單克隆抗-CD38抗體對紅細(xì)胞血型血清學(xué)檢測的干擾及解決方法現(xiàn)狀

邵林楠 于衛(wèi)建 周世航

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種漿細(xì)胞克隆性增殖的血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。在骨髓瘤細(xì)胞表面有一種高表達(dá)的跨細(xì)胞膜糖蛋白：CD38分子，在紅細(xì)胞、正常淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中僅少量表達(dá)，因此CD38分子可作為 MM治療的新靶點(diǎn)[2]。

自2015年全球第一款單克隆抗-CD38抗體（Daratumumab，被譯為達(dá)雷妥尤、達(dá)雷木或達(dá)拉木）在美國獲批上市以來，它的高效性和良好的安全性使得其被廣泛應(yīng)用于治療復(fù)發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤[3,4]。2019年7月，中國國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)達(dá)雷妥尤上市，為我國MM患者帶來福音。與此同時(shí)，更多的單克隆抗-CD38抗體（Isatuximab、MOR202和TAK079等）也在積極的進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)中[5]，不久的將來，可能會批準(zhǔn)用于MM的治療中。

由于多種因素影響，大部分MM患者會出現(xiàn)貧血癥狀，輸血用于治療MM貧血，起效較快，可迅速達(dá)到糾正貧血的目的。但是很早人們已經(jīng)認(rèn)識到，達(dá)雷妥尤會在間接抗球蛋白試驗(yàn)（IAT）中產(chǎn)生泛凝集（pan agglutination）現(xiàn)象而干擾交叉配血等相關(guān)試驗(yàn)[6]。同樣的，Isatuximab及MOR202也被發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生類似的干擾[7]。

隨著單克隆抗體治療的日益普及，輸血實(shí)驗(yàn)室收到此類患者血液標(biāo)本的可能性也隨之增加，為輸血服務(wù)帶來重大挑戰(zhàn)。本文將結(jié)合已發(fā)表的臨床文獻(xiàn)資料，綜述國內(nèi)外解決這一問題的各種方法，最后提出優(yōu)化輸血管理的建議。

1 CD38分子 CD38分子是一種長46kDa的單鏈II型跨膜糖蛋白，編碼基因位于4號染色體（4p15）上，由一個(gè)短的（20個(gè)氨基酸）N端胞質(zhì)尾和一個(gè)長的（256個(gè)氨基酸）胞外結(jié)構(gòu)域組成[8,9]。CD38抗原早在1980年由美國學(xué)者用單克隆抗體在人類淋巴細(xì)胞表面探索T細(xì)胞受體時(shí)被發(fā)現(xiàn)，最初被作為胸腺細(xì)胞和活化T細(xì)胞標(biāo)記物（T10，現(xiàn)在的CD38）[10,11]。它的生物學(xué)功能包括胞外酶活性、細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)與受體介導(dǎo)的粘附等[12]。CD38分子不但表達(dá)于前列腺上皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞、一些神經(jīng)元的核周和樹突、腎小管、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和角膜細(xì)胞等組織中[13-15]， 還表達(dá)于漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板上[16]。由于CD38分子在骨髓瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，而在紅細(xì)胞、正常淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中僅少量表達(dá)，因此CD38分子已經(jīng)成為MM治療的新靶點(diǎn)[2]。

2 抗-CD38抗體 常見的單克隆抗-CD38抗體作用機(jī)制見表1。TAK-079不僅用于治療MM患者，而且也被嘗試用于治療自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡[17]。在體外對比試驗(yàn)中，與Isatuximab、MOR202和TAK-079等單抗相比，達(dá)雷妥尤在低濃度下誘導(dǎo)CDC的效果最好；上述抗-CD38單抗均能誘導(dǎo)ADCC；與MOR202相比，達(dá)雷妥尤和TAK-079單抗對ADCP誘導(dǎo)作用更強(qiáng)[18]。除此之外，一些用于治療MM的免疫毒素及雙特異性抗體也正在研究試驗(yàn)中，如抗-CD38 抗體HB7與化學(xué)修飾的蓖麻毒素分子結(jié)合的免疫毒素、抗-CD38單抗IB4偶聯(lián)1型核糖體失活蛋白（saporin-S6）組成的免疫毒素以及雙特異性GBR-1342抗體（靶向CD38和CD3）等[19-21]。

3 單克隆抗-CD38抗體對紅細(xì)胞血型血清學(xué)檢測的干擾早期研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)雷妥尤使常規(guī)IAT均產(chǎn)生泛凝集現(xiàn)象，包括運(yùn)用IAT進(jìn)行的不規(guī)則抗體篩查及鑒定、紅細(xì)胞抗原表型分析和交叉配血試驗(yàn)等[6,7]。這是由于達(dá)雷妥尤與獻(xiàn)血者/試劑紅細(xì)胞表面CD38結(jié)合，再加入抗體球蛋白試劉，通過橋連作用產(chǎn)生凝集現(xiàn)象（圖1）。這種泛凝集一般較弱，通常為1+左右，這是由于達(dá)雷妥尤與獻(xiàn)血者/試劑紅細(xì)胞表面CD38結(jié)合引起的，停藥后6個(gè)月之內(nèi)仍可觀察到IAT泛凝集現(xiàn)象[6,7,28]。但是，達(dá)雷妥尤不會對直接離心法結(jié)果造成干擾，如檢測患者ABO、RhD血型、鹽水介質(zhì)交叉配血等。

表1 常見的抗-CD38單抗及作用機(jī)制

4 解決單克隆抗-CD38抗體干擾的方法 達(dá)雷妥尤對IAT方法的干擾可能導(dǎo)致額外不必要的檢測，并延長交叉配血所消耗的時(shí)間，使患者貧血狀態(tài)不能及時(shí)得到糾正，特別是在操作人員不知患者使用了達(dá)雷妥尤的情況下，進(jìn)行交叉配血或者不規(guī)則抗體篩查、鑒定時(shí)會認(rèn)為存在特異性抗體。而且臨床上有意義的同種抗體可能會被泛凝集所掩蓋，給患者帶來急性或延遲性輸血反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。為了克服達(dá)雷妥尤對輸血醫(yī)學(xué)造成的干擾，國內(nèi)外學(xué)者介紹了以下幾種解決方案。

4.1 直接使用凝聚胺法：凝聚胺是一種高價(jià)陽離子聚合物、肝素中和劑，可以引起可逆的、非特異性的紅細(xì)胞凝集，促進(jìn)紅細(xì)胞抗體的檢測。此法可以檢測絕大部分具有臨床意義的血型抗體包括IgG和IgM，但是對抗-K敏感性低[29]。因?yàn)橹袊酥翓|南亞地區(qū)人群K抗原極低，抗-K抗體非常罕見。而在其他人種中K抗原相對常見[30]，使用凝聚胺的方法可能造成抗-K抗體漏檢從而給輸血帶來風(fēng)險(xiǎn)，所以凝聚胺法逐漸被其他方法取代甚至被拋棄，在歐美等地區(qū)沒有真正流行起來。但是凝聚胺在國內(nèi)及東南亞地區(qū)使用較為普遍[31]，因?yàn)閹缀蹩梢圆挥每紤]抗-K的緣故。我國臺灣地區(qū)也使用凝聚胺法進(jìn)行交叉配血試驗(yàn)，而且發(fā)現(xiàn)使用達(dá)雷妥尤患者在進(jìn)行聚凝胺法交叉配血時(shí)無干擾發(fā)生[32]。

4.2 輸注主要血型抗原同型紅細(xì)胞：在使用達(dá)雷妥尤治療前，對患者進(jìn)行紅細(xì)胞表型和基因型分型對于后期輸血時(shí)提供相容性紅細(xì)胞是非常有效的?；颊咻斪⑴c自身表型相近的紅細(xì)胞可以降低紅細(xì)胞同種抗體的產(chǎn)生[33]?；颊呒t細(xì)胞表型應(yīng)在患者開始使用單克隆抗-CD38抗體治療之前并在末次輸血后至少3個(gè)月（否則可能產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果）期間進(jìn)行鑒定[34]。紅細(xì)胞抗原的基因分型可以隨時(shí)進(jìn)行，并且可以提供比表型更全面的細(xì)節(jié)。但是基因分型成本昂貴，還需要大約1星期的周轉(zhuǎn)時(shí)間[35]。不同人群可以根據(jù)抗原頻率及免疫原性的特點(diǎn)選擇相應(yīng)抗原進(jìn)行分型。根據(jù)我國臨床血液標(biāo)本中查出的意外抗體的分布及特點(diǎn)，可對Rh、MNS、Kidd、Lewis、Duffy等血型系統(tǒng)進(jìn)行分型。

4.3 利用CD38抗原陰性紅細(xì)胞進(jìn)行檢測：缺乏CD38抗原的紅細(xì)胞不與單克隆抗-CD38抗體結(jié)合，因此在IAT實(shí)驗(yàn)中不出現(xiàn)干擾。臍帶血紅細(xì)胞表面缺少或微量表達(dá)CD38抗原。據(jù)報(bào)道利用臍帶血紅細(xì)胞對兩名使用達(dá)雷妥尤治療的患者成功地進(jìn)行了17次抗體篩查及紅細(xì)胞輸注[36]。值得注意的是，臍帶血紅細(xì)胞表面某些抗原可能發(fā)生了改變，而且無法保證臍帶血紅細(xì)胞得到充足供應(yīng)，很難用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)中[33,36-37]。同樣，CD38抗原也不表達(dá)于Lu（a-b-）紅細(xì)胞表面，但此細(xì)胞非常罕見，而且使用達(dá)雷妥尤治療的患者與此類紅細(xì)胞交叉配血時(shí)可能產(chǎn)生患者血液中含有Lutheran系統(tǒng)相關(guān)抗體的假象[38，39]。

4.4 二硫蘇糖醇（DTT）預(yù)處理供者紅細(xì)胞：DTT是一種巰基還原劑，它可以通過破壞紅細(xì)胞胞外區(qū)的二硫鍵進(jìn)而使紅細(xì)胞表面CD38變性，達(dá)到阻止抗-CD38抗體與紅細(xì)胞結(jié)合的目的[40]。目前國外實(shí)驗(yàn)室使用此法的最為普遍。經(jīng)證實(shí)，使用0.2 mol/L DTT預(yù)處理的供者紅細(xì)胞與患者血漿進(jìn)行IAT試驗(yàn)，不會產(chǎn)生泛凝集的干擾[40]。Hugan等[41]報(bào)道，經(jīng)0.2 mol/L DTT處理的譜細(xì)胞在12天內(nèi)，雖然會發(fā)生溶血現(xiàn)象但不影響檢測性能，但溶血可能導(dǎo)致DTT處理的譜細(xì)胞數(shù)量減少。而Lally等[42]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DTT處理（未詳細(xì)介紹DTT處理方法）的篩選細(xì)胞在9天內(nèi)，可檢測到細(xì)胞表面具有臨床意義的抗原（Kell除外），但對于某些同種抗體，反應(yīng)強(qiáng)度卻降低了一到兩個(gè)等級。

Hosokaw等[43]嘗試使用0.01 mol/L DTT處理紅細(xì)胞，這樣既使CD38抗原變性，消除了抗-CD38抗體帶來的干擾，又可以部分保留K抗原。Lorenzen等[44]對DTT處理方法又進(jìn)行了改良，按照紅細(xì)胞與0.2M DTT體積比為30∶25的比例處理紅細(xì)胞，經(jīng)處理的紅細(xì)胞與未經(jīng)處理的紅細(xì)胞有相同程度的溶血現(xiàn)象，而且可以保存33天，此期間內(nèi)，反應(yīng)強(qiáng)度沒有下降。

盡管DTT預(yù)處理供者紅細(xì)胞的方法從試劑配制到實(shí)驗(yàn)結(jié)束可能需要花費(fèi)2～4小時(shí)，而且DTT是有刺激性氣味的有害物質(zhì)，部分試驗(yàn)應(yīng)該在通風(fēng)柜下操作[5]。經(jīng)處理過的紅細(xì)胞表面部分抗原遭到破壞，而且在后續(xù)IAT試驗(yàn)過程中容易發(fā)生溶血現(xiàn)象。其他和DTT有相似作用的巰基試劑：2-巰基乙醇（2-ME）和溴化2-氨基乙基異硫脲（AET）或許也可以用來去除泛凝集的干擾[40]。

4.5 蛋白酶預(yù)處理供者紅細(xì)胞：人們對于胰蛋白酶或木瓜蛋白酶預(yù)處理供者紅細(xì)胞方面的研究還沒有達(dá)到研究DTT法的程度，這些方法目前還不太可能取代DTT法。Chapuy等[6]證明2%的胰蛋白酶可將達(dá)雷妥尤與CD38陽性的HL-60細(xì)胞的結(jié)合率降低40%，而使用10 mmol/L DTT則可使結(jié)合率降低92%。胰蛋白酶不會降解Kell抗原，但會破壞許多其他具有臨床意義的抗原，包括M、N、EnaTS和免疫原性較弱的Ge2、Ge3、Ge4、Ch/Rg、Lutheran等抗原[45]。而Bub等[46]發(fā)現(xiàn)，在33名使用了達(dá)雷妥尤或Isatuximab單抗治療的患者中，木瓜蛋白酶處理紅細(xì)胞可以成功消除單克隆抗-CD38抗體對IAT實(shí)驗(yàn)帶來的干擾，且能夠鑒定出3名患者攜帶的同種抗體。但是木瓜蛋白酶能降解Duffy和MNS血型系統(tǒng)中的抗原，以及Ch/Rg、Ge2和Ge4等抗原[45]。

4.6 F（ab'）2片段封閉供者紅細(xì)胞表面CD38抗原：Selleng等[47]利用胃蛋白酶消化達(dá)雷妥尤單抗，產(chǎn)生的F（ab'）2片段結(jié)合紅細(xì)胞上的CD38抗原使其被封閉，進(jìn)而防止達(dá)雷妥尤單抗結(jié)合紅細(xì)胞表面CD38抗原從而消除IAT試驗(yàn)的干擾。此法可以檢測血清中已經(jīng)存在的所有同種抗體。

4.7 阻斷達(dá)雷妥尤單抗法：Chinoca Ziza等[48]首先利用注射后空瓶中殘留的達(dá)雷妥尤封閉供者紅細(xì)胞表面CD38抗原，然后再用抗人球蛋白試劑封閉達(dá)雷妥尤Fc部分。此時(shí)供者紅細(xì)胞無暴露的CD38抗原以及未經(jīng)封閉的達(dá)雷妥尤Fc部分，且其他抗原不受影響。再將患者血漿與處理好的供者紅細(xì)胞進(jìn)行IAT交叉配血時(shí)，可避免達(dá)雷妥尤單抗造成的干擾。

4.8 IAT試驗(yàn)前使用抗獨(dú)特型抗體或可溶性CD38受體中和達(dá)雷妥尤單抗：防止達(dá)雷妥尤對IAT試驗(yàn)產(chǎn)生泛凝集干擾的最直接的方法是在進(jìn)行IAT試驗(yàn)之前中和患者血清中的達(dá)雷妥尤。這可以通過抗達(dá)雷妥尤或可溶性CD38受體來實(shí)現(xiàn)。理論上，可溶性CD38可以中和任何抗-CD38，而不同的抗獨(dú)特型抗體只能中和對應(yīng)的抗-CD38抗體。兩項(xiàng)研究分別證實(shí)上述兩種方法均能消除達(dá)雷妥尤的干擾，而且對血清中已經(jīng)存在的同種抗體不產(chǎn)生干擾，但可溶性CD38受體消除達(dá)雷妥尤干擾的效果稍遜于抗獨(dú)特型抗體法[6,7]。這些方法成本過于昂貴，難以普遍用于常規(guī)檢測中。

4.9 其他方法：上述解決單克隆抗-CD38抗體對IAT干擾的方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)見表2。除此之外，Chapuy等[6]還嘗試通過使用普通紅細(xì)胞和經(jīng)ZZAP處理過的紅細(xì)胞來吸收患者血漿中達(dá)雷妥尤以達(dá)到消除干擾的目的，但都未能成功。其他抗-CD38抗體也會干擾IAT試驗(yàn)，也可用類似的緩解策略解決[49]。值得注意的是，使用達(dá)雷妥尤治療的患者自身紅細(xì)胞的反應(yīng)性經(jīng)常是陰性的，直接抗球蛋白試驗(yàn)也是如此。這可能是因?yàn)榛颊呒t細(xì)胞表面的部分CD38抗原在循環(huán)過程中被清除和/或受到抗-CD38介導(dǎo)影響，CD38抗原表達(dá)量下調(diào)[50]。這可能解釋了為什么達(dá)雷妥尤僅在體內(nèi)引起少量的血紅蛋白降低（約1 g/dL），未觀察到嚴(yán)重的溶血現(xiàn)象[7，51]。

表2 現(xiàn)有緩解抗-CD38抗體干擾方法的優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)匯總

5 輸血管理的建議 隨著達(dá)雷妥尤等單克隆抗體治療的日益普及，醫(yī)務(wù)人員需要意識到其對輸血前的檢測會造成干擾，并制定適當(dāng)?shù)慕鉀Q方案以應(yīng)對。改善臨床護(hù)理團(tuán)隊(duì)與輸血實(shí)驗(yàn)室之間的溝通至關(guān)重要。如果輸血實(shí)驗(yàn)室操作人員沒有意識到患者正在接受達(dá)雷妥尤單抗治療，就會進(jìn)行冗長繁瑣的常規(guī)檢測，從而浪費(fèi)了試劑和人力資源，并延遲了交叉配血的時(shí)間。高效的患者護(hù)理和及時(shí)的血液制品交付是每位參與的醫(yī)務(wù)人員共同目標(biāo)。獲知患者將進(jìn)行單抗治療前，應(yīng)該對患者進(jìn)行ABO/RhD血型鑒定、直抗、抗體篩查等基礎(chǔ)試驗(yàn)，有條件的科室可以考慮進(jìn)行紅細(xì)胞表型或者基因分型。當(dāng)患者已經(jīng)接受了抗-CD38抗體治療，我們可以首選凝聚胺法進(jìn)行交叉配血或抗體篩查試驗(yàn)，因?yàn)榇朔ê唵?、省時(shí)且試劑廉價(jià)，不破壞紅細(xì)胞表面抗原，而且?guī)缀蹩梢院雎钥?K的問題。其次可以采用DTT等含巰基試劑處理紅細(xì)胞的方法。理論上，應(yīng)該給患者提供一張可隨身攜帶的卡片或手環(huán)，提示患者正在接受抗-CD38抗體治療及進(jìn)行過的基礎(chǔ)試驗(yàn)結(jié)果，并告知抗-CD38抗體治療可能會對輸血前試驗(yàn)產(chǎn)生干擾，同時(shí)還應(yīng)提供臨床醫(yī)生或醫(yī)院輸血科聯(lián)系方式，這使得患者旅行或遠(yuǎn)離治療醫(yī)院時(shí)遇見緊急情況，醫(yī)護(hù)人員可及時(shí)獲取有用信息[5]。若進(jìn)行搶救，來不及交叉配血時(shí)，可根據(jù)當(dāng)?shù)匮獛鞈T例給予未經(jīng)交叉配血的ABO、RhD相合的紅細(xì)胞。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突