EphB6受體在惡性腫瘤中的研究進展

包 樂 唐麗萍

癌癥侵襲性在實體腫瘤患者的死亡中起著重要作用，細胞黏附和遷移的解除原因是懷疑驅(qū)動侵襲行為。促紅細胞生成素肝細胞受體(Erythropoietin-producing hepatocellular，Eph)家族是酪氨酸激酶受體家族中最大的一個亞族，至少包括14個受體和8個配體，Eph受體分為A型(1-10)和B型(1-6)，其相應(yīng)的Ephrin配體也分為EphrinA(1-5)和EphrinB(1-3)[1]，其與配體Ephrin的相互作用控制著細胞的黏附、遷移和增殖，可能決定癌癥侵襲性的程度。與這些作用一致的是，部分Eph成員已證實參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其中EphB6因其激酶結(jié)構(gòu)域的改變而缺乏催化能力使其具有特殊性，其廣泛表達于人體的很多正常組織。檢測多種惡性腫瘤組織發(fā)現(xiàn)EphB6表達下調(diào)，并且其低表達水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而在各種腫瘤細胞系中EphB6具有抑制腫瘤細胞異常增殖、遷移、侵襲的作用。因此，EphB6被認為是一種潛在的腫瘤抑制因子。隨著對EphB6的進一步研究發(fā)現(xiàn)，EphB6的表達缺失與其啟動子的高甲基化狀態(tài)有關(guān)，降低EphB6啟動子甲基化水平可恢復(fù)EphB6的表達，從而參與腫瘤抑制作用。然而EphB6在腫瘤中的具體作用的研究尚未完善，現(xiàn)就EphB6在部分腫瘤中的作用及其部分機制予以闡述。

1 Eph/Ephrin的結(jié)構(gòu)特點及功能

Eph受體為跨膜I型糖蛋白，包括三個結(jié)構(gòu)域：糖基化的胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)(具有酪氨酸激酶活性的功能區(qū))和連接二者的跨膜區(qū)(由疏水氨基酸組成)[2]，胞外區(qū)中N端球狀結(jié)構(gòu)域決定了受體與配體結(jié)合的特異性；胞內(nèi)區(qū)中的突出后密度蛋白——大盤-密閉小帶(Post-synaptic density protein，Discs large，Zonula occludens，PDZ)結(jié)構(gòu)域能夠識別Ephrin并結(jié)合，Eph受體和Ephrin配體通過納摩爾親和力結(jié)合形成活性四聚體復(fù)合物[3]，進而導(dǎo)致受體的激活，致其自身磷酸化，磷酸化的Eph-Ephrin通路進一步激活其下游因子。異于其他信號傳導(dǎo)的方向，Eph受體同Ephrin配體相結(jié)合后為雙向信號傳導(dǎo)，其特殊性導(dǎo)致后續(xù)的信號處理復(fù)雜化[4]，也有助于在不同生理和病理狀態(tài)下Eph-Ephrin信號的精細調(diào)控，從而參與內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、重塑等過程[5-6]。

自1980年代發(fā)現(xiàn)Eph以來，Eph受體和Ephrin配體被發(fā)現(xiàn)參與了人體中越來越多的生理和病理過程，不僅參與神經(jīng)和血管系統(tǒng)的發(fā)育，還參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，Eph受體和Ephrin配體結(jié)合誘導(dǎo)相反的反應(yīng)，如細胞黏附或排斥，促進或抑制細胞增殖和細胞遷移，以及進展或抑制多種惡性腫瘤。在Eph家族中，EphB6是一種激酶非活性的Eph受體，其激酶結(jié)構(gòu)域包含多種保守氨基酸的改變。EphB6表現(xiàn)出很多抑癌基因的特性。與正常組織相比，EphB6在乳腺癌[7]、結(jié)直腸癌[13-17]、黑色素瘤[11]、胃癌[23-24]等腫瘤組織中表達下調(diào)，并且往往導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲性增強。隨著對EphB6的更深入研究，其有望成為腫瘤診斷、治療和判斷預(yù)后的新靶點。

2 EphB6與惡性腫瘤

2.1 EphB6與乳腺癌

女性乳腺癌死亡率很大程度上歸因于原發(fā)乳腺癌的轉(zhuǎn)移，F(xiàn)ox等[7]為了更好的探究EphB6在乳腺癌發(fā)展中的潛在作用，檢測了不同乳腺癌細胞系中EphB6的表達情況。研究發(fā)現(xiàn)，在四種侵襲性乳腺癌細胞系中，有三種侵襲性乳腺癌細胞系中均發(fā)現(xiàn)了EphB6的缺失，在非侵襲性乳腺癌細胞系中卻含有大量的EphB6蛋白，而以EphB6蛋白過表達載體轉(zhuǎn)染了侵襲性乳腺癌細胞系后，發(fā)現(xiàn)侵襲性乳腺癌細胞系的體外侵襲性顯著下降，可以證明EphB6能夠降低乳腺癌侵襲能力。

在其發(fā)生機制方面，他們的另一項研究利用甲基化特異性PCR實驗證實EphB6啟動子在侵襲性乳腺癌細胞系MDA-MB-231中發(fā)生高甲基化，使EphB6在侵襲性乳腺癌細胞系MDA-MB-231中表達沉默，符合之前的實驗結(jié)果，EphB6的低表達可導(dǎo)致腫瘤的侵襲性增強，而用去甲基化5′-氮雜-2′-脫氧胞苷處理侵襲性乳腺癌細胞系后可促使EphB6受體重新表達，降低腫瘤的侵襲能力，而這正證實了EphB6甲基化后可失去其表達功能，進而增強了腫瘤細胞侵襲性的可能[8]。

為了進一步證實在侵襲性乳腺癌細胞系中EphB6啟動子甲基化使其表達沉默的可能性，Kandpal等[9]做了進一步實驗。他們利用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)區(qū)分甲基化和非甲基化的EphB6啟動子，來預(yù)測EphB6的轉(zhuǎn)錄本及蛋白的表達。發(fā)現(xiàn)MSP是一種檢測EphB6的表達敏感性極高的實驗方法，且既往實驗顯示，EphB6的表達是乳腺癌腫瘤表型的一個指標(biāo)，進而推測，EphB6的MSP可作為乳腺癌的潛在診斷和預(yù)后檢測方法。

作為乳腺癌最致命的類型，三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC)具有較高的耐藥性及轉(zhuǎn)移性，并且缺乏靶向治療。Toosi等[10]發(fā)現(xiàn)，在TNBC中，EphB6受體可部分逆轉(zhuǎn)TNBC細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，通過RAS-ERK的信號通路增加了干細胞多能性調(diào)節(jié)基因(OCT4)的表達，從而增加了腫瘤起始因子(TICs)種群的擴張，而表達EphB6受體的TICs種群被證明對阿霉素治療更敏感，可能意味著EphB6能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為增殖更快、抵抗力更弱的細胞，說明表達EphB6受體的TNBC可具有更高的藥物敏感性，未來對TNBC的治療將更有效。

2.2 EphB6與黑色素瘤

Hafner等[11]實驗結(jié)果顯示，在mRNA水平上，與良性痣相比較，黑色素瘤及轉(zhuǎn)移瘤上EphB6的表達呈進行性顯著下降。免疫組化結(jié)果顯示，普通痣染色EphB6染色均勻，黑色素瘤細胞及轉(zhuǎn)移瘤染色從異質(zhì)性陽性轉(zhuǎn)完全陰性。證明黑色素瘤疾病進展到轉(zhuǎn)移性疾病與EphB6基因表達顯著降低有關(guān)，這將對惡性黑色素瘤患者的預(yù)后及今后的基因靶向治療產(chǎn)生較重要的影響。

為了填補細胞-微環(huán)境在調(diào)節(jié)遷移行為中的作用研究方向的空白，Bailey等[12]利用胚胎神經(jīng)嵴高度的侵襲性，以它作為模型來探究轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞-微環(huán)境相互作用，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞-微環(huán)境相互作用在促進、抑制和指導(dǎo)腫瘤細胞運動方面均起到了重要作用，同時觀察到EphB6受體的重新表達迫使轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞偏離雞胚胎移植模型典型遷移模式，顯著降低了轉(zhuǎn)移潛能，而且在絨毛膜尿囊膜(CAM)轉(zhuǎn)移試驗中，表達EphB6的黑色素瘤細胞顯示轉(zhuǎn)移潛能顯著降低。上述實驗結(jié)果闡明了EphB6的抗轉(zhuǎn)移特性，恢復(fù)EphB6蛋白表達可能是轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤的基因治療方法。

2.3 EphB6與結(jié)直腸癌

潘笑露、陳昌浩等[13-14]的研究結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，結(jié)直腸癌組織EphB6蛋白表達下調(diào)，結(jié)合臨床病理資料結(jié)果，EphB6基因和蛋白在腫瘤組織中表達下調(diào)與轉(zhuǎn)移有關(guān)，例如EphB6表達下調(diào)與臨床分期、病理分期及淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，但尚未發(fā)現(xiàn)其表達下調(diào)與浸潤深度和分化程度具有相關(guān)性。說明EphB6表達丟失可能參與腫瘤的早期發(fā)生及腫瘤進展過程，并且導(dǎo)致預(yù)后較差。

Peng等[15]進一步證實上述觀點，他們采用免疫染色法及PCR法分別檢測結(jié)直腸癌及鄰近正常組織的蛋白和mRNA水平。結(jié)果提示，與腺瘤和正常組織相比，結(jié)直腸癌中的EphB6的蛋白表達降低，并且83.8%的癌組織中檢測到低水平的EphB6 mRNA表達，結(jié)直腸癌中EphB6蛋白的丟失與分化不良、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期及浸潤深度呈正相關(guān)，并且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者預(yù)后較差，一并揭示EphB6低表達與患者整體生存期差有關(guān)。

Mateo-Lozano等[16]使用EphB6小鼠敲除模型，發(fā)現(xiàn)EphB6的丟失不會有效的引起腸道腫瘤發(fā)生，同時與其他EphB受體不同，EphB6不參與腺瘤向癌轉(zhuǎn)變的早期進展，然而，研究人員重新在含有結(jié)腸癌細胞的免疫缺陷小鼠尾靜脈注射EphB6后卻顯著降低了免疫缺陷小鼠中肺內(nèi)結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移生長。相反，在對照組的實驗?zāi)Ｐ椭?，EphB6的下調(diào)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移病灶數(shù)量的增加。一致的，與180例原發(fā)腫瘤患者相比，在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，EphB6表達明顯降低?？傊藢嶒炇状巫C明了EphB6在結(jié)直腸腫瘤轉(zhuǎn)移擴散中的作用。

在另一組研究中，彭李博等[17]在結(jié)直腸癌和正常腸上皮細胞細胞系中應(yīng)用實時熒光定量PCR和甲基化特異性PCR兩種方法分別檢測EphB6 mRNA的表達情況和DNA甲基化狀態(tài)，實驗結(jié)果提示啟動子甲基化可能是EphB6受體在結(jié)直腸癌中低表達或缺失的機制之一。綜上所述，EphB6可能是結(jié)直腸癌的保護性基因，可抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移及抑制腫瘤進展。

2.4 EphB6與非小細胞肺癌(NSCLC)

Bulk等[18]應(yīng)用體內(nèi)實驗表明，突變的EphB6表達增強了NSCLC的體內(nèi)轉(zhuǎn)移，其低表達與早期NSCLC不良預(yù)后密切相關(guān)。EphB6表達減少與突變失活導(dǎo)致的EphB6功能缺失可能是肺癌轉(zhuǎn)移的原因之一。鐵茹等[19]在體內(nèi)體外實驗中均證實穩(wěn)定表達EphB6的A549肺癌細胞系可增加細胞的黏附能力，降低腫瘤細胞的遷徙能力，鐵茹、Yu等[20-21]采用過表達和RNA干擾方法也分析了EphB6在NSCLC中的生物學(xué)功能。研究顯示，在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上，與正常組織相比，NSCLC腫瘤組織中的EphB6 mRNA和EphB6蛋白水平明顯降低，并同時證明EphB6基因啟動子區(qū)的高甲基化是導(dǎo)致NSCLC中的EphB6 mRNA表達下降和蛋白質(zhì)表達水平降低的重要原因，而在用5-aza-2′-脫氧胞苷處理NSCLC細胞株后，可使EphB6的表達恢復(fù)，增加了細胞黏附，充分表明EphB6的表達可降低腫瘤細胞的遷移，而高甲基化則是其中一重要機制。盡管關(guān)于EphB6對NSCLC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制研究還不是特別明確，但以上實驗均提示EphB6是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，其啟動子在NSCLC中經(jīng)常被高甲基化而沉默，恢復(fù)其表達有可能為預(yù)防NSCLC發(fā)生轉(zhuǎn)移提供新的方法。

2.5 EphB6與卵巢漿液性癌

丁潔等[22]采用免疫組化方法觀察EphB6在卵巢癌的蛋白表達情況。此實驗結(jié)果同乳腺癌、NSCLC研究結(jié)果類似，從正常輸卵管、卵巢良性腫瘤、卵巢交界性腫瘤到卵巢漿液性癌，EphB6表達呈進行性顯著降低，EphB6在卵巢漿液性癌中也表現(xiàn)出抑癌基因的功能，同時實驗表明EphB6缺失表達或低表達主要見于高級別漿液性卵巢癌及晚期患者，EphB6蛋白表達水平與腫瘤分化程度、TNM分期及Ki-67表達均有關(guān)(P<0.05)，隨訪結(jié)果顯示，EphB6高表達患者預(yù)后明顯優(yōu)于低表達患者。Gu等[23]也證實了EphB6在卵巢漿液性癌中的這種低表達特性。在卵巢腫瘤中EphB6的研究較少，其作用機制尚不清楚，通過其既往在其他惡性腫瘤中的研究，我們推斷其機制可能與EphB6啟動子區(qū)甲基化或免疫系統(tǒng)調(diào)控相關(guān)，也為后續(xù)探究卵巢癌診治提供新思路。

2.6 EphB6與胃癌

Liu等[24]首次探討了EphB6在胃癌中的臨床意義，他們發(fā)現(xiàn)，EphB6在胃癌中有差異表達，在52.6%的胃癌標(biāo)本中低表達，在32.9%的標(biāo)本中中度表達，在14.5%的標(biāo)本中高表達。與正常粘膜表達相比，胃癌組織中EphB6表達顯著降低。EphB6蛋白表達與腫瘤分化呈正相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期呈負相關(guān)。EphB6啟動子區(qū)CpG島的高甲基化、突變和microRNA調(diào)控可能導(dǎo)致胃癌組織中EphB6的表達降低。陳昌浩等[25]也對EphB6在胃癌中的表達進行了相關(guān)實驗，結(jié)果與Liu等的結(jié)論類似，都表明EphB6作為一種轉(zhuǎn)移抑制因子參與胃癌的發(fā)生，將可能會是胃癌治療的潛在分子靶點，而具體機制仍有待進一步研究。

2.7 EphB6與前列腺癌

越來越清楚的是，EphB6在多種惡性腫瘤中有著重要的臨床意義，為了證實EphB6在前列腺癌中是否起到相同的抑癌作用，Mohamed等[26]采用免疫組化的方法探究在正常前列腺組織中和前列腺癌組織中EphB6受體的表達情況，并結(jié)合相應(yīng)的臨床病理特征驗證與癌癥進展的關(guān)系。實驗結(jié)果顯示，與正常前列腺組織比，EphB6在前列腺癌中的表達明顯降低，并且研究發(fā)現(xiàn)，在體積>4 cm3的癌組織中EphB6受體表達明顯低于體積<4 cm3的前列腺癌組織，說明至少在癌癥的早期階段，EphB6對前列腺癌起到抑制作用。并且在其機制方面，F(xiàn)ox等[27]用5-aza-2′-脫氧胞苷處理前列腺癌細胞系，同樣發(fā)現(xiàn)EphB6啟動子甲基化是其失活原因。總之，現(xiàn)有研究表明EphB6在各種惡性腫瘤中表達下調(diào)，甲基化可參與調(diào)控EphB6表達沉默。

3 小結(jié)及展望

EphB6受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到抑制腫瘤進展，控制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，盡管在乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤中分子作用機制得到部分研究，但其參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜調(diào)控機制仍未明確，并且EphB6在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中所起到的作用還存在空白。未來我們可以進行大量的臨床試驗，探究EphB6與宮頸癌的關(guān)系，找尋宮頸癌治療的新方向?？傊珽phB6與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，其表達水平有助于判斷患者預(yù)后情況，并有望成為獨立預(yù)后因子，并為靶向藥物研究和臨床治療提供新的方向。