巖五加中具有抗癌轉(zhuǎn)移活性的吲哚類(lèi)生物堿的分離

趙 晶，史國(guó)茹，段宏泉

（1.天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300462；2.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心藥學(xué)院，天津 300070）

中藥巖五加[Tetrastigmaobtectum（Wall.）Planch]主要用于治療風(fēng)濕、跌打損傷，還可治療月經(jīng)不調(diào)、骨髓炎等癥[1]。目前尚無(wú)關(guān)于巖五加化學(xué)成分的報(bào)道，在同屬藥用植物研究中，有提取得到黃酮、甾醇、有機(jī)酸類(lèi)化合物的報(bào)道[2-6]。陳圣斌[7]研究葡萄科崖爬藤屬植物扁擔(dān)藤 [Tetrastigma planule（Hook.）Gagnep]的干燥藤莖，提取得到化學(xué)成分中含有原兒茶酸；徐碩等[8]從三葉青石油醚萃取部分首次分離得到 9-羥基-10，12-十八碳二烯酸，（4R，5R）-4-羥基-5-異丙基-2-甲基環(huán)己-2-烯酮，（4S，5R）-4-羥基-5-異丙基-2-甲基環(huán)己-2-烯酮，（3R，4R，6S）-3，6-二羥基-1-薄荷烯，肉桂酸，這5種成分是首次從崖爬藤屬植物中分離得到的；李兵等[9]從扁擔(dān)藤乙酸乙酯部位中分離得到6種化合物，其中的正三十四烷酸、1-二十三烷醇、沒(méi)食子酸乙酯和香草醛為首次從該植物中分離得到的化合物。在本文中，從巖五加的乙酸乙酯提取物中分離得到2種新的吲哚類(lèi)生物堿，通過(guò)1D，2D-NMR和HR質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析化合物的結(jié)構(gòu)，分別為崖爬藤堿A（1）和崖爬藤堿B（2）?；衔?和2顯示出陽(yáng)性的抗癌轉(zhuǎn)移活性。

1 儀器與材料

1.1 儀器 半制備高效液相色譜儀[SSI Lab Alliance高效液相色譜系統(tǒng)（SeriesⅢpump），JASCO高效液相色譜系統(tǒng)（PU-2089 plus）]；旋光儀[MC 241 digital polarimeter（PERKIN-ELMER）]；質(zhì)譜儀[Alliance 2695 Quattro Micro TM ESI（Waters，液質(zhì)聯(lián)用色譜儀），Varian 7.0 T ESI電噴霧質(zhì)譜儀（Varian 7.0 T FTICR-MS）]；核磁共振儀[Bruker AVANCE Ⅲ 400 instrument，1H-NMR（400 MHz），13C-NMR（100 MHz），各溶劑峰做內(nèi)標(biāo)]。

生物活性篩選實(shí)驗(yàn)所用到設(shè)備：全自動(dòng)酶標(biāo)板分析儀（Model 680，BIO-RAD 公司）；5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（HF160W，Heal Force公司）；超凈工作臺(tái)（SWCJ-2G，蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 材料 中藥來(lái)源：巖五加[Tetrastigma obtectum（Wall.）Planch]全株采自湖北建始。

細(xì)胞來(lái)源：乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231由天津醫(yī)科大學(xué)免疫教研室贈(zèng)。

藥品和溶劑：乙醇、甲醇、冰醋酸、乙酸乙酯、二氯甲烷，均為分析純，天津市基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；氘代試劑 CDCl3、DMSO-d6、Cambridge Isotope Laboratories，Inc.USA。

細(xì)胞培養(yǎng)用試劑：胎牛血清（NUC0153，Hyclone公司）；0.25%（含 EDTA）胰蛋白胨（Bioin）；胎牛血清白蛋白（BSA，聯(lián)星生物技術(shù)有限公司分裝）；HDMEM 培養(yǎng)液（NUL0219，Hyclone公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司）；EGF（CBL417F，Millipore公司）；Hu Plasma Fibronectin（NMM1604793，Millipore公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取和萃取 取干燥巖五加莖葉7．96 kg粉碎，95%乙醇加熱回流3次，每次6 h，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮成浸膏，得提取物400 g。提取物加水混懸后，乙酸乙酯萃取，得萃取物75 g。

2.2 乙酸乙酯提取物的分離 巖五加乙酸乙酯提取物（75 g），硅膠柱色譜（400 g，100～200目）分離，用P．E．：EtOAc[3∶1，2∶1，1∶1，EtOAc（5%MeOH），EtOAc（10%MeOH），EtOAc（20%MeOH）]和 MeOH 梯度洗脫，利用TLC結(jié)果合并類(lèi)似組分。各組分經(jīng)硅膠柱、常壓柱、大孔樹(shù)脂、凝膠柱色譜Toyopral HW-40、制備薄層色譜（PTLC）以及制備高效液相色譜分離，得到化合物 1（140．3 mg）和化合物 2（17．6 mg）。

2.3 抗癌轉(zhuǎn)移活性篩選

2.3.1 MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng) 通過(guò)細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞傳代、細(xì)胞計(jì)數(shù)三個(gè)步驟完成。

2.3.2 EGF趨化因子濃度篩選 將 1、10、100、1 000 ng/mL不同濃度化學(xué)誘導(dǎo)因子EGF加到趨化小室下層板孔中30 μL/每孔；將預(yù)處理的8 μm的濾膜剪角處位于左上（光面朝下）置于下室上，放膠墊固定好上板，上層小室加MDA-MB-231細(xì)胞（DMEM，0．1%BM），細(xì)胞濃度 5×105個(gè)/mL，50 μL/孔。趨化板子在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3．5 h。去掉上板，取下膜，用PBS液洗膜3次，刮去膜上非特異趨化細(xì)胞并晾干，用三步染色法進(jìn)行染色。

將膜固定在載玻片上，顯微鏡下計(jì)數(shù)每孔趨化細(xì)胞數(shù)。每孔隨機(jī)取3個(gè)視野平均值作為該孔趨化細(xì)胞數(shù)，3個(gè)復(fù)孔平均值作為該濃度的趨化細(xì)胞數(shù)。不同濃度EGF濃度趨化細(xì)胞數(shù)與相應(yīng)無(wú)EGF孔趨化細(xì)胞數(shù)的比率為該孔的趨化指數(shù)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，選擇趨化指數(shù)最高的濃度作為EGF最佳趨化濃度。

2.3.3 樣品篩選 將MDA-MB-231細(xì)胞鋪于6孔板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，使其貼壁，24 h后6孔板內(nèi)加入樣品，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育24 h。

將樣品處理過(guò)的細(xì)胞用0．25%的胰酶消化后，用含10%FBS培養(yǎng)液終止消化，將該細(xì)胞懸液1 300 rpm離心5 min。上清液倒出，加0．1%BM將細(xì)胞混勻后再次1 300 rpm離心5 min后，計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)成5×105個(gè)/mL，置孵箱內(nèi)備用。

冰上操作配制趨化因子EGF，加在趨化小室的下室，每孔30 μL，包被好的膜左上剪角，光面朝下鋪于下室上，放好膠墊，固定上室，將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液加到上室，每孔50 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3．5 h后，取出下室，刮去沒(méi)有趨化的細(xì)胞，用三步染色試劑固定和染色，將膜用石蠟油固定，于顯微鏡下計(jì)數(shù)（方法同上）。

在統(tǒng)計(jì)計(jì)算方法上，數(shù)據(jù)用SPSS 11．5進(jìn)行處理，計(jì)算公式：

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 化合物1結(jié)構(gòu)解析 化合物1在高分辨電噴霧質(zhì)譜（HR-ESI-MS）中給出的分子離子峰為m/z 394．1499[M-H]-（計(jì)算值為394．150 7），確定分子式為 C19H25NO8，[α]25D-0．14（c 1．3，甲醇）?；衔?1 的核磁共振氫譜（低廠區(qū)）顯示該化合物具有4個(gè)苯環(huán)質(zhì)子[δH7．51（1H，d，J=8．0 Hz），7．50（1H，d，J=8．0 Hz），7．12（1H，m），7．03（1H，m）]，1 個(gè)單峰次甲基質(zhì)子信號(hào)（δH7．24），高場(chǎng)區(qū)顯示1個(gè)與氧原子相連的乙基信號(hào)[δH1．16（3H，t，J=7．1 Hz），4．06（2H，q，J=7．1 Hz）]，1 個(gè)亞甲基質(zhì)子[δH3．06（1H，dd，J=14．5，5．0 Hz），2．92（1H，dd，J=14．5，7．6 Hz）]，1 個(gè)含氧次甲基信號(hào)[δH4．26（1H，dd，J=7．6，5．0 Hz）]，1 個(gè) β 葡萄糖端基質(zhì)子（δH5．36，d，J=9．0 Hz）。化合物 1 的核磁共振碳譜（13C NMR）數(shù)據(jù)中顯示出19個(gè)碳信號(hào)，包括8個(gè)雙鍵碳原子信號(hào)（δC111．1、124．9、128．7、119．0、121．6、119．6、111．1、136．9），1 個(gè)羰基信號(hào)（δC174．2），1 個(gè)含氧次甲基信號(hào)（δC71．2），和1個(gè)葡萄糖部分。除去1個(gè)乙基和1個(gè)葡萄糖部分外，化合物1的13C NMR光譜數(shù)據(jù)與化合物（αR）-α-羥基-1H-吲哚-3-丙酸[8]的碳譜特征相似。根據(jù)以上信息，可以推測(cè)化合物1是吲哚類(lèi)生物堿的葡糖苷類(lèi)化合物。

在HMBC譜中，1個(gè)與氧原子相連的乙基（δH4．06）和含氧次甲基（δH4．26，H-9）與羰基（δC174．2，C-10）存在遠(yuǎn)程相關(guān)，H-2（δH7．24）和 C-1’（δC85．0）存在遠(yuǎn)程相關(guān)，H-1’（δH5．36）和 C-2（δC124．9），以及 C-7a（δC136．9）存在遠(yuǎn)程相關(guān)。因此，乙氧基和葡萄糖基分別位于C-10和N-1位?；衔?主要的HMBC相關(guān)性結(jié)果見(jiàn)圖1所示。

圖1 化合物1主要的HBMC相關(guān)圖

通過(guò)酸水解實(shí)驗(yàn)和樣品的TLC分析確定糖基為D-葡萄糖，以及 H-1’（δH5．36，d，J=9．0 Hz）的耦合常數(shù)顯示為 β 構(gòu)型的葡萄糖。此外，H-9（βH4．26，dd，J=7．6，5．0 Hz） 的耦合常數(shù)與 malassezialactic acid[10]一致，顯示出負(fù)旋光性。由此表明化合物1在C-9處具有R-構(gòu)型。綜上所述，化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定見(jiàn)圖2所示。

圖2 化合物1和化合物2的結(jié)構(gòu)圖

3.2 化合物2結(jié)構(gòu)解析 化合物2根據(jù)高分辨電噴霧質(zhì)譜（HR-ESI-MS）中給出的結(jié)果，確定分子式為 C26H29O12，[α]25D-0．43（c 1．4，甲醇）?；衔?2 的核磁共振氫譜（1H NMR）顯示該化合物具有4個(gè)苯環(huán)質(zhì)子[δH7．52（1H，d，J=8．0 Hz），7．50（1H，d，J=8．0 Hz），7．05（1H，m），7．03（1H，m）]，1 個(gè)單峰次甲基質(zhì)子信號(hào)（δH7．24），（高場(chǎng)區(qū)顯示）1 個(gè)與吸電子基相連的次甲基信號(hào)[δH4．27（1H，dd，J=7．3，5．0 Hz）]，1 個(gè)與氧原子相連的乙基信號(hào)[δH1．11（3H，t，J=7．1 Hz），4．02（2H，q，J=7．1 Hz）]，1 個(gè)亞甲基質(zhì)子[δH3．05（1H，dd，J=14．5，5．0 Hz），2．93（1H，dd，J=14．5，7．3 Hz）]，此外，化合物2中還有1個(gè)葡萄糖基和1個(gè)沒(méi)食子?；鶊F(tuán)。

除去化合物2中含有的1個(gè)沒(méi)食子酰基，化合物2的核磁共振碳譜與化合物1的碳譜類(lèi)似，通過(guò)HMBC 圖譜，H-6’（δH4．50、4．19）與羰基碳（δC166．2）存在遠(yuǎn)程相關(guān)，表明沒(méi)食子?；鶊F(tuán)定位于C-6’位。如上所述，質(zhì)子和碳信號(hào)的也是通過(guò)與上述相同的方式確定的。綜上所述，化合物2的結(jié)構(gòu)鑒定見(jiàn)圖2所示。

3.3 化合物1和2的抗癌活性評(píng)價(jià) 通過(guò)檢測(cè)化合物對(duì)表皮生長(zhǎng)因子[11]（EGF）誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231趨化遷移的抑制作用，評(píng)價(jià)各天然產(chǎn)物的抗癌轉(zhuǎn)移活性。趨化指數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。一般來(lái)講，趨化指數(shù)大于3．5以上即可用于藥物篩選。本次實(shí)驗(yàn)選擇10 ng/mL的趨化因子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。篩選結(jié)果表明，與空白組相比，化合物1和2具有明顯的抑制人乳腺癌細(xì)胞趨化遷移的活性，并具有一定的劑量依存性趨勢(shì)。在結(jié)果見(jiàn)表2所示和圖3～6所示。

表1 不同濃度趨化因子下MDA-MB-231細(xì)胞趨化指數(shù)的測(cè)定

表2 化合物1和2的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性結(jié)果

4 討論

中藥的多種類(lèi)型成分都具有抗腫瘤作用，主要包括生物堿、多糖類(lèi)、萜類(lèi)、蛋白質(zhì)、黃酮類(lèi)和蟾蜍甾二烯類(lèi)成分[12]。其中萜類(lèi)和生物堿類(lèi)抗腫瘤活性成分最多[13]。

圖3 DMSO對(duì)照遷移細(xì)胞圖（×100）

圖4 化合物1干預(yù)的人乳腺癌細(xì)胞遷移圖（×100）

圖5 DMSO對(duì)照的人乳腺癌細(xì)胞遷移圖（×100）

圖6 化合物2干預(yù)的人乳腺癌細(xì)胞遷移圖（×100）

臨床試驗(yàn)表明有多種中藥通過(guò)抑制細(xì)胞增殖，影響腫瘤細(xì)胞分裂和DNA復(fù)制，起到殺傷腫瘤細(xì)胞作用。中藥中提取和半合成的三尖杉酯堿、長(zhǎng)春新堿、喜樹(shù)堿、紫杉醇等是臨床常用抗癌藥物。另外，狼毒[14]、斑蝥素[15]等中藥具有明顯抗癌活性，但以上成分不僅殺傷癌細(xì)胞，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞也具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。

目前藥學(xué)科研人員對(duì)中藥、天然藥物及其有效成分對(duì)癌轉(zhuǎn)移的作用進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)許多天然化合物具有抗癌轉(zhuǎn)移作用，如白藜蘆醇[16]、黃芩苷[17]、貫葉金絲桃素[18]和茉莉酮[19]可以抑制癌細(xì)胞侵襲和遷移；姜黃素[20]、土貝母皂苷[21]，去甲斑蝥素[22]等可以抑制癌細(xì)胞黏附和侵襲；刺五加皂苷[23]、吳茱萸堿[24]可以抑制癌血管生成；槲皮素和 5，7，4’-三羥基黃酮通過(guò)改善宿主微環(huán)境[25]而起到一定的抗癌轉(zhuǎn)移作用。

文章對(duì)化合物1（崖爬藤堿A）和化合物2（崖爬藤堿B）進(jìn)行了抗癌轉(zhuǎn)移活性篩選，結(jié)果顯示，化合物1和化合物2在趨化因子EGF誘導(dǎo)下，對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的趨化運(yùn)動(dòng)都有抑制作用，趨化遷移抑制率達(dá)到70.3%，顯示了明顯的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性。本文首次發(fā)現(xiàn)吲哚類(lèi)生物堿在非細(xì)胞毒劑量下具有明顯的抗癌轉(zhuǎn)移作用，這對(duì)于發(fā)現(xiàn)非細(xì)胞毒作用的抗腫瘤轉(zhuǎn)移候選化合物具有重要的意義。化合物1和2的吲哚類(lèi)生物堿母核相同，化合物2是化合物1葡萄糖6位羥基被沒(méi)食子?；蟮漠a(chǎn)物，其趨化抑制作用弱于化合物1，其確切的構(gòu)效關(guān)系和后續(xù)的抗腫瘤作用機(jī)制有待進(jìn)一步進(jìn)行研究。