刺五加苷B對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的SD大鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及其對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

鄧?guó)P春 王 濱 沈云虹 金香蘭 趙紅曄▲

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生理教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

缺血性腦卒中是最常見的卒中類型[1]；迄今，建立早期再灌注是唯一被認(rèn)可的有效治療缺血性腦卒中的方法[2]。然而，缺血腦組織恢復(fù)血供后，往往又會(huì)引起更為嚴(yán)重的腦功能障礙[3]，即腦缺血/再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。因此，開發(fā)針對(duì)CIRI的腦保護(hù)藥物對(duì)于缺血性腦卒中的防治具有重要的理論意義和臨床價(jià)值[4]。

刺五加苷B（eleutheroside B，EB）為刺五加的主要活性成分之一，具有保護(hù)神經(jīng)、抗缺血的作用[5-6]，但其對(duì)CIRI的保護(hù)作用及機(jī)制尚不清楚。本研究探討EB對(duì)缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）誘導(dǎo)SD大鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及其對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，為臨床防治缺血性腦卒中提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24h新生SD大鼠，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（黑）2018-001。所有的動(dòng)物處置均嚴(yán)格按照國(guó)際倫理準(zhǔn)則進(jìn)行，并通過齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

刺五加苷B標(biāo)準(zhǔn)品（PCS0177）由北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司提供；Cell Counting Kit（CCK-8），日 本 Dojindo公 司 生 產(chǎn)；In situ cell death detection Kit，德國(guó)Roche公司生產(chǎn)；兔抗鼠cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax、Akt/p-Akt抗體，美國(guó)CST公司生產(chǎn)；CO2常氧細(xì)胞培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)；電泳儀和電泳轉(zhuǎn)移儀，美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 SD大鼠皮層神經(jīng)元的提取、培養(yǎng)與鑒定 參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法提取、培養(yǎng)和鑒定神經(jīng)元，純度＞90%方可用于實(shí)驗(yàn)[7]。

1.3.2 制備SD大鼠皮層神經(jīng)元H/R損傷模型 取鋪滿單層SD大鼠皮層神經(jīng)元的6孔培養(yǎng)板，吸棄原培養(yǎng)液，加入無糖DMEM培養(yǎng)液，每孔2mL；再加入Na2S2O4，使其終濃度為8mmol/L，培養(yǎng)4h；吸棄無糖且含Na2S2O4的DMEM，加入神經(jīng)元維持培養(yǎng)液2mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h[8]。

1.3.3 分組與給藥 取24h新生SD大鼠6只，提取皮層神經(jīng)元，種植于6個(gè)六孔板中（方法同“1.3.1”）。將成熟且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的神經(jīng)元隨機(jī)分為4組，即Control組、H4h/R24h組、EB25μg/mL組和EB50μg/mL組，每組9個(gè)孔。Control組經(jīng)神經(jīng)元維持培養(yǎng)液培養(yǎng)孵育4h后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24h；H4h/R24h組處理方法見“1.3.2”；EB25μg/mL組和EB50μg/mL組則先用相應(yīng)濃度的EB預(yù)保護(hù)3h，再造模。

1.3.4 CCK-8法測(cè)定神經(jīng)元細(xì)胞活力 每孔加入培養(yǎng)液10%體積的CCK-8試劑，37℃孵育3h；將各孔內(nèi)液體按組別分別加入96孔板中，在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450nm處測(cè)量各孔的OD值。設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3.5 TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率 按照檢測(cè)試劑盒說明書處理神經(jīng)元，熒光顯微鏡下觀察并拍照（每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)非重疊高倍視野）。設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡神經(jīng)元個(gè)數(shù)/神經(jīng)元總數(shù)×100%。

1.3.6 Western blotting法檢測(cè)神經(jīng)元中cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、Akt和 p-Akt蛋白表達(dá)水平 用RIPA裂解液提取神經(jīng)元蛋白質(zhì)；BCA法檢測(cè)蛋白濃度；制備聚丙烯酰胺凝膠；經(jīng)過上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，加入一抗，以β-actin為內(nèi)參照，4℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育1h；加入ECL發(fā)光液發(fā)光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，采用Quantity One軟件測(cè)量各組蛋白條帶灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（）表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次；進(jìn)行One-Way ANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EB對(duì)H/R損傷SD大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響

與Control組比較，H4h/R24h組神經(jīng)元細(xì)胞活力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與H4h/R24h組比較，EB25μg/mL組和EB50μg/mL組神經(jīng)元細(xì)胞活力明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且細(xì)胞活力隨著EB作用濃度的增加而增高；提示EB與SD大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞活力有一定的量效關(guān)系，能夠抑制神經(jīng)元的H/R損傷，見圖1。

圖1 EB對(duì)H/R損傷SD大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響（n=3）

2.2 EB對(duì)H/R損傷SD大鼠皮層神經(jīng)元凋亡率的影響

與Control組比較，H4h/R24h組神經(jīng)元凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與H4h/R24h組比較，EB25μg/mL組和EB50μg/mL組神經(jīng)元凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 EB對(duì)H/R損傷SD大鼠皮層神經(jīng)元凋亡率的影響（n=3）

2.3 EB對(duì)H/R損傷SD大鼠皮層神經(jīng)元cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平和Bax/Bcl-2比值的影響

與Control組比較，H4h/R24h組神經(jīng)元cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平和Bax/Bcl-2比值均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與H4h/R24h組比較，EB 25μg/mL組和EB 50μg/mL組神經(jīng)元cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平和Bax/Bcl-2比值均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

2.4 EB對(duì)H/R損傷SD大鼠皮層神經(jīng)元p-Akt蛋白表達(dá)水平的影響

與Control比較，H4h/R24h組神經(jīng)元p-Akt蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與H4h/R24h組比較，EB25μg/mL組神經(jīng)元p-Akt蛋白表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而EB50μg/mL組神經(jīng)元p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

3 討論

神經(jīng)元凋亡是CIRI發(fā)生的主要機(jī)制之一，因此抑制缺血腦組織神經(jīng)元的凋亡可有效改善CIRI[9]。EB是從刺五加的根、莖中提取的一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的活性成分[10]。本研究采用原代培養(yǎng)的SD大鼠皮層神經(jīng)元建立H/R損傷模型，結(jié)果顯示EB能夠抑制H/R介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，增加神經(jīng)元的細(xì)胞活力，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

圖3 EB對(duì)H/R損傷SD大鼠皮層神經(jīng)元cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平和Bax/Bcl-2比值的影響

圖4 EB對(duì)H/R損傷SD大鼠皮層神經(jīng)元p-Akt蛋白表達(dá)水平的影響

Caspase家族和Bcl-2家族是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子[11]。Caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)[12]，其中Caspase-3是細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者[13-14]。Caspase-3接受凋亡信號(hào)而被剪切激活，隨即啟動(dòng)下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而引發(fā)凋亡[15]。研究表明，抑制Caspase-3的激活和表達(dá)可有效地切斷神經(jīng)元的凋亡過程[16-18]。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中一對(duì)相互拮抗的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，Bax促進(jìn)凋亡，而Bcl-2抑制凋亡[19-20]。接受凋亡信號(hào)刺激后，Bax分子構(gòu)象改變，移位、插入到線粒體外膜上，破壞線粒體膜并對(duì)抗Bcl-2，促進(jìn)凋亡的發(fā)生[21]。Bcl-2還可抑制線立體細(xì)胞色素C的釋放，阻止Caspase的激活，抑制凋亡的發(fā)生[22]。因此，Bax/Bcl-2比值是決定細(xì)胞存亡的關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示，H/R損傷的SD大鼠皮層神經(jīng)元中Bax/Bcl-2比值增大，最終激活Caspase-3，引起神經(jīng)元凋亡；而EB預(yù)保護(hù)可恢復(fù)神經(jīng)元中的Bax/Bcl-2比值，抑制Caspase-3活化；提示EB通過抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮其減輕H/R誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的作用，與凋亡線粒體途徑相關(guān)的Bcl-2家族蛋白可能與EB的抗凋亡作用有關(guān)。

PI3K/Akt信號(hào)通路是蛋白質(zhì)合成的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要由PI3K和Akt組成。一旦PI3K被激活，可將Akt磷酸化為p-Akt，而p-Akt則可啟動(dòng)下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步磷酸化Bad、Caspase-3等，對(duì)抗細(xì)胞凋亡[23-24]。本研究結(jié)果顯示，H/R損傷的SD大鼠皮層神經(jīng)元p-Akt蛋白表達(dá)水平升高，而EB預(yù)保護(hù)可使神經(jīng)元p-Akt蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高；提示H/R損傷可激活神經(jīng)元中的PI3K/Akt信號(hào)通路，這可能是神經(jīng)保護(hù)的代償性作用之一；而EB可提高神經(jīng)元中PI3K/Akt信號(hào)通路的激活程度，以進(jìn)一步發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，EB對(duì)H/R誘導(dǎo)的SD大鼠皮層神經(jīng)元損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。