通過宏基因組學(xué)研究腸道微生物對結(jié)直腸癌患者影響的最新進(jìn)展

李智杰 趙 琦 吳華星

最新全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，在全球癌癥發(fā)病率中，結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)的發(fā)病率在人群中排名第三，死亡率排名第二[1]。全球癌癥負(fù)擔(dān)正在迅速增加，中國情況也不容樂觀。Arnold等[2]發(fā)現(xiàn)近十年中國結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率都迅速上升。隨著中國工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展，人們的生活方式和環(huán)境發(fā)生巨大變化，不健康的生活方式、不良飲食以及污染導(dǎo)致結(jié)直腸癌引起的死亡率持續(xù)增加。幾十年來，研究人員一直在癌癥的形成過程、促進(jìn)癌癥進(jìn)展的原因和對治療反應(yīng)的機(jī)制等方面努力探索，在這樣的情況下，人類微生物群和微生物組對人體各系統(tǒng)的作用引起了研究人員的關(guān)注，越來越多的證據(jù)表明人體中微生物不僅與維持人體健康有關(guān)，而且與多種疾病的發(fā)展有關(guān)，甚至包括癌癥[3]。宏基因組學(xué)作為微生物研究的一種重要研究方法，在微生物與結(jié)直腸癌研究中發(fā)揮越來越重要的作用。近年來，通過宏基因組學(xué)研究腸道微生物菌群的變化為結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展提供了新的見解，并且強(qiáng)調(diào)了癌癥微生物群中宿主-微生物和微生物間相互作用的重要性。

1 宏基因組學(xué)

宏基因組學(xué)概念最早是在1998年由Handelsman等[4]提出，宏基因組指環(huán)境中所有微生物的基因總和。廣義宏基因組指特定生態(tài)環(huán)境下所有生物遺傳物質(zhì)的總和，以生態(tài)環(huán)境中全部生物DNA作為研究對象，應(yīng)用宏基因組學(xué)方法研究其彼此之間的相互關(guān)系。狹義宏基因組學(xué)指特定生態(tài)環(huán)境下全部細(xì)菌和真菌基因組DNA作為研究對象，應(yīng)用宏基因組學(xué)方法研究其彼此之間的相互關(guān)系[5]。與傳統(tǒng)方法相比，宏基因組方法是從生物樣本中取得全部微生物的基因組，不是采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)微生物的基因組。宏基因組的樣本既包括可培養(yǎng)的微生物，也包括大量的傳統(tǒng)方法無法研究的不可培養(yǎng)的微生物。傳統(tǒng)方法中大多數(shù)分子檢測僅可以使用特異性引物或探針靶向有限數(shù)量的病原體，但宏基因組方法可以表征樣品中存在的所有DNA或RNA，從而能夠分析患者樣品中的整個微生物組以及人宿主基因組或轉(zhuǎn)錄組[6]。

2 微生物與結(jié)直腸癌

微生物對于人體并不陌生，因?yàn)槿梭w在出生時就與母親的陰道和皮膚的微生物群相接觸[7]。人體中有數(shù)以萬計(jì)的微生物以與人體細(xì)胞共生的方式存在于人體中，而與身體其他部位相比，最大的人類相關(guān)微生物群落存在于胃腸道中。它們以非常微妙的關(guān)系平衡共存，通過調(diào)節(jié)宿主的代謝功能和腸上皮結(jié)構(gòu)，來影響免疫系統(tǒng)和防止病原體的定植進(jìn)而幫助維持腸道穩(wěn)態(tài)。大量研究表明，腸道微生物組紊亂與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如消化系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病、精神疾病、自身免疫性疾病以及癌癥等。已有研究表明幽門螺桿菌與胃癌及其癌前病變有密切關(guān)系，幽門螺桿菌產(chǎn)生損傷因素減弱胃粘膜的保護(hù)因素，使胃粘膜上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[8]。但腸道微生物與結(jié)直腸癌的關(guān)系尚未明確，有研究表明腸道微生物可通過多種途徑引發(fā)結(jié)直腸癌的發(fā)生。腸道微生物可通過引起慢性炎癥引發(fā)組織損傷和再生的重復(fù)循環(huán)，并產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致上皮細(xì)胞中DNA損傷的累積，最終導(dǎo)致腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9-10]。腸道微生物群的生態(tài)失調(diào)也可以引發(fā)許多與腫瘤形成過程有關(guān)的免疫應(yīng)答進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)展。如腫瘤內(nèi)的炎癥環(huán)境通過激活NF-κB和STAT3信號傳導(dǎo)并上調(diào)促增殖和細(xì)胞周期驅(qū)動基因來促進(jìn)癌癥發(fā)展[10-11]。越來越多的證據(jù)表明，結(jié)直腸癌的發(fā)生不僅通過人類腸道微生物群的誘導(dǎo)，而且還受更廣泛的微生物群落，特別是其代謝物的影響。有數(shù)據(jù)表明[12]，短鏈脂肪酸乙酸酯、丙酸酯和丁酸酯在抑制炎癥和癌癥中起作用，而其他微生物代謝物如繼發(fā)性膽汁酸則可促進(jìn)癌癥發(fā)生方面起作用，說明腸道微生物代謝產(chǎn)物具有抗炎和抗癌的雙重作用。

3 通過宏基因組學(xué)研究腸道微生物與結(jié)直腸癌的關(guān)系

3.1 宏基因組學(xué)：腸道細(xì)菌菌群與結(jié)直腸癌

人體腸道微生物以細(xì)菌群落占多數(shù)，最新研究報(bào)道中，Almeida等[13]通過宏基因組學(xué)在11 850個人類腸道微生物組中重建了92 143個宏基因組裝配的基因組，并鑒定出了腸道中存在的1 952個未培養(yǎng)的候選細(xì)菌物種。使用宏基因組測序可以將細(xì)菌種群鑒定到物種水平，并且可用于分析腸道微生物群功能。在正常人體腸道中細(xì)菌主要由厚壁菌、擬桿菌、放線菌和變形桿菌組成[14]。應(yīng)用宏基因組學(xué)對結(jié)直腸癌人群中腸道細(xì)菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與健康人群腸道細(xì)菌菌群相比，結(jié)直腸癌樣本中物種的豐富度較高[15]。研究人員通過對來自中國、奧地利、美國、德國和法國隊(duì)列的526個宏基因組樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌人群中有7種細(xì)菌含量豐富，其中有6種已被報(bào)道過與某些但不是所有人群的結(jié)直腸癌相關(guān)[16]。這6種細(xì)菌分別是：Bacteroides fragilis、Fusobacterium nucleatum、Porphyromonas asaccharolytica、Parvimonas micra、Prevotella intermedia和Alistipes finegoldii。其中Bacteroides fragilis可以在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生破壞DNA的基因毒素[17]，F(xiàn)usobacterium nucleatum通過在結(jié)直腸癌微環(huán)境中誘導(dǎo)炎癥和宿主免疫應(yīng)答來促進(jìn)腫瘤發(fā)展[18]，卟啉單胞菌也被鑒定為與不同人群的結(jié)直腸癌相關(guān)[19]，Parvimonas micra在結(jié)直腸癌中顯著富集，并且在中國隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)Parvimonas micra與Fusobacterium nucleatum強(qiáng)烈相關(guān)[20]。在先前的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Alistipes屬與結(jié)直腸癌相關(guān)，并從結(jié)直腸癌患者的血培養(yǎng)中分離出了Alistipes finegoldii[21]。在結(jié)直腸癌豐富度高的菌種中，有四種細(xì)菌(Porphyromonas asaccharolytica、Fusobacterium nucleatum、Prevotella intermedia、Parvimonas micra)在人類口腔中也存在，已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)口腔細(xì)菌和結(jié)直腸癌之間存在相關(guān)性[22]。在結(jié)直腸癌人群中，除細(xì)菌豐富度改變外，細(xì)菌之間的相互作用也可以維護(hù)腸道微生物群的穩(wěn)定，其破壞可有助于結(jié)直腸癌的發(fā)生，一些共生細(xì)菌的減少可以對結(jié)直腸癌中顯著富集的細(xì)菌抑制作用降低，使其豐度增高。在結(jié)直腸癌中Parvimonas micra與Fusobacterium nucleatum強(qiáng)烈相關(guān)，但這兩種細(xì)菌在正常健康對照組中豐度并不顯著，表明結(jié)直腸癌環(huán)境可能是形成這種相關(guān)性的重要因素，這兩種菌群在結(jié)直腸癌中可能存在協(xié)同作用。

3.2 宏基因組學(xué)：腸道真菌菌群與結(jié)直腸癌

目前大多數(shù)腸道微生物研究都集中在細(xì)菌微生物群上，但越來越多的證據(jù)表明，與細(xì)菌微生物群一樣，真菌微生物群經(jīng)常在疾病狀態(tài)中發(fā)生變化，真菌生態(tài)失調(diào)對結(jié)直腸癌的發(fā)生也有影響。糞便中的真菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)菌數(shù)量，每克糞便中含有105～106個真菌細(xì)胞，而細(xì)菌細(xì)胞為1011個[23]。但真菌細(xì)胞的長度是細(xì)菌細(xì)胞的10倍，體積是細(xì)菌細(xì)胞的100倍，這表明真菌生物量和真菌衍生的代謝物不能僅從細(xì)胞數(shù)量上與細(xì)菌進(jìn)行比較[24]。

環(huán)境中大約存在10萬種真菌，但其中只有300種已知可引起動物或人類感染[25]。在健康的人體腸道中，整體真菌多樣性低于細(xì)菌[26]，一般<20種[27]，并且個體間變異性高[26]。在大多數(shù)人胃腸道中發(fā)現(xiàn)有10個屬含量豐富，被認(rèn)為可能是核心腸道真菌菌群：假絲酵母屬(特別是白假絲酵母)、釀酒酵母屬(特別是釀酒酵母)、青霉屬、曲霉屬、隱球酵母屬、馬拉色屬(特別是馬拉色菌)、枝孢屬、半乳糖酵母、德巴利酵母和絲孢酵母[28-29]。有研究表明，腸道真菌組成的變化與結(jié)腸直腸癌發(fā)生有關(guān)。Coker等[30]通過宏基因組學(xué)方法首次證明糞便真菌譜可以預(yù)測結(jié)直腸癌，與細(xì)菌和其他臨床參數(shù)無關(guān)。研究中發(fā)現(xiàn)，反映真菌失調(diào)的擔(dān)子菌與子囊菌的比率在結(jié)直腸癌中的值高于對照組。與對照組相比，在結(jié)直腸癌中馬拉色菌增加，而酵母菌和肺氣球菌減少。在科的層面上，結(jié)直腸癌中Lipomycetaceae顯著減少，而Pisolithaceae、Marasmiaceae、Malasseziaceae、Erysiphaceae、Pseudorotiaceae和Chaetomicaeae增加，在屬的水平上，結(jié)直腸癌有六種真菌含量豐富，包括Malassezia、Moniliophthtora、Rhodotorula、Acremonium、Thielaviopsis和Pisolithus。這些結(jié)果表明腸道真菌菌群生態(tài)失調(diào)可能在結(jié)直腸癌中發(fā)揮作用。糞便真菌失調(diào)可能為使用真菌物種作為結(jié)直腸癌的非侵入性診斷生物標(biāo)志物開辟新的機(jī)會。

3.3 宏基因組學(xué)：腸道細(xì)菌-真菌相互作用與結(jié)直腸癌

許多研究結(jié)果表明細(xì)菌和真菌在腸道內(nèi)相互作用，通過不同程度的共生作用相互影響。這些相互作用可分為三大類：互惠、共棲和競爭[24]。由于結(jié)直腸癌的復(fù)雜性和多因素性，這種共生作用被破壞，可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)[30]，健康人對照組比結(jié)直腸癌組中真菌與細(xì)菌之間的相關(guān)性少，在結(jié)直腸癌組中可觀察到強(qiáng)烈的共排他性關(guān)系。在對照組中，發(fā)現(xiàn)子囊菌門(Leotiomycetes、Sordariomycetes、Eurotiomycetes和一類未分類的毛霉菌)與細(xì)菌變形桿菌門(Proteobateria)的α-變形菌(Alphaproteobacteria)、γ-變形菌(Gammaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)和β-變形菌綱(Betaproteobacteria)具有協(xié)同關(guān)聯(lián)性。相反，在結(jié)直腸癌組中，Pucciniomycetes、Exobasidiomycetes和Malasseziomycetes，其與主要細(xì)菌類別(包括α-變形菌、γ-變形菌、δ-變形菌綱和纖維粘網(wǎng)菌)形成顯著的共排他性。此外，在對照組中真菌類錘舌菌綱、糞殼菌綱和散囊菌綱的共生相互作用，在結(jié)直腸癌組中被轉(zhuǎn)變成共同排斥作用，這揭示了在健康人體內(nèi)腸道微生物通過共生協(xié)同的關(guān)系維持動態(tài)平衡，但在結(jié)直腸癌中這種動態(tài)平衡卻被破壞。這些研究結(jié)果表明腸道中的真菌和細(xì)菌之間存在復(fù)雜的關(guān)系，它們之間的拮抗作用可能導(dǎo)致結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。

4 小結(jié)與展望

越來越多的證據(jù)表明，腸道微生物群的改變可能是結(jié)直腸癌發(fā)生或進(jìn)展的促進(jìn)因素。通過宏基因組學(xué)的研究，已發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)菌、真菌以及細(xì)菌-真菌相互作用可能有助于結(jié)直腸癌的發(fā)生。但目前宏基因組學(xué)在腸道微生物群研究方面仍存在一些不足。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，未來我們可以將宏基因組學(xué)與宏蛋白組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏代謝組學(xué)等多組學(xué)研究方法相結(jié)合，從而進(jìn)一步了解腸道微生物對結(jié)直腸癌患者的影響，確定針對結(jié)直腸癌診斷具有特異性的微生物標(biāo)志物和有益微生物，以期望獲得更好的結(jié)直腸癌診斷工具和治療方法。