氣相色譜法測定中藥酊劑甲醇量的測量不確定度評定

陳恒沖 馬彬峽 李思詩 趙 翙

1.本溪市藥品檢驗所，遼寧本溪 117000；2.本溪市衛(wèi)生學(xué)校，遼寧本溪 117000

測量不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，它表征了可以合理地賦予被測量量值分散性的非負參數(shù)[1-2]，可有效提高檢驗結(jié)論的準確性和科學(xué)性[3-5]。2015年版《中國藥品檢驗標準操作規(guī)范》介紹了pH值測定法、非水溶液滴定法等4個檢驗方法的不確定度評定實例[6]，測量結(jié)果不確定度評定與表示將我國藥品檢驗領(lǐng)域全面應(yīng)用[7-13]。

中藥酊劑是將原料藥物用乙醇提取或溶解制成的液體制劑，應(yīng)按照《中華人民共和國藥典》四部通則（0871）甲醇量檢查法進行限度檢查[14]。本研究以中藥酊劑正骨水甲醇量測定法為例，細化評估不確定度分量，建立了甲醇量檢查氣相填充柱測定法的不確定評定方法，對其他采用內(nèi)標法的測定方法具有參考意義。

1 測定方法及不確定度來源分析

1.1 儀器與試藥

Agilent7890A型氣相色譜儀（美國安捷倫）；正骨水（廣西玉林制藥集團有限責(zé)任公司，批號：1811362）；無水甲醇（色譜純，含量＞ 99.9%），正丙醇為色譜純，水為一級純化水。

1.2 色譜條件

色譜柱：不銹鋼填充柱（4m×1/8，填料：二乙烯苯-乙基乙烯苯型高分子微球80～100目）；柱溫：125℃；進樣口溫度：150℃；檢測器（FID）溫度：160℃；載氣：N2，流速：25mL/min；H2流速：60mL/min；空氣流速：400mL/min。理論板數(shù)按甲醇峰計算應(yīng)不低于1500，甲醇、乙醇和內(nèi)標物質(zhì)各相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)大于1.5。

1.3 測量流程及結(jié)果計算模型

按照標準規(guī)定分別配制對照品溶液與供試品溶液，并在上述條件下測定。具體測量流程見圖1。

根據(jù)測定原理和過程，甲醇量可按以下公式計算：

CX為供試品中的甲醇量（%）；AX為供試品溶液的峰面積；A'S為供試品溶液中內(nèi)標物正丙醇的峰面積；DX為供試品的稀釋倍數(shù)；D'S為供試品溶液中內(nèi)標物的稀釋倍數(shù)；f為內(nèi)標法校正因子。校正因子（f）按下式計算：

圖1 甲醇量測定流程圖

AS為內(nèi)標物的峰面積；AR對照品溶液的峰面積；DS為內(nèi)標物的稀釋倍數(shù)；DR為對照品無水甲醇的稀釋倍數(shù)；PR為對照品無水甲醇的純度。

1.4 不確定度來源分析

從檢測過程和數(shù)學(xué)模型分析，甲醇量測定的不確定度來源，主要有對照品溶液和供試品溶液的配制過程，進樣量誤差和重復(fù)性，峰面積積分，對照品純度等。

根據(jù)內(nèi)標法測定原理和配制過程分析，將甲醇峰與內(nèi)標物正丙醇峰的峰面積比值（As/AR）作為一個輸入量進行分析，可以同時涵蓋進樣重復(fù)性、積分重復(fù)性、檢測器響應(yīng)帶來的不確定度，并且抵消進樣體積誤差。綜上，整理內(nèi)標法測定中藥酊劑中甲醇量的測量不確定度因果關(guān)系見圖2。

圖2 內(nèi)標法測定中藥酊劑中甲醇量的測量不確定度來源

量瓶②為對照品與內(nèi)標物的混合容器，量瓶③為供試品與內(nèi)標物的混合容器，這兩只量瓶校準與重復(fù)性引起的容量誤差在內(nèi)標法測定中可以抵消。在同一環(huán)境溫度配制對照品溶液和供試品溶液，稀釋溶劑受溫度影響的膨脹變化也基本可以抵消，因供試品正骨水的膨脹系數(shù)無法提供，故供試品受溫度的影響本例也不予考慮，但甲醇受溫度影響的膨脹稀釋較大，精密量取1mL無水甲醇對照品，仍需考慮溫度影響。

2 各不確定度分量的分析與量化

2.1 對照品溶液校正因子f的不確定度評定

2.1.1 正丙醇峰與甲醇峰的峰面積比值（As/AR） 對照品溶液連續(xù)進樣5次，As/AR分別為1.52、1.53、按貝塞爾公式計算

相對標準不確定度為

2.1.2 對照品純度（PR） 對照品無水甲醇的含量＞99.9%，按矩形分布計算，取包含因子，則相對標準不確定度為：

2.1.3 對照品稀釋定容（DR）的有效不確定度 （1）校準：對照品無水甲醇稀釋定容使用的玻璃量器，根據(jù)計量檢定規(guī)程規(guī)定[15]，容量允差分別為1mL移液管±0.008mL；10mL移液管 ±0.05mL；100mL量瓶±0.10mL，忽略100mL量瓶②，按三角分布，取包含因子，則有效相對標準不確定度為:

（2）重復(fù)性：按照本實驗室玻璃量器檢定的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，定容體積重復(fù)性標準偏差分別為1mL移液管 SDy（1mL）=0.0014mL；10mL 移液管 SDy（10mL）=0.000 81mL；100mL 量瓶 SDl（100mL）=0.000 62mL，忽略100mL量瓶②，則有效相對標準不確定度為:

（3）溫度：本例僅考慮精密量取無水甲醇1mL受環(huán)境溫度影響引入的不確定度，設(shè)室溫為（20±5）℃。液體的體積膨脹明顯大于玻璃量器的體積膨脹，因此只需考慮液體體積膨脹。甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.2×10-3mL/min，按矩形分布，取包含因子，環(huán)境溫度引入的有效相對標準不確定度為：

2.1.4 對照品溶液內(nèi)標物稀釋定容（DS）的有效不確定度

內(nèi)標物正丙醇稀釋定容使用的玻璃量器與對照品相同，則其校準有效相對標準不確定度為:

重復(fù)性有效相對標準不確定度為：

綜上，合成校正因子f的有效相對不確定度為:

2.3 供試品溶液內(nèi)標物稀釋定容（）的有效不確定度

（1）校準：供試品溶液內(nèi)標物稀釋定容使用的玻璃量器，根據(jù)計量檢定規(guī)程規(guī)定，容量允差分別為1mL移液管±0.008mL；100mL量瓶±0.10mL，忽略10mL量瓶③，按三角分布，取包含因子則有效相對標準不確定度為:

（2）重復(fù)性：按照本實驗室玻璃量器檢定的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，定容體積重復(fù)性標準偏差分別為1mL移液管SDy（1mL）=0.0014mL；100mL量瓶SDl（100mL）=0.000 62mL，忽略10mL量瓶③，則有效相對標準不確定度為:

合成供試品溶液內(nèi)標物稀釋定容的有效相對不確定度為:

2.4 供試品稀釋定容（DX）的有效不確定度

因為10mL量瓶③定容至刻度的誤差可以抵消，故本例只考慮供試品取樣量（Vx）的有效不確定度，供試品取樣量（Vx）為10mL量瓶③與1mL移液管的體積差。10mL量瓶容量允差為±0.020mL，其校準標準不確定度為:

定容重復(fù)性標準偏差為SDl（10mL）=0.000 53mL，其重復(fù)性標準不確定度為:

1mL移液管容量允差為±0.008mL，其校準標準不確定度為:

定容重復(fù)性標準偏差為：SDy（1mL）=0.0014mL，其重復(fù)性標準不確定度為:

則供試品取樣量（Vx）的有效標準不確定度為:

因為取樣量為9mL，則有效相對標準不確定度為：

3 合成標準不確定度

合成相對標準不確定度為

實驗中測得甲醇量為0.023%，則合成標準不確定度為:

4 擴展不確定度與報告

實驗結(jié)果一般用擴展不確定度表示，取包含因子k=2（ 置信概率約95%），則甲醇量測定結(jié)果的擴展不確定度為:

本例正骨水中甲醇量的測定結(jié)果可表示為：0.023%±0.000 78%（k=2）。

5 討論

通過上述各不確定度分量的對比可以發(fā)現(xiàn)，供試品溶液甲醇峰與正丙醇峰面積比值重復(fù)性的相對標準不確定度最大，在對照品溶液校正因子不確定度的各分量中，也是甲醇峰與正丙醇峰面積比值重復(fù)性的相對標準不確定度最大，說明本法測定結(jié)果主要受氣相色譜儀的準確性和穩(wěn)定性影響。其次，是對照品溶液與供試品溶液稀釋定容過程的影響，應(yīng)注意所用玻璃量器懂的準確度均符合A級標準，配制過程在溫度穩(wěn)定的環(huán)境中同時進行，檢測人員操作應(yīng)規(guī)范一致。

在藥品檢測過程中，通常使用的將計算公式作為測量模型劃分不確定度分量的方式，本研究詳細分析了影響填充柱GC法測定甲醇量的所有因素，舍棄了本法及內(nèi)標法使用時可以抵消的部分影響因素，建立了較為完整的不確定度評價方法，對其他藥物制劑及方法的不確定度評定提供了有益的參考。但不同的檢測品種及項目，測定過程會有區(qū)別，應(yīng)結(jié)合實際，全面考慮不確定度來源，合理設(shè)計方法確認試驗。