苦參堿對CT26荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF及HIF-1α水平的影響*

龔 雪，崔換天，郭瑋鈺，王 麗，邊育紅，張翟軼

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2．天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192）

近年來惡性腫瘤患病率持續(xù)升高，傳統(tǒng)治療手段（如手術(shù)、放療、化療）雖有一定優(yōu)勢，但仍存在轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、生存質(zhì)量降低等諸多問題?？鄥A是中藥苦參的主要成分之一，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等作用[1-3]。此外，苦參堿能減輕放療、化療的不良反應(yīng)，減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[4]，提高患者生存質(zhì)量，但其作用機(jī)制尚不明確。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，苦參堿對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用[5-6]，且能降低腫瘤細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)。而VEGF和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）為血管生成的相關(guān)因子，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。臨床研究表明，子宮平滑肌腫瘤患者腫瘤組織中VEGF陽性表達(dá)率相較于癌旁組織顯著增加[9]。王秀巖等[10]發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者中VEGF，HIF-1α 陽性表達(dá)率分別為 70．5%、57．2%，且兩者之間呈正相關(guān)。本研究通過建立結(jié)腸癌荷瘤小鼠模型，灌胃不同劑量苦參堿，研究苦參堿對荷瘤小鼠的治療作用，同時(shí)考察造模給藥后荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、HIF-1α表達(dá)，初步探究其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株 Balb/c小鼠40只，雄性，體質(zhì)量（20．0±1．0）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)于SPF級清潔環(huán)境中，恒溫恒濕，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始造模給藥。小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26（北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司）。

1.2 主要試劑及儀器 苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品（C15H24N2O），分子量248．37（國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；胎牛血清（Biological Industries，貨號：04-001-1ACS）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（HyClone，貨號：SH30809．01）；雙抗（Gibco，貨號：15240-096）；0．25%胰蛋白酶（Gibco，貨號：25200-072）；總RNA提取試劑盒（天根生物科技有限公司，貨號：DP419-02），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根生物科技有限公司，貨號：KR116-02）、熒光定量擴(kuò)增試劑盒（天根生物科技有限公司，貨號：FP205-02）；兔抗鼠 VEGF（abcam，貨號；ab2349）、兔抗鼠HIF-1α（博奧森生物科技有限公司，貨號：bs-20399R），免疫組化二抗（博奧森生物科技有限公司）；多功能讀扳機(jī)（Thermo，型號：5250030）；光學(xué)顯微鏡（Olympus，型號：IX2-UCB-2）；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（Bio-Rad）。

1.3 CT26細(xì)胞復(fù)蘇與傳代 CT26細(xì)胞1支，將細(xì)胞放入37℃水浴快速融化，用無菌操作法將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入5 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)液（RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗），離心后將細(xì)胞重懸入5 mL完全培養(yǎng)液，接種至25 cm2瓶中，37℃，5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)。隔天換液，至細(xì)胞密度80%左右時(shí)，用胰酶消化傳代。

1.4 荷瘤小鼠模型建立及分組 選取Balb/c小鼠，雄性，體質(zhì)量（20．0±1．0）g，分別于右腋下接種 0．2 mL經(jīng)生理鹽水稀釋的CT26細(xì)胞懸液5×106個(gè)/mL，接種后培養(yǎng)21 d。將40只小鼠隨機(jī)分為模型組，陽性藥組，苦參堿低劑量組，苦參堿中劑量組，苦參堿高劑量組，于接種7 d后每天分別灌胃生理鹽水0．2 mL，環(huán)磷酰胺 25 mg/kg，苦參堿 12．5 mg/kg，苦參堿 25 mg/kg，苦參堿 50 mg/kg，連續(xù)灌胃 14 d[11-12]。

2 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.1 荷瘤小鼠一般情況、瘤質(zhì)量及抑瘤率 各組小鼠均于第14天給藥2 h后，稱體質(zhì)量，將小鼠頸椎脫臼處死，處死后剪開右腋下皮膚，分離腫瘤組織，盡量剔除骨頭及毛發(fā)，保證腫瘤組織的完整性，經(jīng)生理鹽水沖洗后用濾紙吸干，稱質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（模型組平均瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量）×100%/模型組平均瘤質(zhì)量。

2.2 荷瘤小鼠腫瘤組織病理學(xué)變化 造模給藥后，收集各組荷瘤小鼠腫瘤組織，用福爾馬林溶液固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組荷瘤小鼠腫瘤組織病理學(xué)變化。每組6個(gè)樣本，每個(gè)樣本選取5個(gè)增殖最活躍區(qū)域，進(jìn)行核分裂象計(jì)數(shù)[13]。細(xì)胞處于有絲分裂期的組織病理學(xué)特征為：核膜消失，染色體呈深染毛刺樣，對稱或不對稱分布于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)染色略淺。這樣的細(xì)胞記為1個(gè)核分裂象，計(jì)數(shù)時(shí)，在最活躍區(qū)連續(xù)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野（400×），并將所得數(shù)值累加。

2.3 熒光定量PCR檢測 造模給藥后，收集各組荷瘤小鼠腫瘤組織，采用總RNA提取試劑盒（天根生物科技有限公司，貨號：DP419-02）提取腫瘤組織中RNA，使用UV法檢測每個(gè)樣品中的總RNA濃度。計(jì)算 OD260/280，OD260/280，選取比值在 1．8～2．0 內(nèi)的樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（天根生物科技有限公司，貨號：KR116-02），擴(kuò)增采用SYBR Green Real Time RT-PCR試劑盒（天根生物科技有限公司，貨號：FP205-02），運(yùn)用qPCR法考察各組小鼠腫瘤組織中VEGF、HIF-1α基因表達(dá)，采用β-Actin為內(nèi)參，具體引物序列見表1。

表1 引物序列

2.4 免疫組化造模給藥后，收集各組荷瘤小鼠腫瘤組織，用福爾馬林溶液固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，免疫組化法檢測各組小鼠腫瘤組織中VEGF（abcam，貨號：ab2349）、HIF-1α（博奧森生物科技有限公司，貨號：bs-20399R）的表達(dá)水平。VEGF定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，HIF-1α主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中也有少量表達(dá)，鏡下觀察，圖片背景呈藍(lán)紫色，陽性產(chǎn)物呈棕黃色或黃色。400倍鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察，每張切片隨機(jī)選擇不相重疊的5個(gè)視野，利用軟件（Image-pro Plus6．0）對陽性區(qū)域進(jìn)行圖像處理，計(jì)算積分光密度（IOD）[14-15]，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 21．0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料服從正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)及LSD-t驗(yàn)，P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 苦參堿對結(jié)腸癌荷瘤小鼠的治療作用 各組小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中均未出現(xiàn)死亡。與模型組相比，陽性藥組（P＜0．01）、苦參堿低劑量組（P＜0．01）、苦參堿中劑量組（P＜0．01）、苦參堿高劑量組（P＜0．01）小鼠腫瘤重量顯著降低；與陽性藥組相比，苦參堿低、中、高劑量組各組瘤重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。具體見表2。

表2 各組小鼠一般情況、瘤質(zhì)量及抑瘤率比較（±s）

表2 各組小鼠一般情況、瘤質(zhì)量及抑瘤率比較（±s）

注：與模型組相比，**P＜0．01。

組別 瘤質(zhì)量（g） 抑瘤率（%）模型組 6．70±0．80 —陽性藥組 5．33±0．82** 20．44苦參堿低劑量組 5．27±0．94** 21．34苦參堿中劑量組 5．83±0．64** 12．99苦參堿高劑量組 5．60±0．66** 16．42 n 8 8 8 8 8體質(zhì)量（g）24．15±1．41 22．44±1．35 23．20±1．42 24．34±1．27 24．92±1．76

3.2 給藥后各組小鼠腫瘤組織病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果表明，模型組小鼠腫瘤組織中可見大量核分裂象，與模型組相比，陽性藥組、苦參堿低劑量組、苦參堿中劑量組、苦參堿高劑量組小鼠腫瘤組織中核分裂象顯著減少（P＜0．01），細(xì)胞壞死程度更為嚴(yán)重；而苦參堿高劑量組核分裂象與陽性藥組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。以上結(jié)果提示苦參堿具有一定的抗腫瘤作用。具體見圖1、表3。

3.3 苦參堿對荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá)水平的影響 熒光定量PCR結(jié)果顯示，各組小鼠腫瘤組織中VEGF在mRNA的表達(dá)水平差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=8，F(xiàn)=33．452，P＜0．05）。與模型組相比，陽性藥組（P＜0．01）、苦參堿低劑量組（P＜0．05）、苦參堿中劑量組（P＜0．01）、苦參堿高劑量組（P＜0．01）荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF在mRNA的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，具體見圖2。

表3 各組小鼠核分裂象計(jì)數(shù)（±s）

表3 各組小鼠核分裂象計(jì)數(shù)（±s）

注：每高倍視野（HPF）直徑為 0．55 mm；與模型組相比，**P＜0．01；與陽性藥組相比，##P＜0．01。

組別 核分裂象個(gè)數(shù)（/10HPF）模型組 33．07±4．32##陽性藥組 14．13±3．03**苦參堿低劑量組 15．27±3．76**苦參堿中劑量組 13．33±3．96**苦參堿高劑量組 10．73±3．37**##

經(jīng)不同劑量苦參堿干預(yù)后，各組小鼠腫瘤組織中HIF-1α在mRNA的表達(dá)水平差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=8，F(xiàn)=35．100，P＜0．05）。與模型組相比，陽性藥組（P＜0．05）、苦參堿低劑量組（P＜0．01）、苦參堿中劑量組（P＜0．01）、苦參堿高劑量組（P＜0．01）荷瘤小鼠腫瘤組織中HIF-1α在mRNA的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，具體見圖3。

圖1 造模給藥后各組小鼠腫瘤組織HE染色（n=6，標(biāo)尺：50 μm）

圖2 各組小鼠腫瘤組織中VEGF mRNA表達(dá)水平（n=8）

圖3 各組小鼠腫瘤組織中HIF-1α mRNA表達(dá)水平（n=8）

3.4 苦參堿對結(jié)腸癌荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、HIF-1α水平的影響 各組腫瘤組織免疫組化結(jié)果表明，VEGF陽性產(chǎn)物呈棕黃色表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核中，見圖4。圖像分析結(jié)果顯示，與模型組相比，陽性藥組（P＜0．01）、苦參堿低劑量組（P＜0．05）、苦參堿中劑量組（P＜0．01）、苦參堿高劑量組（P＜0．01）VEGF的IOD值顯著降低，而苦參堿中、高劑量組的VEGF表達(dá)水平與陽性藥組相比，也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），具體見表 4。HIF-1α 陽性產(chǎn)物呈棕黃色，主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中也有少量表達(dá)，見圖5。圖像分析結(jié)果顯示，各給藥組HIF-1α表達(dá)量較模型組均顯著降低（P＜0．05），而與陽性藥組相比，苦參堿低劑量組 IOD 值差異顯著（P＜0．05），具體見表4。

4 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，許多中藥的活性成分具有抗腫瘤作用[16]?？鄥A是中藥苦參中提取的一種生物堿，臨床常選取苦參堿/氧化苦參堿注射液治療消化系統(tǒng)腫瘤[17-18]。有臨床研究表明：苦參堿聯(lián)合化療治療晚期結(jié)腸癌療效顯著，能減少化療帶來的毒副作用[19]；與單純化療相比，采用復(fù)方苦參注射液聯(lián)合化療藥物可提高晚期結(jié)直腸癌的近期療效，改善患者生存質(zhì)量[20]?？鄥A能抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株體外增殖，其機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[21]，且苦參堿能抑制K-ras基因突變型結(jié)腸癌細(xì)胞的生長[22]?？鄥A通過抑制p38信號通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[11]。除此之外，苦參堿對H22腫瘤細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用，且能提高H22肉瘤小鼠的生存質(zhì)量[23]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，灌胃不同劑量苦參堿后，與模型組相比，結(jié)腸癌荷瘤小鼠腫瘤重量顯著減輕，腫瘤組織形態(tài)學(xué)有明顯改變，腫瘤組織中核分裂象顯著減少，提示苦參堿具有一定的抗腫瘤作用。

表4 各組小鼠腫瘤組織中VEGF及HIF-1α表達(dá)的比較[±s，IOD（×106）]

注：與模型組相比，*P＜0．05，**P＜0．01；與陽性藥組相比，#P＜0．05；與陽性藥組相比，##P＜0．01。

組別模型組陽性藥組苦參堿低劑量組苦參堿中劑量組苦參堿高劑量組n 3 3 3 3 3 VEGF HIF-1α 15．38±1．84## 18．06±1．34##8．37±0．84** 9．42±1．53**9．25±1．45* 14．01±1．02*#5．21±0．89**# 7．68±0．43**3．47±0．43**## 5．94±1．14**

圖4 給藥后各組小鼠腫瘤組織VEGF免疫組化染色（n=6，標(biāo)尺：50 μm）

圖5 給藥后各組小鼠腫瘤組織HIF-1α免疫組化染色（n=6，標(biāo)尺：50 μm）

臨床研究表明，結(jié)腸癌患者腫瘤組織中VEGF、HIF-1α水平較癌旁組織表達(dá)上調(diào)，二者均與結(jié)腸癌腫瘤直徑、TNM分期及分化程度有關(guān)[24]，VEGF表達(dá)水平與結(jié)腸癌病理性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[25]。腫瘤細(xì)胞生長需要大量的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)以滿足其能量代謝和細(xì)胞增殖的需要，這個(gè)過程離不開血管生成，而VEGF是介導(dǎo)腫瘤血管生成的關(guān)鍵因素[26-28]，這對腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移十分重要[29]。已報(bào)道，某些中藥單體能通過調(diào)控VEGF/VEGFR2信號通路抑制結(jié)腸癌移植瘤血管生成[30]。HIF-1α是激活VEGF的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它位于多個(gè)促血管生成基因的上游[31-32]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞表達(dá)HIF-1α，HIF-1α能調(diào)控VEGF并使其表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)血管新生[33]。此外，腫瘤的缺氧狀態(tài)能幫助腫瘤細(xì)胞抵抗放療和化療所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性[34-35]。

研究結(jié)果表明苦參堿可顯著降低荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)，提示苦參堿可能是通過抑制荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF和HIF-1α表達(dá)從而發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，本研究采用環(huán)磷酰胺作為陽性藥物進(jìn)行比較，結(jié)果顯示苦參堿中、高劑量對結(jié)腸癌荷瘤小鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)影響與環(huán)磷酰胺處理無顯著差異，然而苦參堿能否作為環(huán)磷酰胺的替代藥物治療腫瘤有待進(jìn)一步研究。