結(jié)直腸癌中錯(cuò)配修復(fù)基因與Ang-1/2表達(dá)的相關(guān)性研究

張東晴 薛昊罡 張曉波 李 攀 姜 晶 張雪燕 吳思蒙 任立群 張繼紅▲

1.北華大學(xué)，吉林吉林 132013；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院骨外科，吉林吉林 132011；3.北華大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，吉林吉林 132011；4.吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室，吉林長(zhǎng)春 130021

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是生命歷程中的殺手之一。CRC的癌變過程涉及多個(gè)因素，如吸煙[1]、酒精攝入[1]、乳糜瀉[2]、環(huán)境及遺傳因素等。目前的研究進(jìn)展中得知，在CRC的發(fā)病機(jī)制及相關(guān)因素中，最受關(guān)注的是染色體不穩(wěn)定和錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷兩大主要因素。在CRC中，錯(cuò)配修復(fù)基因完整型病患在臨床治療效果和術(shù)后生活質(zhì)量方面都差于缺陷型病患[3]，并且在臨床診治過程中，缺陷型患者在療效方面體現(xiàn)了更多的優(yōu)勢(shì)和效果[4]。在CRC中，血管生成是評(píng)估預(yù)后和治療靶點(diǎn)，同時(shí)血管的形成對(duì)于治療效果和術(shù)后改善情況有評(píng)估價(jià)值[5]。血管生成素 -1（Angiopoietin-1，Ang-1）、血管生成素-2（Angiopoietin-2，Ang-2）是研究的熱點(diǎn)。在肺癌[6]、肝癌[7]中Ang-1與疾病的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。在腦膜瘤[8]中Ang-2是評(píng)估疾病預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。Hong等[9]提出CRC中Ang-2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者臨床轉(zhuǎn)歸有關(guān)，生存期較差。錯(cuò)配修復(fù)（Mismatch repair，MMR）基因和血管生成素（Angiopoietin，Ang）均與CRC的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性，而兩者之間是否存在相關(guān)性的研究很少，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Envision法（多聚體兩步法）檢測(cè) MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、Ang-1和 Ang-2蛋白表達(dá)，并研究前四者與Ang-1、Ang-2的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般材料

收集2015年1月～2018年12月北華大學(xué)附屬醫(yī)院病理科確診的結(jié)直腸癌石蠟標(biāo)本96例，男41例，女55例，年齡40～88歲；直腸61例，右半結(jié)腸22例，左半結(jié)腸13例；高分化19例，中分化73例，低分化4例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無轉(zhuǎn)移65例；腺癌-NOS 82例，腺瘤樣腺癌1例，黏液腺癌13例；潰瘍型63例，隆起型33例。

1.2 試劑與方法

主要試劑：鼠單抗MLH1（生產(chǎn)批號(hào)：19041822）、MSH2（生產(chǎn)批號(hào)：19092007）、MSH6（生產(chǎn)批號(hào)：19101812）和 PMS2（生產(chǎn)批號(hào)：19082104），DAB試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：2020F0119），以上試劑均購于北京中杉金橋生物工程公司；鼠多抗Ang-1（生產(chǎn)批號(hào)：ZP6987BP87）和 Ang-2（生產(chǎn)批號(hào)：326498），購于武漢博士德生物工程。

所有標(biāo)本：10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后以4μm厚度連續(xù)切片，烤箱脫蠟，利用羅氏診斷公司BenchMark GT全自動(dòng)多功能組織病理檢測(cè)系統(tǒng)，采用Envision法（多聚體兩步法），一抗分別加入MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、Ang-1和 Ang-2，配合ultraView DAB檢測(cè)試劑盒顯色，依次梯度酒精、二甲苯透明、封片，染色結(jié)果由兩名高級(jí)職稱病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲判讀。

1.3 結(jié)果判定

含有棕黃色或棕褐色的腫瘤細(xì)胞為陽性結(jié)果。在低倍鏡下選定區(qū)域，再使用高倍鏡從中選定5個(gè)陽性結(jié)果集中的視野，對(duì)陽性結(jié)果均采用半定量評(píng)分。Ang-1、Ang-2漿表達(dá)，MLH1、MSH2、MSH6和PMS2核表達(dá)，著色強(qiáng)度如下：0分為不著色，1分為淡黃色；2分為棕色；3分為棕褐色。按陽性細(xì)胞率：（1）Ang-1、Ang-2：≤5%為0分；6%～25%為 1分；26%～50%為2分；≥ 51%為3分，兩結(jié)果乘積，≤ 1分為 -，2分為 +，3～4分為++，5～6分為 +++，≥ 2分為陽性，＜ 2分為陰性。（2）MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2：＜ 1% 為 0分；1%～10% 為 1分；11%～50% 為 2分；51%～80%為3分；＞80%為4分，兩結(jié)果乘積≥2分為陽性，＜2分為陰性[10]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分比表示，利用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法和Spearman相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ang-1、MSH2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)特征

96例已確診結(jié)直腸癌石蠟標(biāo)本，經(jīng)免疫組化法染色。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均細(xì)胞核染色為陽性，Ang-1、Ang-2均細(xì)胞漿染色為陽性。Ang-1染色結(jié)果陽性見圖1A、陰性見圖1B，MSH2染色結(jié)果陽性見圖1C、陰性見圖1D。

圖1 免疫組化染色結(jié)果圖示（×400）

2.2 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2表達(dá)情況及相關(guān)性分析

96例CRC中MLH1不表達(dá)為11例，概率最大；MSH2、MSH6不表達(dá)均為2例，概率最小；4例MLH1與PMS2共同不表達(dá)，2例MSH2、MSH6共同不表達(dá)。Spearman相關(guān)性分析，MLH1與PMS2之間、MSH2與MSH6之間表達(dá)呈正相關(guān)（r＞0，P＜ 0.05），見表 1。

2.3 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

MLH1和PMS2在右半結(jié)腸癌和低分化結(jié)直腸癌中不表達(dá)的概率更大，在性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、大體及組織學(xué)類型方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MLH1和PMS2的缺失表達(dá)在部位、分化程度方面有顯著相關(guān)性（P＜0.05）。MSH2、MSH6的缺失表達(dá)與患者的性別、年齡、部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、大體類型、織學(xué)類型均無相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

2.4 Ang-1、Ang-2表達(dá)與臨床病理各因素的關(guān)系及相關(guān)性分析

在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況下Ang-1低表達(dá)，Ang-2高表達(dá)，Ang-1與Ang-2均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性（P＜0.05），而在本研究的其他因素方面均無相關(guān)性（P＞ 0.05），見表 3。

表1 錯(cuò)配修復(fù)蛋白在結(jié)直腸癌在表達(dá)的相關(guān)性

2.5 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、Ang-1、Ang-2表達(dá)及相關(guān)性分析

Ang-1與Ang-2蛋白表達(dá)率：Ang-1（-）、達(dá)與Ang-1、Ang-2表達(dá)之間無相關(guān)（P＞0.05），見表4。Ang-1（++）均 為 最 高 33.33%，Ang-1（+）為25.00%，Ang-1（+++）為 8.34%；Ang-2（-）為最高46.87%，Ang-2（+）為 41.67%，Ang-2（++）為11.46%，Ang-2（+++）為0。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的缺失表

表2 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2表達(dá)與臨床病理各因素的關(guān)系（n=96）

表3 Ang-1、Ang-2表達(dá)與臨床病理各因素的關(guān)系（n=96）

3 討論

CRC是危害人類生命健康的惡性疾病，在男性和女性腫瘤患者中分別位居第三、第二的地位[11]，使患者的生活質(zhì)量降低和壽命縮短，早診斷、早治療對(duì)于改善預(yù)后有著不可低估的價(jià)值。分子檢測(cè)在臨床診治過程中不僅從分子層面提高對(duì)疾病發(fā)生和發(fā)展的認(rèn)知，也在診療方向帶來了新的啟發(fā)點(diǎn)。免疫治療成為了癌癥不可忽視的治療手段[12-13]。MMR系統(tǒng)由一系列特異的DNA錯(cuò)配修復(fù)酶組成，通常依賴于4個(gè)關(guān)鍵基因，即mutL同源1（MLH1）、減數(shù)分裂后分離增加 2（PMS2）、mutS 同源 2（MSH2）和 mutS 同源 6（MSH6）[14]。

Ang-1、Ang-2對(duì)維持腫瘤血管狀態(tài)有重要作用[15]。血管生成不僅是腫瘤演變過程的基本因素，也是臨床治療的有效靶點(diǎn)[16]。健康人群中，Ang水平保持相對(duì)穩(wěn)定，而在癌癥患者的血清中Ang水平顯著升高，尤其是CRC、急性髓系白血病（Acute myeloid leukaemia，AML）、多發(fā)性 骨 髓瘤（Multip myeloma，MM）和骨髓增生異常綜合征（Myelodyspalastic syndromes，MDS），是 CRC 潛在的腫瘤標(biāo)志物[17]。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了96例結(jié)直腸癌患者的四種MMR 基因（MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2）和Ang-1、Ang-2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，MMR基因總?cè)笔蕿?4.58%（14/96），與目前文獻(xiàn)[18]報(bào)道的15%～20%相符合。由本研究結(jié)果分析，部分病例出現(xiàn)MLH1與PMS2、MSH2與MSH6表達(dá)均呈一致性的特點(diǎn)，與文獻(xiàn)[19]中報(bào)道的錯(cuò)配修復(fù)基因之間蛋白質(zhì)復(fù)合物（二聚體MLH1/PMS2和MSH2/MSH6）形成的觀點(diǎn)相印證。MLH1、PMS2在發(fā)病部位存在相關(guān)性（P＜0.05），在右半結(jié)腸的CRC中蛋白表達(dá)缺失率最高。MLH1、PMS2在分化程度方面均存在相關(guān)性（P＜0.05），分化程度越低，則CRC中蛋白表達(dá)缺失率越高。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，MLH1、MSH2、MSH6三者都表達(dá)，唯獨(dú)缺少PMS2病例，這可能與目前文獻(xiàn)[20]中提及的PMS2自身原因?qū)е碌倪z傳物質(zhì)不穩(wěn)定相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與Ang-1、Ang-2的表達(dá)存在一定的關(guān)聯(lián)，Hong等[9]在關(guān)于Ang-2的研究中也提及此觀點(diǎn)。本結(jié)果中Ang-2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)表達(dá)率高，提示Ang-2促進(jìn)了CRC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，影響其預(yù)后，Peterson等[21-22]學(xué)者也支持Ang-2影響腫瘤預(yù)后的觀點(diǎn)。Jary等[23]報(bào)道Ang-2不僅在癌癥演變過程中促血管生成，也影響了轉(zhuǎn)移。Fagiani等[24]研究認(rèn)為，Ang-1與Ang-2在維持血管狀態(tài)方面的作用是相對(duì)的，Ang-1保持血管狀態(tài)平穩(wěn)，而Ang-2則通過破壞這種狀態(tài)在血管方面發(fā)揮作用，同時(shí)Parikh等[25]提出Ang-2在血管的萌生和塑形過程中存在影響，這可能是Ang-1、Ang-2在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)表達(dá)率不同的原因引起。本研究結(jié)果還顯示，MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2的缺失與Ang-1、Ang-2表達(dá)無相關(guān)性，推測(cè)可能是MLH1、MSH2、MSH6、PMS2缺失表達(dá)與 Ang-1、Ang-2表達(dá)無明確關(guān)系，Jary等[23]研究也提出Ang-2表達(dá)在錯(cuò)配修復(fù)基因正常型與缺陷型結(jié)直腸癌中無明顯差異。

綜上所述，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2缺失與Ang-1、Ang-2表達(dá)無相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)研究具有真實(shí)性，能夠?yàn)榻窈蟮难芯刻峁┛煽康睦碚撘罁?jù)，但由于條件因素的影響，實(shí)驗(yàn)樣本取材較少，今后仍需要大量樣本進(jìn)行下一步研究和探討。