碳青霉烯耐藥大腸埃希菌的藥物敏感性、耐藥基因及多位點序列分型分析*

謝暉 曹小利 陳雨欣 周萬青 沈瀚

大腸埃希菌是臨床常見的機會感染致病菌，常引起血流感染、尿路感染及呼吸道感染等[1]。大腸埃希菌是產超廣譜β內酰胺酶（Extended-Spectrum β-Lactamases，ESBL）的主要細菌，碳青霉烯類抗菌藥物是臨床治療產ESBLs腸桿科細菌的主要抗菌藥物[2]。隨著該類藥物的廣泛使用，碳青霉烯耐藥大腸埃希菌（Carbapenem-resistantE. coli，CREC）在臨床檢出不斷增多，已成為全球面臨的嚴峻問題[3,4]。本研究主要對我院近幾年連續(xù)非重復分離的11株CREC進行相關的分子特點分析。報道如下。

材料與方法

1 主要儀器與試劑 Vitek 2 Compact及其配套GN鑒定卡和GN13藥敏卡（法國梅里埃公司）；Taq Mix（DBI公司）；PCR引物由上海生工公司合成；2720型PCR擴增儀（Applied Biosystems公司）；瓊脂糖（法國Biowest公司）；100 bp DNA Marker（大連Takara公司）；電泳儀及GelDoc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 菌株來源 收集南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院近幾年連續(xù)非重復分離碳青霉烯耐藥（以亞胺培南作為篩選標準）大腸埃希菌11株。樣本來源包括：分泌物3株、尿液3株、血液3株及痰液2株。使用Vitek 2 Compact全自動微生物分析儀鑒定菌種。blaNDM基因和blaKPC-2基因陽性對照菌株為本實驗室保存菌株；疊氮鈉耐藥大腸埃希菌J53來源于上海華山醫(yī)院抗生素研究所；大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

3 藥物敏感性試驗 采用Vitek 2 Compact 及其配套GN13藥敏卡測定細菌對常規(guī)藥物的敏感性，測定藥物包括：亞胺培南、厄他培南、阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星、復方新諾明、慶大霉素、頭孢唑林、頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟及左氧氟沙星。藥敏結果的判定依據美國臨床和實驗室標準協(xié)會CLSI M100 2019版標準[5]。大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853為質控菌株。

4 碳青霉烯耐藥基因檢測 采用煮沸法提取細菌DNA。將新鮮培養(yǎng)的單菌落混懸于1 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS），13 000 r/min離心10 min后，棄上清，加入100 μL無菌水，在99 ℃金屬浴中放置10 min使細菌裂解，13 000 r/min離心5 min，上清即為模板，-20℃?zhèn)溆?。參照文獻合成碳青霉烯耐藥基因blaKPC、blaAIM、blaSIM、blaSPM、blaVIM、blaIMP、blaOXA、blaDIM、blaNDM、blaGIM和blaBIC引物[6]，引物序列及產物大小見表1。PCR反應體系為50 μL：2×Taq Mix 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 5min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產物經12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后觀察。陽性PCR產物送擎科生物有限公司測序，測序結果提交NCBI進行比對，確定基因型。

表1 碳青霉烯耐藥基因的引物序列及產物大小

5 多位點序列分型 依據網站提供的大腸埃希菌多位點序列分型引物及條件（https://bigsdb.pasteur.fr/ecoli/ecoli.html），合成7個管家基因adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA的擴增引物后，分別進行PCR擴增，PCR的擴增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃7 min。擴增產物送擎科生物有限公司測序，并提交到網站進行菌株的序列分型（https://bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_ecoli_seqdef）。

6 接合試驗 挑取blaNDM陽性菌株和疊氮鈉耐藥大腸埃希菌J53菌落分別接種于5 mL不含抗菌藥物的LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)6～8 h；取300 μLblaNDM陽性菌株培養(yǎng)肉湯和700 μL疊氮鈉耐藥大腸埃希菌J53混勻入5 mL LB肉湯中，37℃ 200 r/min過夜；取100 μL混合培養(yǎng)液涂布到含有150 μL/mL疊氮鈉和2 μL/mL美羅培南的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)；挑取單菌落提取細菌DNA，使用PCR法驗證blaNDM基因，使用腸桿菌基因間重復共有序列（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC）PCR技術分析接合子與疊氮鈉耐藥大腸埃希菌J53和產blaNDM大腸埃希菌之間的遺傳相關性，進而確定接合子。

結 果

1 藥物敏感性 大腸埃希菌對亞胺培南、厄他培南、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢曲松和頭孢唑林、氨芐西林均具有較高耐藥性，耐藥率≥90%；對頭孢替坦和環(huán)丙沙星的耐藥率達到88.2%，對慶大霉素的耐藥率達到72.7%，對左氧氟沙星、氨芐西林/舒巴坦和哌拉西林/舒巴坦的耐藥率達到63.6%，對阿米卡星、復方新諾明、妥布霉素、氨曲南耐藥性較低，耐藥率小于40%。

2 碳青霉烯耐藥基因檢測結果 11株碳青霉烯耐藥大腸埃希菌中，有9株檢出blaNDM（見圖1）基因，另2株未檢出。測序后證實8株攜帶blaNDM-5，1株攜帶blaNDM-4，有2株細菌同時攜帶blaNDM-5和blaKPC-2基因。

3 多位點序列分型結果 9株blaNDM陽性大腸埃希菌分為7種ST型，其中有3株為ST167型，其余6株分別為ST6349、ST361、ST6335、ST617、ST7016和ST354型。

4 接合試驗 9株blaNDM陽性細菌均可獲得接合子，進一步的分析證實為blaNDM基因接合子；但在2株同時攜帶blaNDM和blaKPC-2基因的大腸埃希菌的blaNDM接合子中未檢出blaKPC-2基因。

討 論

碳青霉烯耐藥大腸埃希菌的出現(xiàn)及播散是全球面臨的嚴峻問題[4]。了解該類細菌的藥物敏感性、碳青霉烯耐藥基因的分布特點及多位點序列分型，對于臨床抗菌藥物的選擇及感染控制措施的制定具有很好的指導意義。

本文結果顯示，碳青霉烯耐藥大腸埃希菌不僅對碳青霉烯類抗菌藥物如亞胺培南、厄他培南具有較高的耐藥性，而且對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和慶大霉素等藥物的敏感性也不高，這與其他報道一致[3，7]，表明這種細菌引起的感染容易導致臨床抗感染治療藥物選擇的局限。值得注意的是，本研究中，碳青霉烯耐藥大腸埃希菌對氨曲南、阿米卡星、復方新諾明的敏感性相對較高，因此，對于由該類細菌造成的感染治療可考慮這些抗菌藥物的聯(lián)合治療策略。

有研究顯示，NDM的產生是大腸埃希菌對碳青霉烯耐藥的主要機制[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，blaNDM基因在碳青霉烯耐藥大腸埃希菌中流行廣泛，這與以往的報道一致[9]。而在9株blaNDM基因陽性菌株中，8株細菌攜帶的是blaNDM-5基因，表明NDM-5型碳青霉烯酶是介導我院大腸埃希菌對碳青霉烯類耐藥的主要機制。另有1株細菌攜帶blaNDM-4基因，而目前對產NDM-4的大腸埃希菌也有報道[10]。

我們的接合試驗結果表明，blaNDM基因是可轉移的，推測位于可接合質粒上，需加強感染控制措施，防止該類基因的播散。同時，在從2株同時攜帶blaKPC-2和blaNDM基因的大腸埃希菌所獲得的接合子中，我們僅檢出了blaNDM基因，未檢出blaKPC-2基因。據此推測，攜帶blaNDM基因的質粒不攜帶blaKPC-2基因。雖然流行病學研究發(fā)現(xiàn)blaKPC-2大多位于質粒[11]，且關于blaKPC-2和blaNDM基因在同一質粒中播散的情況也有報道[12]。本研究中，若blaKPC-2基因位于染色體上，便不會隨著質粒轉移；若blaKPC-2基因位于質粒，而接合試驗的過程中，卻沒有和攜帶blaNDM基因的質粒一同轉移，很可能是blaKPC-2基因位于非接合的質粒[13]，不可轉移；或者受體菌因為生物適應性原因，只能獲得其中一種質粒，而攜帶blaNDM基因的質粒與受體菌有更好的適應性[13]，其轉移性優(yōu)于攜帶blaKPC-2基因的質粒，導致只有攜帶blaNDM基因的質粒轉移而不伴有攜帶blaKPC-2基因的質粒轉移。這些推測都需要進一步的驗證。然而，考慮到該類細菌同時攜帶兩種碳青霉烯耐藥基因，理應進一步加強監(jiān)控，以免其播散而導致院內暴發(fā)流行。

我們也發(fā)現(xiàn)，9株blaNDM陽性大腸埃希菌的ST分型呈多樣化，表明該類細菌的播散不是以克隆流行為主，進一步結合blaNDM存在于可接合質粒上的發(fā)現(xiàn)，表明blaNDM主要通過質粒的傳遞實現(xiàn)播散。此外，ST131型大腸埃希菌是國際常見克隆流行株[14]，而本研究未檢出ST131菌株。本研究發(fā)現(xiàn)，ST167是blaNDM陽性大腸埃希菌的主要克隆型。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，ST167大腸埃希菌是NDM-5/NDM-1及ESBL中CTX-M的主要宿主菌[15]，在日本、意大利、上海等地已被報道[16,17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，產NDM-5的ST167型大腸埃希菌可在寵物與人之間播散[18]。因此需加強我院產NDM-5的ST167型大腸埃希菌的監(jiān)控并早期采取有效的隔離措施。

總而言之，碳青霉烯耐藥大腸埃希菌對臨床常用多種抗菌藥物高度耐藥， NDM酶的產生是主要的碳青霉烯耐藥機制，編碼該酶的基因主要存在于可接合的質粒上，容易在大腸埃希菌中播散，需進一步加強感染控制措施。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突