二至丸抑制皮膚黑素瘤細(xì)胞生長的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制及關(guān)鍵靶點探討*

陳 敬，楊 寧，張雅星，高秀梅

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，天津 300250；2．天津中醫(yī)藥大學(xué)，方劑學(xué)教育部重點實驗室，組分中藥國家重點實驗室，天津 301617）

二至丸（EZP）是臨床常用的經(jīng)典名方，僅由女貞子（酒蒸）和墨旱蓮 2味藥（1∶1）組成，可單獨使用，也可隨證加減。EZP是平肝補(bǔ)腎之良劑，主治肝腎陰虛證，研究證實其藥理作用包括調(diào)節(jié)免疫力，抑制腫瘤生長，抗炎，抗氧化，抗衰老等[1-3]。中醫(yī)認(rèn)為肝腎二臟在皮膚病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，臨床實踐中注重對肝腎的調(diào)補(bǔ)，以期對皮膚病的管理取得良好的效果。EZP臨床用于多種腫瘤的防治[4-5]，該藥有多維度的干預(yù)腫瘤的機(jī)制，其中之一可能與上調(diào)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平有關(guān)，NF-κB與TNF-α屬于上下游關(guān)系，而NF-κB信號通路在黑素瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著分子開關(guān)樣重要的作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，因此EZP也用于陰虛型皮膚黑素瘤（SKCM）患者的調(diào)護(hù)[6-8]。文章采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對EZP的有效成分抑制SKCM細(xì)胞生長的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制和關(guān)鍵靶點進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 二至丸藥物有效成分篩選 女貞子和墨旱蓮藥物有效成分的篩選，利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平 臺 （TCMSP），（http：//tcmspw．com/tcmsp．php），篩選條件設(shè)定為口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性指數(shù)（DL）≥0．18%。同時，在TCMSP平臺獲取EZP有效成分對應(yīng)的靶點蛋白，并在UniProtKB 數(shù)據(jù)庫（http：//www．uniprot．org/）檢索出藥物靶點所對應(yīng)的基因，檢索條件為人源基因（Organism：Homo sapiens）。

1.2 皮膚黑素瘤相關(guān)的靶點獲取 在GEO數(shù)據(jù)庫獲得黑素瘤細(xì)胞與黑素細(xì)胞的差異基因表達(dá)，（https：//www．ncbi．nlm．nih．gov/geo/，Series：GSE122910，Samples：GSM3487958，GSM3487959，GSM3487960，GSM3487961，GSM3487962，GSM3487963，GSM3487964，GSM3487965，GSM3487966，GSM3487967），檢索條件為人源基因。認(rèn)為P value＜0．005并|log 2（fold change）|＞1的基因具有顯著表達(dá)差異，是SKCM相關(guān)靶點。

1.3 建立二至丸對黑素瘤細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用CytoScape3．7．2，對 EZP“成分-靶點基因”“靶點基因-黑素瘤”的數(shù)據(jù)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?在CytoScape中應(yīng)用BisoGenet程序，建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI network），將EZP推定的靶點和SKCM的相關(guān)靶點進(jìn)行可視化展示。數(shù)據(jù)庫來源于相互作用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（DIP），交互數(shù)據(jù)集的生物通用存儲庫（BioGRID），人類蛋白質(zhì)參考數(shù)據(jù)庫（HPRD），完整的分子相互作用數(shù)據(jù)庫（IntAct），分子相互作用數(shù)據(jù)庫（MINT），生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（BIND）。應(yīng)用CytoNCA軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?，中心度（DC）在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和系統(tǒng)藥理學(xué)研究中代表了拓?fù)渲匾?，通過計算DC篩選交互網(wǎng)絡(luò)中具有拓?fù)渲匾缘墓?jié)點，篩選出樞紐基因（Hub genes）。

1.5 Hub genes的生存分析 利用基因表達(dá)譜交互分析數(shù)據(jù)庫（GEPIA），對按照DC篩選出的前10位的Hub genes進(jìn)行驗證。方法為全局的生存分析（overall survival，OS），群截斷為中位數(shù)，數(shù)據(jù)集為SKCM，繪制箱線圖（Boxplot）、分期圖（stage plot）和生存圖（survival plot）。

1.6 差異基因GO和KEGG富集分析、KEGG網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過基因本體（GO）分析EZP影響SKCM的生物學(xué)通路，通過京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析EZP影響SKCM的代謝通路。應(yīng)用DAVID 生物信息學(xué)資源（https：//david．ncifcrf．gov）進(jìn)行差異基因的富集分析，應(yīng)用功能注釋對黑素瘤細(xì)胞的差異基因進(jìn)行分析，選擇官方基因名稱（OFFICIAL_GENE_SYMBOL），默認(rèn)人類物種，并進(jìn)行生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能（MF）和KEGG途徑富集分析。篩選條件為P value＜0．05，圖中僅顯示前20個富集結(jié)果。應(yīng)用CytoScape構(gòu)建KEGG網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 二至丸有效成分 在OB≥30%，并DL≥0．18的條件下，獲得EZP有效成分21種，其中女貞子有效成分13種，墨旱蓮有效成分10種，兩味藥物共有的有效成分2種，分別為MOL000006木犀草素（luteolin）和 MOL000098槲皮素（quercetin），兩者的OB 值分別為 36．16 和 46．43，DL 分別為 0．25 和0．28，見表1。共獲得藥物靶點蛋白214個，得到人類靶點基因190個。

2.2 皮膚黑素瘤相關(guān)的靶點 共獲得1889個SKCM相關(guān)靶點，并通過圖1來顯示差異表達(dá)基因的分布，圖中紅色點代表SKCM上調(diào)的差異表達(dá)基因的分布，綠色點代表SKCM下調(diào)的差異表達(dá)基因的分布。圖2顯示黑素瘤細(xì)胞（腫瘤組，Tumor，T）與黑素細(xì)胞（觀察組，Control，C）的差異表達(dá)基因，紅色代表上調(diào)的基因，綠色代表下調(diào)的基因。

表1 二至丸有效成分（OB≥30%，DL≥0.18）

圖1 黑素瘤中差異基因表達(dá)分布

2.3 二至丸對黑素瘤細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) EZP有效成分與SKCM靶點基因作用的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，節(jié)點共32個，其中有效成分共11種（綠色代表墨旱蓮的有效成分4種，粉色代表女貞子的有效成分5種，藍(lán)色為兩味藥物共有的成分2種），可調(diào)控黑素瘤細(xì)胞的基因（黃色），共21個。邊線表示有效成分與靶點基因之間的相互作用，共產(chǎn)生邊線40條。產(chǎn)生邊線最多前3位有效成分，分別是槲皮素17條，木犀草素6條，此2者為女貞子與墨旱蓮共有的成分，山奈酚（kaempferol，MOL000422）6 條，此為女貞子中成分。靶點基因中PTGS1含邊線10條，DPP4含邊線5條，細(xì)胞核因子κB抑制劑α（NFKBIA）含邊線2條，這3個靶點基因的邊線均與女貞子與墨旱蓮的共有成分木犀草素和槲皮素產(chǎn)生相互作用。

圖3 二至丸有效成分與黑素瘤靶點基因作用的網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)建立及拓?fù)浞治?為了揭示EZP對SKCM的潛在作用機(jī)制，將EZP推定靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)和SKCM相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)合并，確定EZP對SKCM的候選靶點，共得出631個節(jié)點，見圖4。應(yīng)用DC篩選后，平均度值為22．3708，最大度值為178，表2列出了前10位的樞紐基因。

2.5 生存分析 分別對 NFKBIA，TP53，NTRK1，HSP90AA1，UBC，EP300進(jìn)行單因素生存分析，發(fā)現(xiàn)NFKBIA在腫瘤組（T）是低表達(dá)，在正常人群組（Normal，N）是高表達(dá)，見圖 5。同時，NFKBIA 在腫瘤的 0、1、2、3、4 期，表達(dá)差異變化不顯著，見圖 6。繪制生存圖發(fā)現(xiàn)NFKBIA低表達(dá)組生存較差，與正常組比較P＜0．005，見圖7。而 TP53，NTRK1，HSP90AA1，UBC，EP300的表達(dá)差異，均未對存活期產(chǎn)生明顯影響。

圖4 二至丸與黑素瘤的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

表2 二至丸治療黑素瘤的樞紐基因（前10位）

圖5 腫瘤組和正常組NFKBIA的表達(dá)

2.6 差異基因GO和KEGG富集分析、KEGG網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 GO富集分析EZP影響SKCM的生物學(xué)通路，圖中縱坐標(biāo)是GO的名稱，橫坐標(biāo)是富集在每一個GO上基因的數(shù)目，柱子越長代表富集在GO上基因的數(shù)目越多，柱子顏色代表富集的顯著性，越紅說明GO在這個基因上富集越顯著。富集最顯著的生物過程是對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide），對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)（response to molecule of bacterial origin），見圖 8。富集最顯著的細(xì)胞組成是膜筏（membrane raft），見圖9。富集最顯著的分子功能是趨化因子活性（chemokine activity），趨化因子受體結(jié)合（chemokine receptor binding），CXCR 趨化因子結(jié)合（CXCR chemokine receptor binding），細(xì)胞因子活性（cytokine activity），細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding），見圖10。通過KEGG途徑分析，確定EZP在治療SKCM過程中顯著影響的代謝途徑。圖中縱坐標(biāo)是KEGG的名稱，橫坐標(biāo)是基因的比例，圓圈的大小代表富集在每一個通路上基因的數(shù)目，圓圈越大說明富集在通路上的基因數(shù)目越多，圓圈的顏色代表富集的顯著性，圓圈越紅說明在這條通路上富集越顯著。前四位分別為腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway），白介素-17信號通路（IL-17 signaling pathway），趨化因子信號通路（Chemokine signaling pathway），細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction），見圖 11。基因-通路網(wǎng)絡(luò)分析通過KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)可視化，即KEGG與基因之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，外圈是通路，里面是基因，連線表示基因?qū)儆谶@個通路，基因和通路圖形的大小代表了連接節(jié)點的數(shù)目?；蛑械谝晃坏氖荖FKBIA，通路中第一位是TNF信號通路，見圖12。

3 討論

SKCM是一種侵襲性皮膚癌，并且具轉(zhuǎn)移性，中位生存率約為6個月，且發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，在中國每年新發(fā)病例約2萬例左右，轉(zhuǎn)移性黑素瘤預(yù)后極差，5年生存率低于10%[9-10]。SKCM起源于位于表皮基底層的黑素細(xì)胞，在正常的生理環(huán)境中，黑素細(xì)胞的生長受角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)，由于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的關(guān)鍵基因突變，黑素細(xì)胞無法對角質(zhì)形成細(xì)胞的調(diào)節(jié)信號做出適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)，最終導(dǎo)致異常生長。近年來，盡管在黑素瘤有效治療方法的發(fā)展方面取得了重大突破，但疾病的不可治愈性仍然是一個挑戰(zhàn)[11]。而且，許多傳統(tǒng)的抗癌療法面臨著許多問題，如多藥耐藥性、抵達(dá)癌組織前的全身分布和毒副作用等，臨床上需要不斷探索黑素瘤的管理方法，以期延長患者的生存時間。中草藥具有廣泛的藥理作用，應(yīng)用于各種慢性病和腫瘤的治療，它能影響多個分子靶點和通路，在臨床中顯示了良好的效果。

圖6 NFKBIA在黑素瘤不同臨床分期的表達(dá)

圖7 NFKBIA對生存周期的影響

圖8 二至丸影響黑素瘤的GO富集-生物學(xué)過程

圖9 二至丸影響黑素瘤的GO富集-細(xì)胞組成

圖10 二至丸影響黑素瘤的GO富集-分子功能

圖11 二至丸影響黑素瘤的KEGG富集

圖12 二至丸影響黑素瘤的KEGG網(wǎng)絡(luò)

二至丸出自明代吳旻輯的《扶壽精方》，其性平和、偏寒，歸肝、腎經(jīng)，其補(bǔ)而不膩，為平補(bǔ)佳品。臨床廣泛應(yīng)用于證屬肝腎虛證的多種疾病，也常用于緩解亞健康的相關(guān)癥狀，且鮮見不良反應(yīng)的報道。EZP應(yīng)用于包括SKCM等多種腫瘤的治療，取得較好臨床療效，且對EZP藥理作用的研究也表明它具有良好的抗腫瘤、抗衰老和抗炎等作用。

中醫(yī)藥是個高度復(fù)雜的系統(tǒng)，含有大量的化學(xué)成分，本研究嘗試通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討EZP治療SKCM的有效化學(xué)成分、關(guān)鍵靶點及分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。

EZP中3種有效成分與SKCM靶點基因作用密切，其中木犀草素和槲皮素是女貞子和墨旱蓮兩藥共有成分，具有較高的生物利用度；山奈酚來源于女貞子，可能是一種有效的免疫抑制劑，可減少有害的免疫反應(yīng)，包括慢性炎癥和自身免疫。

本研究得到的EZP對抗SKCM的候選目標(biāo)，按照DC篩選樞紐基因，發(fā)現(xiàn)列第1位的NFKBIA在腫瘤組是低表達(dá)。NFKBIA被認(rèn)為是1種抑癌基因，是避免NF-κB激活的重要抑制劑。研究表明NF-κB在SKCM細(xì)胞中被高度激活[12]，NF-κB特異性抑制劑具有顯著的抑制鼠黑素瘤B16細(xì)胞生長及VEGF表達(dá)的作用[7]，且具有顯著的抑制人黑素瘤A375細(xì)胞生長及PCNA表達(dá)的作用[8]，是1種有潛力的抑制黑素瘤增殖的藥物，阻斷NF-κB和ERK兩條信號通路對A375細(xì)胞具有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，兩者聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)[13]。難以控制的黑素瘤細(xì)胞NF-κB通路持續(xù)激活[14]，NFKBIA低表達(dá)顯著縮短患者生存時間，且NFKBIA在黑素瘤各個臨床分期中持續(xù)低表達(dá)，推測EZP可用于SKCM各期的管理，通過改善NFKBIA低表達(dá)，延長生存年限。

KEGG富集顯示，EZP影響黑素瘤細(xì)胞生長的代謝通路主要為TNF信號通路，IL-17信號通路，趨化因子信號通路，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等。TNF-α具有一定的抗腫瘤效應(yīng)，在小鼠黑素瘤模型研究中發(fā)現(xiàn)，它能夠促進(jìn)腫瘤的廣泛壞死[15]，多項臨床研究將TNF-α應(yīng)用于惡性黑色素瘤的肢端灌流，獲得較好效果。NF-κB是IL-17信號通路下游主要的亞通路，通路持續(xù)活化可能是疾病持續(xù)存在的原因之一[16]。

綜上，本研究對二至丸抑制皮膚黑素瘤細(xì)胞生長的分子機(jī)制和靶點進(jìn)行了基本預(yù)測，為后期基礎(chǔ)實驗進(jìn)一步驗證提供了理論基礎(chǔ)。