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    養(yǎng)精膠囊通過PI3K-Akt-Cyclin D1 通路促進小鼠精原干細胞的增殖

    2020-12-22 07:32:10金保方孫大林鄧偉民
    中國男科學雜志 2020年6期
    關鍵詞:細胞周期試劑盒膠囊

    蔡 濱 金保方 孫大林 鄧偉民

    東南大學附屬中大醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合男科(江蘇南京 210009)

    精子發(fā)生是一個高度協(xié)調(diào)、有序進行的過程,精原干細胞(spermatogonia stem cells,SSCs)的自我更新與分化是精子發(fā)生的基礎[1]。 SSCs 通過源源不斷地增殖為精子發(fā)生提供穩(wěn)定的原料, 而細胞周期的準確調(diào)控對SSCs 的增殖具有決定性作用[2]。 細胞周期蛋白(cyclin)通過與相應的細胞周期蛋白依賴激酶(cyclin dependent kinase,CDK)結(jié)合形成具有蛋白激酶活性的異源二聚體復合物,推動細胞周期各時相的有序進行。 研究表明,PI3K-Akt-Cyclin D 通路在SSCs 的增殖中扮演重要角色, 一些細胞因子如膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)可以通過磷脂酰肌醇3- 激酶 (phosphatidylinositol 3-kinaseA,PI3K)/ 蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)通路促進Cyclin D 的表達,進而促進SSCs 的增殖[3-5]。

    養(yǎng)精膠囊(Yangjiing Capsule,YC)是我們在臨床上常用的方劑,用于治療由少弱精子癥導致的男性不育,療效確切。 為此,我們進行了一系列基礎研究,發(fā)現(xiàn)養(yǎng)精膠囊作用于小鼠SSCs 48 h 后,細胞周期中S 期細胞比例明顯增加,說明養(yǎng)精膠囊能夠促進小鼠SSCs 由G1期向S 期的過渡,進而促進細胞增殖[6]。 進一步研究發(fā)現(xiàn),養(yǎng)精膠囊可以與GDNF 的受體(GDNF family receptor alpha-1)結(jié)合,通過PI3K-Akt 通路,促進小鼠SSCs增殖[7],但其下游的機制不清。

    鑒于Cyclin D 在SSCs 增殖中的重要作用,我們猜測養(yǎng)精膠囊可能通過PI3K-Akt 通路作用于Cyclin D發(fā)揮作用。 因此,本研究的目的是研究養(yǎng)精膠囊是否通過PI3K-Akt 通路促進Cyclin D 的表達,進而促進SSCs的增殖。

    材料與方法

    一、細胞分離及培養(yǎng)

    取4~6 d 雄性BALB/c 小鼠的睪丸,運用改良的兩步消化法和差速貼壁分選獲得高度純化的SSCs, 種植到小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上,每2 d 更換培養(yǎng)液1次。 具體步驟見參考文獻[8]。

    二、主要試劑與藥品

    CCK-8 試劑盒、細胞周期試劑盒、細胞裂解及蛋白抽提試劑盒、Western 檢測相關試劑、LY294002(PI3K抑制劑)(碧云天,中國);細胞總RNA 提取試劑(Trizol法)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR 檢測試劑盒(諾唯贊,中國);重組小鼠GDNF(Pepro Tech,美國);兔抗鼠Cyclin D1 抗體(ab16663)、兔抗鼠Cyclin D2 抗體(ab230883),兔抗鼠Cyclin D3 抗體(ab112034)(Abcam,美國);兔抗鼠Akt 抗 體(4685S)、 兔 抗 鼠p-Akt 抗 體(Ser473,4060S),兔抗鼠β-actin 抗體(4970S)(CST,美國);養(yǎng)精膠囊由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科生產(chǎn)提供[院臨(2004)第01002 號]。 養(yǎng)精膠囊水提物提取方法見參考文獻[7]。

    三、細胞阻斷實驗

    委托上海捷瑞生物工程有限公司設計針對Cyclin D1 基因的干擾RNA(siRNA)序列,同時設計一條陰性對照(siRNA-NC)序列,通過BLAST 驗證該序列對于其他基因無干擾效果:

    轉(zhuǎn)染siRNA-Cyclin D1 之前先將SSCs 以1×105/孔接種至六孔板中,待細胞長至60%密度時采用Lipofectamine 3000(Invitrogen,美國)將siRNA-Cyclin D1/siRNA-NC 轉(zhuǎn)染進細胞,37 ℃孵育24 h 后加入養(yǎng)精膠囊提取液繼續(xù)培養(yǎng)48 h 進行后續(xù)檢測。

    采用LY294002 進行PI3K 阻斷實驗,SSCs 以1×105/孔接種至六孔板中,將25 μM 的LY294002 預先加入六孔板中培養(yǎng)2 h,之后加入養(yǎng)精膠囊提取液繼續(xù)培養(yǎng)48 h 進行后續(xù)檢測。

    四、細胞增殖檢測

    在96 孔板中以4×103/ 孔的密度接種細胞懸液,放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h, 不同實驗組處理后向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液, 然后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h,用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度。 細胞增殖率=[(實驗孔吸光度- 空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

    五、細胞周期檢測

    處理后的細胞在冰浴預冷的70%乙醇中重懸,4℃固定過夜。1000 g 左右離心3 min 沉淀細胞,之后加入冰浴預冷的PBS 重懸細胞, 每管細胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色復合液,37 ℃避光溫浴30 min。 然后使用FACScan 流式細胞儀對樣本進行分析, 采用ModFit LT 3.0 軟件評價G0/G1期、S 期、G2/M 期細胞百分比。

    六、實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)

    處理后的細胞用Trizol 試劑提取總RNA, 之后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,以cDNA 為模版進行擴增,所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司并合成:

    加樣體系按照定量PCR 檢測試劑盒說明進行操作,反應采用標準的兩步法:95 ℃1 min,1 個循環(huán);95 ℃15 s,60 ℃1 min,40 個循環(huán),采用溶解曲線是判斷擴增產(chǎn)物是否單一,采用2-△△Ct法計算表達量的相對比值。

    七、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot,WB)

    使用裂解液裂解細胞,之后用BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度,確保每個蛋白樣品的上樣量為30 μg,電泳采用10%的SDS-PAGE 凝膠, 然后使用硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉1 h, 加入Cyclin D1 抗體(1:1000)、Cyclin D2(1:1000)、Cyclin D3(1:1000)、β-actin抗體(1:2000)4 ℃過夜,TBST 洗膜后加HRP 標記的二抗(1:5000)室溫孵育,然后加顯影液曝光。

    八、數(shù)據(jù)統(tǒng)計

    所有數(shù)據(jù)都采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析。 各組計量資料采用均數(shù)±標準差(x±s)表示。 兩組定量數(shù)據(jù)的比較:若正態(tài)分布,采用two-tailed Student’s t-test 分析;若非正態(tài)分布,采用Mann-Whitney U 檢驗。P<0.05 認為差異具有統(tǒng)計學意義。

    結(jié) 果

    一、養(yǎng)精膠囊促進SSCs 增殖,促進細胞由G1 期向S 期轉(zhuǎn)化

    圖1A 表明,0.01、0.1、1 mg/mL 濃度 的 養(yǎng)精 膠 囊在24、36、48 h 這三個時間點的增殖活性與空白對照組相比有統(tǒng)計學差 異(P<0.05,P<0.01), 而10 mg/mL 的養(yǎng)精膠囊與空白對照組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05), 表明過高濃度的養(yǎng)精膠囊對于小鼠SSCs的增殖可能有抑制作用, 因此, 后續(xù)實驗我們選用0.01、0.1、1 mg/mL 這三種濃度作為養(yǎng)精膠囊的低、中、高濃度進行。細胞周期結(jié)果(圖1B、圖1C)顯示養(yǎng)精膠囊(1 mg/mL)和GDNF(20 ng/mL)作用細胞48 h 后,能通過影響小鼠SSCs 的G0/G1和S、G2/M 期而影響細胞周期。隨著養(yǎng)精膠囊提取液濃度的升高,S 期細胞比例依次升高,高劑量養(yǎng)精膠囊組和GDNF 組與空白對照組相比, 分別是升高22.7%和34.5%, 有統(tǒng)計學意義(P<0.01),表明養(yǎng)精膠囊提取液和GDNF 能提高小鼠SSCs 的合成。

    圖1 養(yǎng)精膠囊對SSCs 增殖活性、細胞周期的影響

    二、養(yǎng)精膠囊促進cyclin D1 的表達

    Cyclin D 有Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin D3 三個亞型,qRT-PCR 實驗表明(圖2A), 養(yǎng)精膠囊(1 mg/mL)和GDNF(20 ng/mL)可以提高Cyclin D1 的轉(zhuǎn)錄水平,增加Cyclin D1 mRNA 的表達(P<0.01),而對Cyclin D2、Cyclin D3 的轉(zhuǎn)錄水平無影響(P>0.05)。 圖2B-2D 表明養(yǎng)精膠囊和GDNF 可以增加Cyclin D1 蛋白的表達, 而對Cyclin D2、Cyclin D3 蛋白的表達無明顯提高。

    圖2 養(yǎng)精膠囊對Cyclin D mRNA 和蛋白水平的影響

    三、養(yǎng)精膠囊通過cyclinD1 促進SSCs 增殖

    圖3A 表明加入siRNA-Cyclin D1 預處理后再加入養(yǎng)精膠囊(1mg/mL)培養(yǎng)48 h,細胞的增殖活性與養(yǎng)精膠囊(1mg/mL)+siRNA-NC 組相比降低17.4%,有統(tǒng)計學差異(P<0.01),表明siRNA-Cyclin D1 能夠抑制小鼠SSCs 的增殖。 圖3B 表明養(yǎng)精膠囊+siRNA-Cyclin D1組與養(yǎng)精膠囊+siRNA-NC 組相比S 期細胞比例減少21.3%,有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。 圖3C、3D 表明養(yǎng)精膠囊+siRNA-Cyclin D1 組與養(yǎng)精膠囊+siRNA-NC 組相比Cyclin D1 mRNA 和蛋白的表達水平均降低。

    四、養(yǎng)精膠囊通過PI3K-Akt 促進SSCs 增殖

    圖3 阻斷Cyclin D1 后養(yǎng)精膠囊對SSCs 的影響

    接下來采用PI3K 阻斷劑LY294002 阻斷PI3KAkt 通路,圖4A 表明加入LY294002 預處理后再加入養(yǎng)精膠囊(1 mg/mL)培養(yǎng)48 h,細胞的增殖活性與養(yǎng)精膠囊組(1 mg/mL)相比降低9.9%,有統(tǒng)計學差異(P<0.01),表明養(yǎng)精膠囊通過PI3K-Akt 通路促進SSCs 的增殖。 圖4B 表明養(yǎng)精膠囊+LY294002 組與養(yǎng)精膠囊組相比S期細胞比例減少12.1%, 有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。 圖4C、4D 表明,養(yǎng)精膠囊+LY294002 組與養(yǎng)精膠囊組相比Cyclin D1 mRNA 和蛋白的表達水平均降低。

    圖4 阻斷PI3K-Akt 后養(yǎng)精膠囊對SSCs 的影響

    討 論

    養(yǎng)精膠囊是東南大學附屬中大醫(yī)院金保方教授運用中醫(yī)學“腎藏精”的理論,以補腎填精、益氣活血為治法創(chuàng)立的經(jīng)驗方,由淫羊藿、熟地、黃精、紫河車、沙苑子、煅牡蠣、黃芪、當歸、荔枝核、王不留行、炙水蛭共11味中藥組成。 方中淫羊藿味辛甘性溫,走肝腎二經(jīng),為補命門、益精氣之要藥,熟地味甘性微溫,亦歸肝腎二經(jīng),有補血養(yǎng)陰、填精益髓之功,九蒸九曬熟地為補血之首劑,淫羊藿配熟地,陰陽互根互用,增強療效。 紫河車乃血肉有情之品,扶正固本,養(yǎng)血益精,黃芪-黃精為補氣養(yǎng)陰固精的常用藥對,氣陰雙補,使得陽有所依。沙苑子、煅牡蠣其性下行,補腎固精,煅牡蠣還含有精子生長所必須的鋅、硒等微量元素。 荔枝核、當歸、炙水蛭、王不留行共奏行氣活血之功,使得藥物補而不滯,滋而不膩。 方中除了傳統(tǒng)補腎填精之藥,還添加了行氣活血之藥, 既能補腎入精室, 又能行氣活血以養(yǎng)精生精。 這種補腎填精與行氣活血藥物的配合,可改善睪丸和附屬性腺的內(nèi)環(huán)境,促進精子發(fā)生,提高臨床療效。

    前期實驗研究表明,養(yǎng)精膠囊可以通過多途徑、多靶點改善睪丸的生精功能,通過VEGFA/eNOS 通路作用于睪丸的微循環(huán),改善血管內(nèi)皮功能,促進血管的修復和新生[9,10];通過Nur77/StAR 通路作用于睪丸間質(zhì)細胞,促進睪酮的合成,改善SSCs 生長的微環(huán)境,間接促進精子發(fā)生[11-13];還可以直接作用于SSCs,與GDNF 受體GFRα1 結(jié)合,通過PI3K-Akt 通路,促進SSCs 的增殖[7],但PI3K-Akt 通路下游的機制不清,還需進一步探索。 而Cyclin D 是PI3K-Akt 通路下游重要的調(diào)節(jié)蛋白,在SSCs 周期的調(diào)控中扮演著重要的角色,Cyclin D作為細胞周期的啟動因子,作用于G1 期,促進G1/S 期的過渡,進而促進SSCs 的增殖[14]。 本研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)精膠囊可以促進SSCs 的增殖、提高S 期細胞的比例(圖1),并且提高Cyclin D1 mRNA 和蛋白水平的表達, 但對Cyclin D2、Cyclin D3 的表達無影響(圖2)。 接下來運用siRNA-Cyclin D1 阻斷Cyclin D1 的表達,發(fā)現(xiàn)阻斷Cyclin D1 之后,SSCs 的增殖活性降低、S 期細胞比例減少,同時伴隨著Cyclin D1 的表達降低(圖3)。 最后, 運用PI3K 阻斷劑LY294002 進行阻斷PI3K-Ak 通路,發(fā)現(xiàn)阻斷之后同樣出現(xiàn)SSCs 的增殖活性降低、S 期細胞比例減少、以及p-Akt/Akt 和Cyclin D1 的表達降低(圖4)。

    綜上, 補腎填精中藥養(yǎng)精膠囊可以通過PI3K-Akt通路作用于Cyclin D1,進而促進SSCs 增殖。 這對于闡明補腎填精法改善男性生殖功能的作用靶點,揭示“腎藏精”的科學內(nèi)涵,進而指導臨床運用中藥治療少弱精癥導致的男性不育, 提高男性的生殖健康和生活質(zhì)量均具有重要的理論意義和臨床價值。

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