核酸適配體在沙門氏菌快速檢測中的研究進(jìn)展

王思琪，陳 萍，王 平

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130000）

0 引言

食品安全始終是關(guān)乎國民健康的大事。據(jù)《中國食品安全戰(zhàn)略研究》顯示，因微生物污染而帶來的食源性疾病被視為食品安全問題之首，沙門氏菌則是威脅人們食品安全的一種極為重要的致病菌。

沙門氏菌（Salmonella）是一種威脅人體安全的人畜共患病原菌，食用被其污染的食品會引發(fā)腸胃炎、傷寒等疾病，若不及時治療，死亡率高達(dá)10%[1]，給人體健康造成威脅。我國規(guī)定檢測食品中沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)方法較為繁瑣，耗費(fèi)人力，花費(fèi)時間一般需要4～7 d[2]。在食品工業(yè)快速發(fā)展的大背景下，如何發(fā)展?jié)M足沙門氏菌高效率、低成本檢測需求的檢測技術(shù)。研究者發(fā)現(xiàn)，利用核酸適配體這種新型識別分子，可以對沙門氏菌進(jìn)行特異性識別檢測。并且核酸適配體本身具有合成方便、成本低廉、高效識別等優(yōu)勢，與當(dāng)前食源性致病菌檢測的發(fā)展方向十分契合。

1 沙門氏菌概述

沙門氏菌是較為常見的可引起食物中毒的致病菌之一?？赏ㄟ^糞便或者口腔進(jìn)行傳播，并且沙門氏菌傳播介質(zhì)多為禽肉、蛋、奶等食品[3]。沙門氏菌作用機(jī)理主要是通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)使毒力島Ⅰ和毒力島Ⅱ編碼的一系列毒力因子作用在宿主細(xì)胞表面并在宿主細(xì)胞中大量繁殖復(fù)制。據(jù)研究表明，沙門氏菌血清型超過2 500種[4]。目前，我國對沙門氏菌快速檢測標(biāo)準(zhǔn)方法為GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》，此方法的局限性在于檢測時間長、操作繁瑣等。近年來大量研究結(jié)果表明，可將核酸適配體應(yīng)用到沙門氏菌的快速檢測中。

2 核酸適配體概述

2.1 核酸適配體概念

核酸適配體（Aptamer）又稱之為適體，是運(yùn)用體外篩選技術(shù)即指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX） 篩選出來的一種有15～40個堿基長度的單鏈結(jié)構(gòu)DNA或RNA序列[5]?？梢院吞囟ǖ陌蟹肿痈哂H和力、高特異性結(jié)合的新型寡核苷酸[6]。

2.2 核酸適配體的特點及作用機(jī)理

核酸適配體與傳統(tǒng)抗體相比有類似的抗體識別功能并且是在體外經(jīng)過化學(xué)篩選獲得的，因此也叫做“化學(xué)抗體”[7]。與此同時，核酸適配體作為新一代的識別分子也有不同于傳統(tǒng)抗體的特點：①核酸適配體可以結(jié)合的靶標(biāo)范圍廣泛，運(yùn)用SELEX技術(shù)可針對各類靶分子進(jìn)行核酸適配體的篩選?？梢允怯袡C(jī)染料、氨基酸、蛋白質(zhì)、致病菌等[8]。②核酸適配體合成成本較低，可以快速制備[9-10]。只需經(jīng)過一次篩選和測序后，就可以隨時通過化學(xué)合成儀進(jìn)行合成。③核酸適配體在常溫條件下可以保存，經(jīng)過高溫處理后仍然可以依據(jù)靶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行相應(yīng)折疊。④易于修飾，核酸適配體可在任何位置進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物常常選為有機(jī)熒光標(biāo)記物、氧化還原標(biāo)記物及納米粒子等[11]。⑤核酸適配體具有高親和力、高特異性的優(yōu)勢。由于在SELEX篩選過程中，具備親和性的核酸適配體不斷富集于文庫中，因此文庫對靶分子的親和性不斷提高[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶液中有目標(biāo)物存在時，核酸適配體能在特定的條件下通過氫鍵、靜電相互作用，堿基堆積、范德華力及構(gòu)象互補(bǔ)等方法折疊，依據(jù)靶標(biāo)的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行折疊，進(jìn)而形成某種特殊三維結(jié)構(gòu)，如假結(jié)、發(fā)卡、G-四分體、凸環(huán)[13]對靶標(biāo)進(jìn)行特異性識別。

3 核酸適配體在沙門氏菌快速檢測中的應(yīng)用

3.1 熒光適配體技術(shù)檢測沙門氏菌

熒光檢測沙門氏菌的原理是當(dāng)核酸適配體與靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合后，用熒光基團(tuán)或淬滅基團(tuán)來修飾核酸適配體，加入靶標(biāo)菌后改變適配體的構(gòu)象，從而產(chǎn)生熒光信號差異[14]。Duan N等人[15]構(gòu)建出一種由AccuBlue（一種適配體鏈）染料與部分適配體雜交的互補(bǔ)鏈（cDNA）組成的傳感器，當(dāng)沙門氏菌不存在時，適配體不與靶標(biāo)結(jié)合，不引起DNA鏈斷裂使得熒光染料AccuBlue熒光增強(qiáng)。當(dāng)沙門氏菌存在時，靶標(biāo)與核酸適配體特異性結(jié)合導(dǎo)致DNA鏈斷裂，熒光信號強(qiáng)度變?nèi)酢Ｊ褂迷摲z測沙門氏菌，檢出限達(dá)25 CFU/mL。Wang R J等人[16]通過適配體標(biāo)記熒光碳點的方法對存在于雞蛋殼和自來水中的沙門氏菌進(jìn)行檢測，檢出限為50 CFU/mL。蔣曉華等人[17]研究合成對核酸適配體有高親和力的金屬有機(jī)骨架材料Uio-66-NH2，構(gòu)建出熒光生物傳感器特異性識別沙門氏菌，此方法檢出限為7 CFU/mL，線性范圍為 1×101～1×105CFU/mL。

3.2 電化學(xué)適配體技術(shù)檢測沙門氏菌

電化學(xué)適配體技術(shù)是將核酸適配體和電化學(xué)傳感元件固定在電極上，加入靶標(biāo)之后引起電極表面修飾物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，電化學(xué)信號發(fā)生改變，進(jìn)而對靶物質(zhì)進(jìn)行定量及定性分析檢測[18]。Hasan M R等人[19]通過一步電沉積法在工作電極上修飾多壁碳納米管，然后與沙門氏菌適配體連接以形成沙門氏菌適體傳感器，使用該法檢測顯示腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的檢出限分別為55 CFU/mL和67 CFU/mL。裴倩倩[20]構(gòu)建了電化學(xué)傳感器用于特異性檢測鼠傷寒沙門氏菌，該方法利用核酸適配體與鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行特異性結(jié)合，引發(fā)ExoⅢ催化的多重信號放大反應(yīng)，在最佳條件下，檢測范圍1×101～1×107CFU/mL。

3.3 表面增強(qiáng)拉曼散射適配體技術(shù)檢測沙門氏菌

表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)（Surface-enhanced Raman scattering，SERS） 是基于納米技術(shù)和拉曼光譜技術(shù)發(fā)展而來的技術(shù)。具有樣品量少、采集速度快等特點，被廣泛應(yīng)用于食品安全等領(lǐng)域。Li H等人[21]將沙門氏菌與適配體結(jié)合，選用對氨基苯硫酚（PATP）作為拉曼活性信號分子，使棒狀金納米粒子(GNRs)和拉曼熱點形成的等離子體耦合，在菌液濃度為 56×107～56×107CFU/mL，檢測限達(dá) 9 CFU/mL。該方法已用于鼠傷寒沙門氏菌在牛奶中的檢測。Xumin X等人[22]構(gòu)建出一種基于表面增強(qiáng)拉曼散射的鼠傷寒沙門氏菌傳感器。金納米粒子作為捕獲探針，被Cy3標(biāo)記的互補(bǔ)序列修飾的納米金顆粒作為信號探針。當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌存在時，與核酸適配體結(jié)合，使其部分從互補(bǔ)序列中脫雜，降低拉曼強(qiáng)度。在最佳條件下，濃度范圍為1×102～1×107CFU/mL時菌落數(shù)呈對數(shù)線性增加，檢測限達(dá)35 CFU/mL。該方法在 1 h內(nèi)即可完成，并成功地應(yīng)用于加標(biāo)牛奶樣品的分析，結(jié)果良好，特異性高。

3.4 比色適配體技術(shù)檢測沙門氏菌

Wu W H等人[23]研究出一種基于無標(biāo)記核酸適配體和金納米粒子形成的適配體生物傳感器，將目標(biāo)菌與適配體進(jìn)行結(jié)合，吸附在未修飾的金納米粒子表面以捕獲目標(biāo)菌，并通過目標(biāo)菌誘導(dǎo)使得金納米粒子發(fā)生聚集，在高鹽條件下由紅色變?yōu)樽仙瑱z出限為105CFU/mL。Duan N等人[24]以金納米粒子為比色探針，磁性納米粒子為分離探針，建立了一種靈敏、簡便的鼠傷寒沙門菌檢測方法。首先，將適配體分別固定在金納米粒子和磁性納米粒子表面；然后，將鼠傷寒沙門氏菌加入溶液中，納米粒子表面的適體能夠特異性地與靶標(biāo)結(jié)合形成三角結(jié)構(gòu)復(fù)合物，引起懸浮液褪色和紫外可見光信號變?nèi)酰M(jìn)而對沙門氏菌進(jìn)行檢測分析，檢測范圍為25～105CFU/mL，檢出限達(dá)10 CFU/mL。

3.5 表面等離子體共振適配體技術(shù)檢測沙門氏菌

表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)靈敏度高、操作性強(qiáng)，該技術(shù)利用金屬薄膜光學(xué)耦合產(chǎn)生的物理現(xiàn)象來檢測物質(zhì)。Xu Y等人[25]設(shè)計出新型、Ω型光纖局部化表面等離子共振適配體傳感器用于實時檢測沙門氏菌，固定在等離子體表面的適配體能夠特異性捕獲鼠傷寒沙門氏菌，導(dǎo)致吸收峰的劇烈變化，檢出范圍為5×102～1×108CFU/mL，檢出限達(dá)128 CFU/mL。Oh S Y等人[26]設(shè)計出表面等離子共振芯片，將約為20 nm金納米顆粒組裝到透明基底上與適配體連接。當(dāng)沙門氏菌存在時，改變芯片的消光位移，從而達(dá)到檢測沙門氏菌的目的，該方法檢出限為104CFU/mL。狄文婷[27]構(gòu)建了表面等離子體共振生物傳感器檢測腸炎沙門氏菌的方法，結(jié)果表明其最低檢出限為2 CFU/mL。對超市購買來的雞柳、豬肉、蝦、魚食品樣品進(jìn)行檢測，其所含有的沙門氏菌含量分別為0，2～10，0，15～20 CFU/mL，對其結(jié)果進(jìn)行平板計數(shù)驗證分別為0，4，0，18 CFU/mL，證明了此檢測方法的可靠性。

3.6 納米金適配體技術(shù)檢測沙門氏菌

納米金是一種直徑在1～100 nm極為微小的顆粒，具有催化作用強(qiáng)、生物相容性強(qiáng)等特點。當(dāng)前有研究者利用納米金與適配體結(jié)合技術(shù)對鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行檢測。具體來說，適配體與納米金在溶液中結(jié)合，當(dāng)出現(xiàn)沙門氏菌時，適配體特異性結(jié)合靶物質(zhì)，從而引起納米金狀態(tài)改變，進(jìn)而對目標(biāo)菌進(jìn)行定量及定性分析。當(dāng)菌液濃度范圍為1×101～1×106CFU/mL時，檢測限達(dá)7 CFU/mL[28]，此方法可實現(xiàn)對食品中的沙門氏菌進(jìn)行靈敏并且快速檢測。

4 結(jié)語

綜上所述，核酸適配體靶標(biāo)范圍廣、穩(wěn)定性好、合成方便、易于修飾、親和力強(qiáng)，能夠特異性識別多種目標(biāo)物質(zhì)。與熒光、電化學(xué)、表面增強(qiáng)拉曼散射、比色、表面等離子體共振、納米金等技術(shù)相結(jié)合，可以實現(xiàn)高靈敏、低成本的檢測要求，因此成為了沙門氏菌快速檢測方法的研究熱點。近年來，核酸適配體高效篩選技術(shù)的研究得到了重大突破，提高了篩選的效率及質(zhì)量。相信通過研究人員的不斷努力，在其他食源性致病菌或其他領(lǐng)域高效快速檢測中，核酸適配體會得到更加深入的應(yīng)用。