起的結果標準差變化,是符合隨機誤差的基本規(guī)律——呈正態(tài)分布的。

    本研究以試驗數(shù)據為基礎,比對分析后對于相關規(guī)程制修訂提出了意見,希望能夠對細菌類獸用生物制品相關從業(yè)者在生產研究、制定規(guī)程等方面提供幫助和啟發(fā)。

    猜你喜歡
    移液器計數(shù)法活菌
    顯微鏡手工計數(shù)法在低值血小板計數(shù)中的應用
    獸醫(yī)實驗室微量移液器使用期間的核查
    運用OD值法快速進行乳酸菌活菌計數(shù)的研究
    移液器檢定中常見技術問題與解決方法研究
    技術與市場(2020年5期)2020-03-02 16:06:52
    神奇的計數(shù)法
    你一直想知道的移液知識
    實驗與分析(2018年3期)2019-01-04 03:19:36
    更精準的移液設備
    實驗與分析(2018年4期)2018-02-27 01:20:08
    “宇宙之大,粒子之微”盡顯“科學計數(shù)法”的魅力
    雙歧三聯(lián)活菌聯(lián)合硝苯地平治療腹瀉型腸易激綜合征的臨床效果
    時變計數(shù)法模型及其驗證
    国产黄色小视频在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 九九爱精品视频在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 日本一本二区三区精品| 赤兔流量卡办理| 亚洲在线观看片| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 久久99精品国语久久久| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲精品,欧美精品| eeuss影院久久| 国产 一区精品| 精品久久久久久电影网| 国产男人的电影天堂91| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 最近视频中文字幕2019在线8| 91在线精品国自产拍蜜月| 男女视频在线观看网站免费| 一本一本综合久久| 秋霞在线观看毛片| 久久精品国产亚洲av天美| 国产在线男女| 亚洲av二区三区四区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产成人精品久久久久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲国产欧美在线一区| 欧美性感艳星| 一区二区三区乱码不卡18| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 搞女人的毛片| 高清日韩中文字幕在线| 男人舔奶头视频| 全区人妻精品视频| 免费av不卡在线播放| 日日啪夜夜撸| 777米奇影视久久| 天天躁日日操中文字幕| 午夜爱爱视频在线播放| 日本三级黄在线观看| 18+在线观看网站| 搞女人的毛片| 亚洲欧美精品自产自拍| 免费观看在线日韩| 国产成人91sexporn| 天堂√8在线中文| 国产 亚洲一区二区三区 | 晚上一个人看的免费电影| 免费观看无遮挡的男女| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 好男人视频免费观看在线| 久久精品久久精品一区二区三区| 国内精品宾馆在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 熟妇人妻不卡中文字幕| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲在线观看片| 内射极品少妇av片p| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 热99在线观看视频| 亚洲最大成人av| 午夜福利视频1000在线观看| 一级av片app| 午夜精品一区二区三区免费看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产乱人视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久久久久国产a免费观看| 一区二区三区免费毛片| 麻豆乱淫一区二区| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲性久久影院| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产伦精品一区二区三区视频9| 色综合站精品国产| 亚洲最大成人av| 大片免费播放器 马上看| 22中文网久久字幕| 国产黄色小视频在线观看| 视频中文字幕在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 午夜激情福利司机影院| 亚洲国产成人一精品久久久| 在线观看人妻少妇| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 天天一区二区日本电影三级| 久久久精品免费免费高清| 亚洲丝袜综合中文字幕| kizo精华| 国产精品99久久久久久久久| 国产熟女欧美一区二区| 91aial.com中文字幕在线观看| 精品午夜福利在线看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲av电影不卡..在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 波野结衣二区三区在线| 免费看a级黄色片| 国产男人的电影天堂91| av卡一久久| 久久精品久久久久久久性| 日韩视频在线欧美| 国产精品1区2区在线观看.| 街头女战士在线观看网站| 国产精品女同一区二区软件| 韩国av在线不卡| 欧美+日韩+精品| 欧美bdsm另类| 男人和女人高潮做爰伦理| 可以在线观看毛片的网站| 男人舔奶头视频| 一个人免费在线观看电影| 久久久久久久国产电影| 男的添女的下面高潮视频| 日韩强制内射视频| 久久精品国产亚洲av天美| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 午夜激情欧美在线| 大香蕉久久网| 久久久国产一区二区| 久久久久性生活片| 国产av码专区亚洲av| av免费在线看不卡| a级毛色黄片| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 色吧在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| www.av在线官网国产| 日韩欧美精品v在线| av卡一久久| 99久久人妻综合| 亚洲经典国产精华液单| 久久久久久久午夜电影| 国产精品国产三级国产专区5o| 尾随美女入室| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产免费视频播放在线视频 | 神马国产精品三级电影在线观看| 精品一区在线观看国产| 99热这里只有精品一区| 国产午夜福利久久久久久| 麻豆国产97在线/欧美| 少妇熟女欧美另类| 不卡视频在线观看欧美| 日韩三级伦理在线观看| 免费观看的影片在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 水蜜桃什么品种好| 欧美不卡视频在线免费观看| 97超视频在线观看视频| 99久国产av精品国产电影| 国产成人a区在线观看| 男人舔奶头视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲不卡免费看| 寂寞人妻少妇视频99o| 日韩强制内射视频| 久久久久久久国产电影| 日韩欧美 国产精品| 一级毛片电影观看| 麻豆乱淫一区二区| 全区人妻精品视频| 天堂√8在线中文| 久久99热6这里只有精品| 欧美+日韩+精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久午夜福利片| 青春草视频在线免费观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 成人漫画全彩无遮挡| 国产一级毛片在线| 寂寞人妻少妇视频99o| 乱人视频在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | .国产精品久久| 97超视频在线观看视频| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲成色77777| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲成人久久爱视频| 黄色配什么色好看| 国产精品人妻久久久影院| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 免费av观看视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 午夜免费激情av| 赤兔流量卡办理| 少妇人妻一区二区三区视频| 国内精品宾馆在线| 免费大片黄手机在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 伦精品一区二区三区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 久久97久久精品| 久久精品国产亚洲av天美| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 精品一区二区三卡| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 成人午夜精彩视频在线观看| 在线观看一区二区三区| 人妻系列 视频| 不卡视频在线观看欧美| 少妇的逼好多水| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美+日韩+精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久久久网色| 一个人看的www免费观看视频| 国产成年人精品一区二区| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 九九在线视频观看精品| 亚洲内射少妇av| 特大巨黑吊av在线直播| 2022亚洲国产成人精品| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 可以在线观看毛片的网站| 成人国产麻豆网| 国产精品一区www在线观看| 黄色一级大片看看| 精品久久国产蜜桃| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产在线男女| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产乱来视频区| 欧美最新免费一区二区三区| 免费观看性生交大片5| 国产高清三级在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 精品欧美国产一区二区三| 国产毛片a区久久久久| 九色成人免费人妻av| 成人亚洲精品av一区二区| 日本黄大片高清| 日日干狠狠操夜夜爽| 丝袜喷水一区| 中文字幕av成人在线电影| 97热精品久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产熟女欧美一区二区| 日本免费a在线| 又爽又黄a免费视频| 午夜日本视频在线| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美区成人在线视频| 欧美一区二区亚洲| 久久久久久久久中文| 国产 亚洲一区二区三区 | 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲成色77777| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产综合懂色| 99久久精品热视频| 美女高潮的动态| 国产午夜福利久久久久久| 一二三四中文在线观看免费高清| 一个人看视频在线观看www免费| 午夜激情久久久久久久| 久久久a久久爽久久v久久| 国产黄频视频在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 九草在线视频观看| 久久99热这里只频精品6学生| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产精品久久久久久精品电影| 国产精品伦人一区二区| 国产亚洲5aaaaa淫片| videossex国产| 国产成人一区二区在线| 黑人高潮一二区| 亚洲人成网站在线播| 中文天堂在线官网| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精品一区二区在线观看99 | 男女那种视频在线观看| 一级毛片 在线播放| 人妻系列 视频| 国产老妇女一区| 69人妻影院| 免费看不卡的av| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲第一区二区三区不卡| 综合色丁香网| 免费观看精品视频网站| 亚洲av成人精品一二三区| 久久99热6这里只有精品| 成人毛片60女人毛片免费| 91在线精品国自产拍蜜月| 免费看不卡的av| 高清av免费在线| 高清在线视频一区二区三区| 精品久久久久久电影网| 国产精品蜜桃在线观看| 久久国产乱子免费精品| 秋霞在线观看毛片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 搞女人的毛片| 亚洲av一区综合| 成人午夜精彩视频在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 国产精品伦人一区二区| 美女大奶头视频| 乱系列少妇在线播放| www.av在线官网国产| 久久久精品欧美日韩精品| 免费少妇av软件| 亚洲综合色惰| 亚洲国产精品国产精品| 黄片无遮挡物在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲国产最新在线播放| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲精品色激情综合| 中文字幕制服av| 久久久亚洲精品成人影院| 精品久久久久久久末码| 91精品一卡2卡3卡4卡| 色综合站精品国产| 中文字幕久久专区| 国产精品一及| 中文在线观看免费www的网站| 草草在线视频免费看| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品,欧美精品| 少妇熟女欧美另类| 男女边摸边吃奶| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲色图av天堂| 成人午夜高清在线视频| 亚洲最大成人中文| 日韩成人av中文字幕在线观看| 尾随美女入室| 日韩强制内射视频| 亚洲无线观看免费| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 久久久精品免费免费高清| 有码 亚洲区| av在线老鸭窝| 国产精品久久久久久精品电影| 国产久久久一区二区三区| 亚洲熟女精品中文字幕| 最近的中文字幕免费完整| 国产精品综合久久久久久久免费| 好男人在线观看高清免费视频| av.在线天堂| 一个人观看的视频www高清免费观看| 日本熟妇午夜| 国产成人a∨麻豆精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产一区二区三区综合在线观看 | 2018国产大陆天天弄谢| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲国产欧美在线一区| 午夜免费观看性视频| 日韩欧美三级三区| 亚洲在线自拍视频| 2018国产大陆天天弄谢| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲av福利一区| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久久久久久久大av| av黄色大香蕉| 黑人高潮一二区| 国产色婷婷99| 男女国产视频网站| 欧美人与善性xxx| 国产高清国产精品国产三级 | 男人舔女人下体高潮全视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久精品国产自在天天线| 婷婷色av中文字幕| 26uuu在线亚洲综合色| 午夜福利成人在线免费观看| 草草在线视频免费看| 国产在线一区二区三区精| av在线观看视频网站免费| 在线免费十八禁| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 性插视频无遮挡在线免费观看| 一个人看视频在线观看www免费| 男女边吃奶边做爰视频| 伊人久久国产一区二区| 午夜日本视频在线| 国内精品宾馆在线| 国内精品一区二区在线观看| 日韩欧美三级三区| 国产乱来视频区| 免费观看av网站的网址| 精品人妻视频免费看| 97在线视频观看| 青春草国产在线视频| 欧美日本视频| 日韩大片免费观看网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 三级国产精品欧美在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 2022亚洲国产成人精品| 一区二区三区乱码不卡18| 久久久久久久久久成人| 少妇的逼好多水| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲国产欧美人成| 亚洲国产精品国产精品| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 黄色一级大片看看| 国产亚洲最大av| 亚洲天堂国产精品一区在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 日本欧美国产在线视频| 国产毛片a区久久久久| 天堂√8在线中文| 天堂影院成人在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 午夜激情欧美在线| 国产 一区精品| 亚洲人成网站在线播| 又大又黄又爽视频免费| 极品教师在线视频| 日韩制服骚丝袜av| 免费少妇av软件| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 日本一二三区视频观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 最近的中文字幕免费完整| 国产精品无大码| 99热这里只有精品一区| 国产精品av视频在线免费观看| 久久久久久久国产电影| 久久久久久久久久黄片| 亚洲av成人精品一区久久| 777米奇影视久久| 国产又色又爽无遮挡免| 久久99热这里只频精品6学生| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产精品一区二区性色av| 免费在线观看成人毛片| 亚洲欧洲国产日韩| 精品一区二区三卡| 成人漫画全彩无遮挡| 久久鲁丝午夜福利片| 国产成人a∨麻豆精品| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲成人久久爱视频| 国产精品福利在线免费观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久国内精品自在自线图片| 国产老妇女一区| 好男人视频免费观看在线| 看十八女毛片水多多多| 免费观看无遮挡的男女| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 午夜福利在线观看吧| 精品酒店卫生间| 99视频精品全部免费 在线| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久草成人影院| 99视频精品全部免费 在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产老妇女一区| 能在线免费看毛片的网站| 一个人看的www免费观看视频| 好男人视频免费观看在线| .国产精品久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产欧美日韩精品一区二区| 色综合站精品国产| 91精品一卡2卡3卡4卡| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久久久久久国产电影| 91av网一区二区| 日韩一区二区三区影片| ponron亚洲| 午夜激情欧美在线| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产av国产精品国产| 97超碰精品成人国产| 国产成人免费观看mmmm| 天堂影院成人在线观看| 亚洲精品色激情综合| 日本一本二区三区精品| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲精品色激情综合| 精品一区二区三卡| 午夜激情久久久久久久| 美女被艹到高潮喷水动态| 夫妻午夜视频| 免费观看精品视频网站| 亚洲国产欧美在线一区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 777米奇影视久久| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 2018国产大陆天天弄谢| 国产综合懂色| 久久久久久久久久黄片| 亚洲av成人精品一区久久| 日韩三级伦理在线观看| 国产成人a区在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 一级毛片 在线播放| 国产成人精品一,二区| 国产亚洲91精品色在线| 成人一区二区视频在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 天堂网av新在线| 久久久久久久久久黄片| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲在线观看片| 夫妻午夜视频| 色5月婷婷丁香| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲最大成人中文| 91在线精品国自产拍蜜月| 女人久久www免费人成看片| 美女内射精品一级片tv| av.在线天堂| 亚洲成人久久爱视频| 成年女人看的毛片在线观看| 午夜精品在线福利| 我的老师免费观看完整版| 午夜爱爱视频在线播放| 国产黄频视频在线观看| 免费看日本二区| 日本wwww免费看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 成年人午夜在线观看视频 | 乱人视频在线观看| 尾随美女入室| 久久6这里有精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 欧美成人午夜免费资源| 亚洲欧洲国产日韩| 久久久久久久久久久丰满| 久久久久久久久久黄片| 免费人成在线观看视频色| 激情五月婷婷亚洲| 色5月婷婷丁香| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲,欧美,日韩| 午夜福利在线观看吧| 亚洲精品aⅴ在线观看| 简卡轻食公司| 国产乱人视频| 国产一级毛片在线| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲欧洲日产国产| 日韩在线高清观看一区二区三区| av在线播放精品| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日日啪夜夜撸| 如何舔出高潮| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产综合懂色| 一级毛片电影观看| 大香蕉久久网| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久热精品热| 色视频www国产| 美女大奶头视频| 久热久热在线精品观看| 免费电影在线观看免费观看| 国产淫语在线视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 免费av不卡在线播放| 麻豆成人午夜福利视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 国产精品一区二区在线观看99 | 欧美日本视频| 欧美成人a在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲精品成人久久久久久| 男女那种视频在线观看| 舔av片在线| 国产黄片美女视频| 日本欧美国产在线视频| 免费看a级黄色片| 欧美成人午夜免费资源| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产黄色小视频在线观看| 高清午夜精品一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 22中文网久久字幕| 超碰97精品在线观看| 国产精品一及| 亚洲精华国产精华液的使用体验|