強化清髓單份非血緣臍血移植治療FLT3-ITD突變陽性急性髓系白血病療效觀察*

吳月 朱小玉 劉會蘭 宋闿迪 湯寶林 孫自敏

急性髓細胞白血?。╝cute myeloid leukemia,AML）是一種臨床表現(xiàn)及生物學高度異質性疾病[1]，患者主要因疾病復發(fā)而死亡。45% AML患者的細胞遺傳學正常[2]，而這部分病人的預后則因發(fā)病時的分子學異常而大相徑庭，其中20% AML患者可出現(xiàn)fms樣酪氨酸激酶-3內部串聯(lián)復制ITD突變（FLT3-ITD）[3]，F(xiàn)LT3基因位于第13號染色體上，其近膜區(qū)的內部串聯(lián)復制ITD突變可引起FLT3基因的持續(xù)磷酸化，抑制細胞凋亡，促進白血病細胞增殖。FLT3-ITD突變患者接受化療后復發(fā)率較陰性患者明顯增高，此類型AML患者一旦緩解應及早行異基因造血干細胞移植（Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）以改善預后[4]。目前國內對此類研究報道甚少，本文對22例接受單份非血緣臍血移植（single-umbilical cord blood transplantation,SUCBT）治療的FLT3-ITD突變陽性AML患者療效報道如下。

對象與方法

1 研究對象 2012年6月～2018年12月在中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院血液科（安徽省立醫(yī)院）接受SUCBT的22例FLT3-ITD突變陽性急性髓系白血病患者，男12例，女10例。中位年齡24歲（4～53歲），其中＜14歲者8例，≥14歲者14例。中位體重58 kg（15～77 kg），所有患者起病時分子生物學檢查FLT3-ITD突變陽性，其中6例合并NPM1突變。在第1次完全緩解（CR1）后進行移植者12例，在CR2進行移植者3例，在疾病進展期進行移植者7例，所有進展期患者定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測FLT3-ITD突變?yōu)殛栃裕徑馄诨颊逨LT3-ITD突變檢測為陰性，病人資料見表1。

2 研究方法

2.1 臍血配型及輸注：臍血與受者HLA低分辨4/6個位點相合14例，5/6個位點相合7例，6/6個位點相合1例。供受者ABO血型全相合10例，主要不合7例，次要不合3例，主次均不合2例。回輸臍血總有核細胞數(shù)（TNC）中位數(shù)4.5（2.1～6.6）×107/kg受者體重，其中CD34+細胞中位數(shù)為3.6（2.1～4.6）×105/kg受者體重。

2.2 預處理方案：本組22例患者全部采用強化清髓性預處理方案，方案如下。

2.2.1 全身照射/環(huán)磷酰胺/阿糖胞苷（TBI/Cy/Ara-C）方案[5]：移植前第7-6 d行TBI，單次劑量為300 cGy，一天兩次，總劑量12 Gy，Ara-C為2 g/m2，q12h，靜脈給與，移植前5-4 d，Cy為60 mg·kg-1·d-1，靜脈給與，移植前3-2 d。采用該方案患者共4例。

2.2.2 白消安/環(huán)磷酰胺/氟達拉濱（BU/Cy/Flu）方案：Flu 30 mg/m2，每天1次，靜脈給與，移植前第8-5 d；Bu 0.8 mg/kg，靜脈給與，每6 h 1次，移植前第7-4 d；CY 60 mg/kg/d，靜脈給與，移植前3-2天，采用該方案患者15例。

2.2.3 BU/Cy/Ara-C：Ara-C 2 g/m2，每12小時一次，靜脈給予，移植前第9-8 d；Bu 0.8 mg/kg，q6h，靜脈給予，移植前7-4 d；CY 60 mg·kg-1·d-1，靜脈給予，移植前3-2 d，采用該方案患者3例。如患者合并腦膜白血?。–NSL）或有高危CNSL因素，移植前一天加用氯乙亞硝脲（BCNU）250 mg/m2。

表1 病人資料表

2.3 移植物抗宿主病（GVHD）預防方案：全部采用環(huán)孢素（CsA）聯(lián)合短程霉酚酸酯（MMF）方案[5]。

2.4 植入前綜合征（PES）診斷及處理：目前沒有關于PES的統(tǒng)一定義，結合文獻報道，本研究將中性粒細胞植入前出現(xiàn)的非感染性發(fā)熱（體溫≥38℃）、非藥物性紅疹、腹瀉、黃疸、體重增加等免疫反應定義為PES。根據(jù)患者癥狀的輕重及出現(xiàn)時間的早晚分別加用甲強龍 0.5～2 mg/kg/d，如癥狀無明顯改善或進展患者將加用CD25單克隆抗體聯(lián)合治療。

2.5 支持及對癥治療：肝靜脈閉塞癥（HVOD）預防，小劑量肝素鈉（100 U·kg-1·d-1）和前列地爾（0.03 μg·kg-1·d-1）從預處理開始至移植后第30天應用，血小板＜20×109/L時停用肝素鈉；單純皰疹病毒預防，阿昔洛韋（10 mg·kg-1·d-1）從移植后第1天至35天；預防真菌感染口服氟康唑或伊曲康唑，對既往有肺部真菌感染史患者使用伏立康唑或泊沙康唑進行二級預防；預防卡氏肺囊蟲口服復方磺胺甲噁唑。巨細胞病毒（CMV）的監(jiān)測和搶先治療：移植后采用外周血標本檢測CMV-DNA拷貝數(shù)，當CMVDNA≥103拷貝數(shù)/mL時，改用更昔洛韋（或膦甲酸鈉）聯(lián)合丙種球蛋白靜脈注射治療。移植后第6天開始靜脈應用重組人粒細胞集落刺激因子（G-CSF）5 μg·kg-1·d-1，至外周血白細胞總數(shù)大于4×109/L后連續(xù)使用2 d停用。移植中維持血紅蛋白≥80 g/L，血小板≥20×109/L，所用血制品輸注前均經(jīng)25 Gy的X-ray輻照。

2.6 療效評定：連續(xù)3 d外周血中性粒細胞（ANC）絕對值≥0.5×109/L的第1天為中性粒細胞植入時間，停止外源輸注血小板7 d，血小板連續(xù)3 d≥20×109/L的第1天為血小板恢復時間。急、慢性GVHD的診斷和分級均采用西雅圖標準[6]。移植后第7、14、21天采集外周血標本及第30天骨髓標本行短串聯(lián)重復序列（STR-PCR）檢測供受者嵌合比例變化。移植后患者原發(fā)病復發(fā)：外周血重新出現(xiàn)白血病細胞或骨髓原始細胞＞5%（除外其他原因如骨髓恢復期等）或髓外出現(xiàn)白血病細胞浸潤或分子生物學復發(fā)或細胞遺傳學復發(fā)，所有患者移植后1、2、3、4、6、9、12、15、18、24、30和36個月定期檢測骨髓細胞學、FLT3-ITD突變（發(fā)病時聯(lián)合NPM1突變患者，加做NPM1突變檢測）、WT1定量和流式細胞術微小殘留病（MRD）。

3 統(tǒng)計學處理 所有患者隨訪至2020年6月30日，主要觀察指標為總生存率與無病生存率，總生存率定義為移植時至隨訪終點時間，無病生存率定義為移植時至隨訪終點或原發(fā)病復發(fā)時間。應用SPSS 17.0及R統(tǒng)計學軟件進行分析?；颊呖偵媛剩∣S）和無病生存率（DFS）采用Kaplan-Meier生存曲線分析，中性粒細胞和血小板累積植入率、GVHD發(fā)生率、累積復發(fā)率采用 R3.0軟件競爭風險模型分析。

結 果

1 造血重建 22例患者中1例患者在+42 d前因重癥感染導致多臟器功能衰竭死亡（+6 d），其余21例患者中20例獲得中性粒細胞植入，累積植入率為90.9%（95%CI 62.3%-98.1%），ANC≥0.5×109/L的中位時間為17.5（11～25） d，1例患者經(jīng)STR-PCR檢測證實為原發(fā)性植入失敗，后予以半相合型外周血聯(lián)合骨髓移植進行解救。+120 d 17例患者血小板≥20×109/L，累積植入率為84.6%（95%CI 55.2%-95.4%），血小板植入的中位時間為37（20～68）d?？稍u估的20例患者，移植后第30天骨髓STR-PCR檢測均為100%供者型。

2 移植相關并發(fā)癥 ①PES、aGVHD和cGVHD：65%（13/20）患者分別于移植后+5～+13 d出現(xiàn)PES，經(jīng)靜脈加用甲基強的松龍（MP）治療后癥狀控制；20例獲得中性粒細胞植入患者中，12例出現(xiàn)II～IV°急性皮膚GVHD，其中2例患者于治療過程中同時合并腸道IV°aGVHD，于移植后26、151 d死亡，Ⅱ～Ⅳ°aGVHD累積發(fā)生率為54.5%（95%CI 31.2-72.9%），Ⅲ～IV°aGVHD的累積發(fā)生率為27.3%（95%CI 10.7-46.9%）（圖1）；19例生存超過100 d患者中，4例患者分別于移植后+360 d、+244 d、+365 d、+130 d出現(xiàn)局限型皮膚慢性GVHD，累積發(fā)生率為18.2%（95%CI 5.3-37.1%），應用小劑量甲氨蝶呤（MTX）和MP后癥狀控制。②感染及其他并發(fā)癥：5例患者在移植后出現(xiàn)血流感染，1例血培養(yǎng)為銅綠假單胞菌，2例草綠色鏈球菌，1例為大腸桿菌（ESBL+），1例為肺炎克雷伯菌，其中3例患者后因多臟器功能衰竭死亡，13例患者在移植后+27 d至+180 d出現(xiàn)CMV血癥，使用更昔洛韋（或膦甲酸鈉）合并輸注丙種球蛋白治療后病毒轉陰。無HVOD及移植后淋巴細胞增殖性疾?。≒TLD）的發(fā)生。

3 移植后復發(fā)及生存情況 全部患者隨訪至2020年6月30日， 中位隨訪747.5（6～2 932）d。隨訪過程中共3例患者出現(xiàn)疾病復發(fā)，其中2例為移植時進展期患者，其余各患者骨髓形態(tài)學、微小殘留病及分子生物學均正常，3年累計復發(fā)率為13.6%（95%CI 3.2%～31.5%）（圖2）。死亡8例，死亡原因為重癥感染引起多臟器功能衰竭3例，重度腸道急性GVHD 2例，復發(fā)后死亡3例。預計3年總生存率及無病生存率分別為62.9%及63.6%（圖3）。

討 論

目前針對所有FLT3-ITD突變陽性AML患者，造血干細胞移植仍是患者緩解后鞏固治療的首選選擇，allo-HSCT可以顯著改善患者的長期生存率[7]。Doubek[8]等回顧性分析32例FLT3-ITD陽性的CR1期AML患者，其中13例接受異基因造血干細胞移植，其余接受鞏固化療，移植患者的平均總生存時間明顯高于化療患者（43周 vs 29周）。Bornhaüser[9]等前瞻性多中心臨床研究，376例AML患者中124例伴FLT3-ITD突變，所有患者CR1期接受異基因造血干細胞移植、自體移植或鞏固化療，對其中突變陽性患者分別接受異基因移植40例、自體移植46例和鞏固化療38例對比復發(fā)率和生存情況，接受異基因移植的患者4年累計復發(fā)率明顯低于接受自體造血干細胞移植和持續(xù)化療患者（34% vs 56% vs 94%），提高了3年總生存率（56% vs 45% vs 21%）。而對比行異基因或自體造血干細胞移植中突變陽性與陰性患者生存情況，兩者5年總生存率相近。對于采用何種干細胞來源，目前尚無定論，CIBMTR、EUROCORD和EBMT聯(lián)合分析的結果表明，對于FLT3-ITD突變陽性AML患者，臍帶血移植與同胞造血干細胞移植有相似的預后。

所有移植前伴有FLT3-ITD突變患者，移植后復發(fā)仍是導致患者死亡的重要原因。Brunet S[10]等回顧性分析206例CR1期AML患者接受移植后的生存情況，其中120例FLT3-ITD陽性，86例陰性，結果提示FLT3-ITD陽性患者2年累計復發(fā)率明顯高于陰性患者（30% vs 16%），無病生存率縮短（58%vs 71%）。本中心對22例FLT3-ITD突變陽性AML患者行sUCBT，其中7例患者移植時處于疾病進展期，通過采用強化清髓不含ATG的技術體系，20例患者獲得造血重建，截至隨訪終點，3年無病生存率為63.6%，總生存率為62.9%，3年累積復發(fā)率為13.6%，其復發(fā)率明顯低于Bornhaüser等的報道，可見該技術體系可消除FLT3-ITD基因突變對患者移植后生存的影響。Hiwarkar P等[11]通過研究臍帶血T細胞及成人外周血T細胞作用于EB病毒（EBV）感染相關性B細胞淋巴瘤的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)臍帶血中的CD8+T細胞通過表達更高的CCR7水平能更快滲入腫瘤，同時持續(xù)誘導細胞毒性T細胞及Th1型T細胞在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生，有著更強的抗腫瘤效應。Milano F等[12]回顧性分析521例急性白血病及骨髓增生異常綜合征（MDS）患者接受清髓性造血干細胞移植療效，針對移植前MRD陽性患者，接受非血緣臍帶血移植患者的總生存率與接受HLA全相合無關供者移植的患者無明顯差異，同時復發(fā)率較HLA全相合或不全相合供者干細胞移植的患者明顯減低，且有統(tǒng)計學差異，可見臍帶血有著更強的移植物抗白血病（GVL）效應，特別是針對高危血液系統(tǒng)腫瘤患者。我中心在傳統(tǒng)方案基礎上加用大劑量阿糖胞苷或氟達拉濱，進一步殺滅腫瘤細胞，徹底破壞患者自身免疫系統(tǒng)，獲得良好干細胞植入。除加強預處理強度外，我中心預處理沒有使用ATG，移植后GVL作用較強。另外，本組22例中13例出現(xiàn)植入前免疫反應（PES），現(xiàn)已有多篇文獻證實PES與移植后GVHD的發(fā)生具有相關性，而GVHD是移植物對自身癌細胞發(fā)生免疫反應的主要表現(xiàn)，因此認為PES亦具有GVL效應。根據(jù)Park等研究顯示[13]，PES可促進植入及提高GVHD發(fā)生率，而不增加移植相關死亡率。我中心在移植早期患者出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹等表現(xiàn)時及時加用靜脈甲基潑尼松龍治療，絕大多數(shù)患者得到完全緩解，未遷延為GVHD。

目前除進行造血干細胞移植，針對FLT3-ITD突變的靶向治療藥物的研究取得了顯著進展，其中索拉非尼治療伴FLT3-ITD突變陽性AML患者的療效已得到肯定。多項研究報道了索拉非尼治療難治復發(fā)AML患者的一期臨床試驗結果顯示，其能有效減少患者外周血及骨髓中原始細胞數(shù)，維持疾病無進展[14-16]。Ravandi F[17]等報道了索拉非尼二期臨床試驗結果，對39例伴FLT3-ITD突變陽性的難治復發(fā)AML患者予以索拉非尼聯(lián)合5-氮雜胞苷治療，64%患者在一療程后獲得超過85%的FLT3基因抑制，但該組患者平均緩解時間只有2.3個月，可能與快速出現(xiàn)耐藥有關。劉莎等[18]報道了9例索拉非尼聯(lián)合DA/IA/MA方案治療FLT3-ITD突變陽性AML患者臨床療效，其中7例為難治復發(fā)性AML，治療后7例達CR，獲得分子學緩解中位時間為56 d，1例達CRp（血小板未達CR標準），1例達PR后行異基因造血干細胞移植，9例患者目前均無病生存，無患者出現(xiàn)III-IV級非血液系統(tǒng)不良反應。索拉非尼可明顯抑制FLT3-ITD基因磷酸化，降低突變患者的復發(fā)率，耐受性較好。但對于索拉非尼聯(lián)合造血干細胞移植對FLT3-ITD突變患者的療效仍不確切。Sharma M[19]等2011年報道了16例FLT3-ITD陽性AML患者移植復發(fā)后單純服用索拉非尼或聯(lián)合化療，雖然外周血中原始細胞數(shù)較前減少80%，但無患者獲得完全緩解，平均生存時間僅83 d，無患者生存大于1年。Metzelder SK[20]等對65例FLT3-ITD突變陽性AML患者行回顧性分析，同時接受造血干細胞移植和口服索拉非尼患者，其耐藥率較單純口服藥物患者明顯減低，其中4例移植后出現(xiàn)分子學復發(fā)患者予以口服索拉非尼治療后，2例達完全緩解，另2例分別存活216 d和221 d。另1項關于FLT3-ITD突變陽性CR1期異基因造血干細胞移植患者的單中心研究，26名患者在移植后口服索拉菲尼作為維持治療，對比55例未口服藥物患者，索拉菲尼組患者的2年OS及PFS明顯優(yōu)于對照組（81% vs 62%，82% vs 53%），復發(fā)率明顯減低（8% vs 38%）[21]。南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院劉啟發(fā)教授[22]等開展的針對FLT3-ITD突變陽性的AML患者在異基因造血干細胞移植后口服索拉菲尼的一項多中心、隨機對照3期臨床實驗，在2015年6月20日至2018年7月21日共入組202名患者，其中在移植后1-2月開始口服索拉菲尼患者共100名，移植后1年索拉菲尼組患者疾病復發(fā)率7.0%，對照組24.5%，有顯著統(tǒng)計學差異（P=0.001），兩組患者移植后感染、急性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病發(fā)生率均無明顯差異。本研究中的FLT-ITD突變陽性AML患者在接受臍血移植后未口服索拉菲尼預防，對于FLT3-ITD突變患者臍血移植后是否需要長期維持治療以及復發(fā)后患者索拉非尼的療效仍需大樣本臨床研究驗證。

本中心采用強化清髓sUCBT治療FLT3-ITD突變陽性AML初步結果顯示療效較好，值得進一步觀察和推廣應用。但由于本研究病例數(shù)較少，F(xiàn)LT3-ITD突變陽性AML患者緩解后選用何種供者來源能獲得最佳療效，移植后是否需要特異性抑制劑維持治療仍需大樣本前瞻性多中心隨機對照研究結果進一步證實。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突。