甘草根中黃酮類化合物的提取、分離與衍生化及其抑菌活性研究

徐 曙， 趙興增， 周 倩， 陳虞超， 李林蔚，①， 郭生虎，①

〔1. 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014； 2. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心， 寧夏 銀川 750002〕

植物病害是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因子，每年植物病害的發(fā)生都會造成巨大的經(jīng)濟損失。化學(xué)防治是控制植物病害的重要手段，然而，長期使用化學(xué)農(nóng)藥會帶來嚴重的環(huán)境問題和病原菌抗藥性問題[1]。開發(fā)生物農(nóng)藥是緩解上述問題的有效途徑之一。植物源活性成分具有來源豐富、作用方式特異、不易產(chǎn)生抗藥性、對環(huán)境友好及對非靶標(biāo)生物相對安全等特點，是開發(fā)新型生物農(nóng)藥的理想對象[2]。

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)的干燥根和根莖為常用中藥材，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳以及調(diào)和諸藥等功效；現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：甘草還具有抑菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化和保肝等作用[3]。此外，甘草根部及莖葉提取物對多種植物病原真菌和卵菌的菌絲生長或孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用[4-6]，而甘草黃酮類化合物可能是其主要抑菌活性成分之一[6]。

甘草黃酮類化合物是甘草中一類重要的化學(xué)成分，具有豐富的生物活性[7]，其中部分黃酮類化合物對包括植物病原菌在內(nèi)的多種微生物的抑菌活性較強，可作為生物農(nóng)藥先導(dǎo)化合物開發(fā)利用[8-12]。例如：甘草素、異甘草素、半甘草異黃酮B和光甘草定等化合物對多種植物病原真菌、卵菌和細菌具有顯著的抑菌作用[8，13-15]。然而，目前甘草黃酮類化合物對植物病原菌抑菌活性的研究仍不全面，影響其進一步的開發(fā)利用。

為進一步探明甘草黃酮類化合物對植物病原菌的抑菌活性，作者采用硅膠柱層析和重結(jié)晶方法從甘草根中分離和提取了6個黃酮類化合物單體，進行結(jié)構(gòu)修飾后獲得了3個乙酰化衍生物，并使用核磁共振和旋光技術(shù)進行了結(jié)構(gòu)鑒定；采用菌絲生長速率法和比濁法測定這9個化合物在10 μg·mL-1時對植物病原真菌和細菌生長的抑制率，并進一步測定了具有抑菌活性的黃酮類化合物對植物病原菌的EC50(有效中濃度)和EC90(抑制率90%時的化合物濃度)值，以期探明這9個化合物對植物病原菌的抑菌活性，并為甘草的資源化利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試人工栽培甘草根于2018年10月采自寧夏回族自治區(qū)吳忠市鹽池縣高沙窩鎮(zhèn)，經(jīng)寧夏農(nóng)林科學(xué)院郭生虎研究員鑒定。供試菌種由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)周明國教授提供，包括水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、黃瓜灰霉病菌(Botrytiscinerea)、枸杞炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)和稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)7種真菌以及水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)1種細菌。培養(yǎng)真菌所用的PSA培養(yǎng)基含200 g·L-1去皮土豆的浸出液、20 g·L-1蔗糖和16 g·L-1瓊脂粉[16]；培養(yǎng)細菌所用的NB培養(yǎng)液含3 g·L-1牛肉浸膏、5 g·L-1多聚蛋白胨、1 g·L-1酵母浸膏和10 g·L-1蔗糖，pH 7.0[17]。所有培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min后待用。

儀器和試劑：Jasco P-1020全自動數(shù)字旋光儀(日本Jasco公司)；Bruker AV-500 MHz型核磁共振儀(德國Bruker公司)；柱層析色譜硅膠(200～300目)(青島海洋化工廠)；薄層色譜硅膠GF254(青島海洋化工廠)；EYELA N-1300D-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(日本東京理化器械株式會社)；DF-110集熱式磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)；721G可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；SPX-250BSH-Ⅱ生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。乙酸乙酯(分析純)、石油醚(分析純)、體積分數(shù)95%乙醇(分析純)、甲醇(分析純)、三氯甲烷(化學(xué)純)、三乙胺(化學(xué)純)、乙酸酐(化學(xué)純)、吡啶(化學(xué)純)、4-二甲氨基吡啶(化學(xué)純)和無水硫酸鈉(分析純)購自天津市富宇精細化工有限公司；甲基硫菌靈(純度99%)和噻枯唑(純度95%)購自上海源葉生物科技有限公司；配制培養(yǎng)基所用試劑及耗材購自南京壽德試驗器材有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取和分離 將5 kg干燥的甘草根粉碎，然后用體積分數(shù)80%乙醇加熱回流提取3次，提取液合并后，減壓濃縮至無醇味，所得浸膏加5 L蒸餾水溶解，然后用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，得乙酸乙酯部分浸膏200 g。浸膏經(jīng)硅膠柱，用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(體積比100∶0至0∶100)進行梯度洗脫，得到Fr.1至Fr.10共10個組分。其中Fr.2(11.55 g)經(jīng)硅膠柱反復(fù)分離、純化和甲醇重結(jié)晶，得到化合物Ⅰ(21 mg)〔石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(體積比20∶1)〕、化合物Ⅱ(16 mg)〔石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(體積比10∶1至1∶1)〕和化合物Ⅲ(19 mg)〔石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(體積比10∶1至1∶1)和三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)(體積比10∶1至1∶1)〕；Fr.5(9.43 g)經(jīng)硅膠柱反復(fù)分離、純化和甲醇重結(jié)晶，得到化合物Ⅳ(28 mg)〔石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(體積比5∶1至1∶1)〕和化合物Ⅴ(23 mg)〔石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(體積比5∶1至1∶1)〕；Fr.7(7.86 g)經(jīng)硅膠柱反復(fù)分離、純化和甲醇重結(jié)晶，得到化合物Ⅵ(116 mg)〔石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(體積比10∶1至1∶1)和三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)(體積比50∶1至10∶1)〕。

1.2.2 衍生物合成

1.2.2.1 4，4′-O-二乙酰基異甘草素(化合物Ⅶ)的合成 將異甘草素(500.00 mg，1.95 mmol)和吡啶(4.00 mL)混合均勻，升溫至80 ℃，加入乙酸酐(0.40 mL，4.25 mmol)和4-二甲氨基吡啶(4.00 mg，0.12 mmol)，反應(yīng)6 h后，待反應(yīng)液稍冷，倒入15 mL蒸餾水中，并在冰浴下持續(xù)攪拌30 min。待沉淀完全后抽濾，濾餅用少量蒸餾水淋洗，自然干燥，得黃色固體501.72 mg，收率75.6%。

1.2.2.2 4-O-乙酰基異甘草素(化合物Ⅷ)的合成

將異甘草素(500.00 mg，1.95 mmol)和吡啶(2.00 mL)混合均勻，升溫至80 ℃，加入乙酸酐(0.20 mL，2.12 mmol)和4-二甲氨基吡啶(2.00 mg，0.06 mmol)，反應(yīng)4 h后，待反應(yīng)液稍冷，倒入10 mL蒸餾水中，并在冰浴下持續(xù)攪拌30 min。待沉淀完全后抽濾，濾餅用少量蒸餾水淋洗，自然干燥，得黃色固體472.34 mg，收率81.2%。

1.2.2.3 4′-O-乙酰基甘草素(化合物Ⅸ)的合成

將甘草素(500.00 mg，1.95 mmol)和吡啶(2.00 mL)混合均勻，升溫至80 ℃，加入乙酸酐(0.20 mL，2.12 mmol)和4-二甲氨基吡啶(2.00 mg，0.06 mmol)，反應(yīng)4 h后，待反應(yīng)液稍冷，倒入10 mL蒸餾水中，并在冰浴下持續(xù)攪拌30 min。待沉淀完全后抽濾，濾餅用少量蒸餾水淋洗，自然干燥，得白色固體428.93 mg，收率73.7%。

上述3個乙?；苌锏暮铣陕肪€見圖1。

1.2.3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定 使用核磁共振儀和旋光儀對上述9個化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.4 抑菌活性測定

1.2.4.1 對植物病原真菌抑菌活性的測定 將各化合物單體溶于二甲基亞砜(DMSO)，配制成10 000 μg·mL-1母液。將PSA培養(yǎng)基加熱融化后室溫放置，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至55 ℃左右時，加入母液使其終濃度為10 μg·mL-1，倒入直徑6 cm的培養(yǎng)皿中制成含藥平板，以含等體積DMSO的PSA平板作為溶劑對照，以等濃度甲基硫菌靈為對照藥劑，另設(shè)PSA空白平板(不加溶劑或者藥液)作為空白對照。將7種真菌分別接種于PSA平板上，并在25 ℃生化培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。用打孔器在預(yù)培養(yǎng)的生長旺盛的菌落邊緣取直徑5 mm的菌碟，并接種于空白對照、溶劑對照和含藥PSA平板上，然后在25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至空白對照接近長滿平板。采用十字交叉法測量菌落直徑(扣除菌碟直徑5 mm)。抑制率計算公式為抑制率=〔(溶劑對照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑)/溶劑對照菌落直徑〕×100%。每個處理設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.4.2 對植物病原細菌抑菌活性的測定 在NB培養(yǎng)液中接種細菌并在28 ℃、175 r·min-1條件下預(yù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用可見分光光度計調(diào)節(jié)濁度(OD600)至0.02，待用。將各化合物溶于DMSO，配制成10 000 μg·mL-1母液。向NB培養(yǎng)液中加入母液使其終濃度為10 μg·mL-1，以含等體積DMSO的NB培養(yǎng)液作為溶劑對照，以等濃度噻枯唑為對照藥劑，另設(shè)NB空白培養(yǎng)液作為空白對照。向每25 mL的NB含藥培養(yǎng)液中加入100 μL濁度0.02的細菌懸浮液，在28 ℃、175 r·min-1條件下培養(yǎng)至空白對照對數(shù)生長期，使用可見分光光度計測定菌液濁度。抑制率計算公式為抑制率=〔(溶劑對照菌液濁度-藥劑處理菌液濁度)/溶劑對照菌液濁度〕×100%。每個處理設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.4.3 室內(nèi)毒力回歸方程計算 將各化合物溶于DMSO，配制成10 000 μg·mL-1母液，根據(jù)10 μg·mL-1各化合物對不同病原菌的抑制率設(shè)計濃度梯度，并使用DMSO對母液進行稀釋，得到6個不同濃度的化合物溶液。按照上述方法制備含藥PSA平板或含藥NB培養(yǎng)液，并設(shè)置溶劑對照，然后接種、培養(yǎng)病原菌，測定結(jié)果后計算抑制率，并計算毒力回歸方程、EC50值和EC90值[18]。每個處理設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，實驗重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用EXCEL 2010軟件對數(shù)據(jù)進行處理；使用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用最小顯著性差異法(LSD)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 甘草根中黃酮類化合物鑒定

甘草根中6個黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)見圖2。

化合物Ⅰ：白色粉末。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.06(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，6.92(1H，d，J=8.5 Hz，H-6′)，6.71(1H，d，J=9.9 Hz，H-1″)，6.53(1H，dd，J=8.5，2.3 Hz，H-5′)，6.49(1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，6.40(1H，d，J=2.2 Hz，H-3′)，5.61(1H，d，J=9.9 Hz，H-2″)，5.14(1H，s，OH-2′)，4.43(1H，dd，J=10.4，2.6 Hz，H-2-cis)，4.09(1H，t，J=10.2 Hz，H-2-trans)，3.81(3H，s，OCH3-4″)，3.58-3.56(1H，m，H-3)，3.04(1H，dd，J=15.9，10.9 Hz，H-4-trans)，2.92(1H，dd，J=15.6，3.7 Hz，H-4-cis)，1.48(3H，s，CH3-4″)，1.44(3H，s，CH3-5″)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：159.4(C-4′)，154.3(C-7)，151.9(C-8a)，149.8(C-2′)，129.2(C-6′)，128.9(C-2″)，128.2(C-5)，120.0(C-1′)，117.0(C-1″)，114.4(C-4a)，110.0(C-8)，108.7(C-6)，106.1(C-5′)，102.2(C-3′)，75.7(C-3″)，70.0(C-2)，55.3(OCH3-4′)，31.8(C-3)，30.6(C-4)，27.8(C-4″)，27.6(C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道的結(jié)果基本一致，故鑒定該化合物為4′-O-甲基光甘草定(4′-O-methylglabridin)。

化合物Ⅲ：白色粉末。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：9.36(1H，s，OH-2′)，9.09(1H，s，OH-4′)，6.88(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，6.85(1H，d，J=8.5 Hz，H-6′)，6.57(1H，d，J=9.9 Hz，H-1″)，6.36(1H，d，J=2.0 Hz，H-3′)，6.31(1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，6.22(1H，dd，J=8.5，2.0 Hz，H-5′)，5.67(1H，d，J=9.9 Hz，H-2″)，4.27(1H，dd，J=10.0，2.1 Hz，H-2-cis)，3.97(1H，t，J=10.0 Hz，H-2-trans)，3.35-3.31(1H，m，H-3)，2.73(1H，dd，J=15.0，12.5 Hz，H-4-trans)，2.53(1H，dd，J=15.0，2.0 Hz，H-4-cis)，1.37(3H，s，CH3-4″)，1.36(3H，s，CH3-5″)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：156.7(C-7)，154.5(C-4′)，152.1(C-8a)，150.4(C-2′)，130.1(C-2′)，128.4(C-5)，126.9(C-6′)，118.8(C-1′)，117.2(C-1″)，112.7(C-4a)，108.8(C-6)，108.0(C-5′)，107.4(C-8)，102.6(C-3′)，75.3(C-3″)，69.5(C-2)，31.0(C-4)，30.1(C-3)，27.4(C-4″)，27.3(C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道的結(jié)果基本一致，故鑒定該化合物為光甘草定(glabridin)。

化合物Ⅳ：白色粉末，體積分數(shù)10%H2SO4顯黃色。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.77(1H，d，J=8.4 Hz，H-8)，7.36(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.86(2H，d，J=8.6 Hz，H-3′，5′)，6.53(1H，dd，J=8.6，2.4 Hz，H-6)，6.40(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，5.41(1H，dd，J=13.0，3.0 Hz，H-2)，3.07(1H，dd，J=17.0，13.0 Hz，H-3-trans)，2.72(1H，dd，J=17.0，3.0 Hz，H-3-cis)。13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：191.4(C-4)，165.7(C-7)，164.2(C-8a)，158.7(C-4′)，131.5(C-1′)，129.3(C-5)，129.0(C-2′，6′)，116.0(C-3′，5′)，115.3(C-4a)，111.6(C-6)，103.2(C-8)，80.6(C-2)，44.9(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道的結(jié)果基本一致，故鑒定該化合物為甘草素(liquiritigenin)。

化合物Ⅴ：黃色粉末，體積分數(shù)10%H2SO4顯橙黃色。1H-NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.16(1H，d，J=9.2 Hz，H-6′)，7.76(1H，d，J=15.6 Hz，H-β)，7.75(2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6)，7.72(1H，d，J=15.6 Hz，H-α)，6.84(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，6.40(1H，dd，J=9.2，2.4 Hz，H-5′)，6.28(1H，d，J=2.4 Hz，H-3′)。13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：192.3(C=O)，166.9(C-4′)，165.2(C-2′)，160.1(C-4)，144.6(C-β)，133.3(C-6′)，131.7(C-2，6)，128.2(C-1)，117.9(C-α)，116.6(C-3，5)，113.9(C-1′)，109.2(C-5′)，103.7(C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道的結(jié)果基本一致，故鑒定該化合物為異甘草素(isoliquiritigenin)。

Ⅰ： 4′-O-甲基光甘草定4′-O-methylglabridin； Ⅱ： Hispaglabridin B； Ⅲ： 光甘草定Glabridin； Ⅳ： 甘草素Liquiritigenin； Ⅴ： 異甘草素Isoliquiritigenin； Ⅵ： 甘草苷Liquiritin.

2.2 甘草根中黃酮類化合物的乙酰化衍生物鑒定

甘草根中黃酮類化合物的3個乙?；苌锏慕Y(jié)構(gòu)見圖3。

化合物Ⅶ：1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：13.02(1H，s，OH-2′)，7.96(1H，d，J=8.5 Hz，H-6′)，7.94(1H，d，J=15.4 Hz，H-β)，7.72(2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6)，7.58(1H，d，J=15.4 Hz，H-α)，7.23(2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，6.84(1H，d，J=2.2 Hz，H-3′)，6.77(1H，dd，J=8.8，2.2 Hz，H-5′)，2.37(3H，s，CH3-2″)，2.36(3H，s，CH3-2?)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：192.6(C=O)，169.0(C-1″)，168.4(C-1?)，165.2(C-2′)，156.7(C-4′)，152.7(C-4)，144.5(C-β)，132.2(C-1)，130.8(C-2，6)，129.8(C-6′)，122.3(C-3，5)，120.2(C-α)，117.9(C-1′)，112.8(C-5′)，111.3(C-3′)，21.2(C-2″)，21.1(C-2?)。故鑒定該化合物為4，4′-O-二乙酰基異甘草素(4，4′-O-diacetylisoliquiritigenin)。

化合物Ⅷ：1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：13.29(1H，s，OH-2′)，7.83(1H，d，J=15.4 Hz，H-β)，7.78(1H，d，J=8.8 Hz，H-6′)，7.63(2H，d，J=8.3 Hz，H-2，6)，7.46(1H，d，J=15.5 Hz，H-α)，7.16(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，6.40(1H，dd，J=8.8，1.9 Hz，H-5′)，6.35(1H，d，J=1.9 Hz，H-3′)，5.85(1H，s，OH-4′)，2.33(3H，s，CH3-2″)。故鑒定該化合物為4-O-乙酰基異甘草素(4-O-acetylisoliquiritigenin)。

Ⅶ： 4，4′-O-二乙?；惛什菟?，4′-O-diacetylisoliquiritigenin； Ⅷ： 4-O-乙?；惛什菟?-O-acetylisoliquiritigenin； Ⅸ： 4′-O-乙酰基甘草素4′-O-acetylliquiritigenin.

化合物Ⅸ：1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：10.62(1H，s，OH-7)，7.70(1H，d，J=8.7 Hz，H-5)，7.60(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，7.21(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.57(1H，dd，J=8.7，2.1 Hz，H-6)，6.42(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，5.63(1H，dd，J=12.8，2.7 Hz，H-2)，3.15(1H，dd，J=16.7，12.8 Hz，H-3-trans)，2.78(1H，dd，J=16.7，2.9 Hz，H-3-cis)，2.31(3H，s，CH3-2″)。13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：190.07(C-4)，169.62(C-1″)，165.16(C-7)，163.41(C-8a)，150.92(C-4′)，137.06(C-1′)，128.91(C-5)，128.30(C-2′，6′)，122.38(C-3′，5′)，114.04(C-4a)，111.16(C-6)，103.08(C-8)，78.94(C-2)，43.66(C-3)，21.27(C-2″)。故鑒定該化合物為4′-O-乙?；什菟?4′-O-acetylliquiritigenin)。

2.3 甘草根中黃酮類化合物及其乙?；苌锏囊志钚?/h3>

2.3.1 對植物病原菌的抑制率 10 μg·mL-1甘草根中黃酮類化合物及其乙酰化衍生物對植物病原菌的抑制率見表1。由表1可見：在10 μg·mL-1時，4′-O-甲基光甘草定、hispaglabridin B和光甘草定對大部分供試病原菌的抑制率較高。其中，4′-O-甲基光甘草定對水稻紋枯病菌和黃瓜灰霉病菌的抑制率顯著高于對照藥劑甲基硫菌靈，對小麥赤霉病菌和香蕉枯萎病菌的抑制率與甲基硫菌靈無顯著差異；hispaglabridin B對黃瓜灰霉病菌的抑制率顯著高于甲基硫菌靈，對小麥赤霉病菌的抑制率與甲基硫菌靈無顯著差異；光甘草定對水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、香蕉枯萎病菌和黃瓜灰霉病菌的抑制率顯著高于甲基硫菌靈，對油菜菌核病菌的抑制率與甲基硫菌靈無顯著差異。

表1 10 μg·mL-1甘草根中黃酮類化合物及其乙?；苌飳χ参锊≡囊种坡?/p>

異甘草素對水稻白葉枯病菌的抑制率達76.25%，與對照藥劑噻枯唑無顯著差異，但對供試真菌的抑制率均未超過20.00%；4，4′-O-二乙?；惛什菟貙λ景兹~枯病菌的抑制率高于30.00%，但顯著低于噻枯唑，對供試真菌(小麥赤霉病菌除外)的抑制率低于20.00%；4-O-乙?；惛什菟貙λ炯y枯病菌、小麥赤霉病菌和水稻白葉枯病菌的抑制率高于30.00%，其中，對水稻紋枯病菌的抑制率與甲基硫菌靈無顯著差異，但對其他植物病原菌的抑制率均低于20.00%。

此外，甘草素、甘草苷和4′-O-乙?；什菟貙λ泄┰嚥≡囊种坡示闯^20.00%，抑菌活性較低。

2.3.2 對植物病原菌的EC50和EC90值 鑒于10 μg·mL-14′-O-甲基光甘草定、hispaglabridin B、光甘草定和4-O-乙?；惛什菟貙┰囍参锊≡婢图毦哂休^好的抑菌活性，因此，進一步測定了這4個化合物對所有供試病原菌的室內(nèi)毒力；此外，10 μg·mL-1異甘草素和4，4′-O-二乙?；惛什菟貙┰嚰毦哂休^好的抑菌活性，因此，測定了這2個化合物對供試細菌的室內(nèi)毒力。結(jié)果(表2)顯示：總體上看，在10 μg·mL-1時，上述6個化合物對供試植物病原菌的抑制率越高，其對供試植物病原菌的EC50和EC90值越低。

4′-O-甲基光甘草定具有廣譜抑菌活性，對油菜菌核病菌、黃瓜灰霉病菌和稻瘟病菌的EC50值分別為5.75、5.30和9.61 μg·mL-1，EC90值分別為33.29、26.82和56.60 μg·mL-1，抑菌效果較好，其中，對黃瓜灰霉病菌的EC50和EC90值顯著低于甲基硫菌靈。此外，4′-O-甲基光甘草定對水稻紋枯病菌的EC50和EC90值與甲基硫菌靈總體上無顯著差異；對小麥赤霉病菌的EC50值與甲基硫菌靈無顯著差異，但EC90值顯著高于甲基硫菌靈；對香蕉枯萎病菌、枸杞炭疽病菌和水稻白葉枯病菌也具有一定的抑菌活性，但其EC50和EC90值顯著高于對照藥劑。

Hispaglabridin B也具有廣譜抑菌活性，但其抑菌活性總體上弱于4′-O-甲基光甘草定，其中，對黃瓜灰霉病菌的EC50和EC90值顯著低于甲基硫菌靈；對稻瘟病菌的EC50值僅4.11 μg·mL-1，與甲基硫菌靈無顯著差異，但EC90值顯著高于甲基硫菌靈；對其他供試病原菌的EC50和EC90值均顯著高于對照藥劑。

表2 甘草根中黃酮類化合物及其乙?；苌飳χ参锊≡腅C50和EC90值

光甘草定具有廣譜抑菌活性，且其抑菌活性總體上強于4′-O-甲基光甘草定。除了對枸杞炭疽病菌的EC50值為48.90 μg·mL-1外，光甘草定對其他供試病原菌的EC50值均低于10.00 μg·mL-1，其中，對水稻紋枯病菌、香蕉枯萎病菌和黃瓜灰霉病菌的EC50和EC90值均顯著低于甲基硫菌靈；對小麥赤霉病菌的EC50值顯著低于甲基硫菌靈，但EC90值無顯著差異；對油菜菌核病菌和稻瘟病菌具有較為強烈的抑菌活性，但EC50和EC90值均顯著高于甲基硫菌靈；對枸杞炭疽病菌和水稻白葉枯病菌具有一定的抑菌活性，但EC50和EC90值均顯著高于對照藥劑。

異甘草素對水稻白葉枯病菌的EC50和EC90值分別為2.98和24.79 μg·mL-1，與噻枯唑無顯著差異，并明顯低于其他5個化合物。4，4′-O-二乙?；惛什菟貙λ景兹~枯病菌具有一定的抑菌活性，但EC50和EC90值顯著高于噻枯唑。4-O-乙?；惛什菟貙λ炯y枯病菌、小麥赤霉病菌和水稻白葉枯病菌具有一定的抑菌活性，但EC50和EC90值顯著高于對照藥劑，對其他供試病原菌無抑菌活性或抑菌活性較低。

3 討論和結(jié)論

本研究從甘草根中分離得到6個化合物，衍生化得到3個化合物。依據(jù)結(jié)構(gòu)類型特征，上述9個化合物分為3種類型：4′-O-甲基光甘草定、hispaglabridin B和光甘草定為異黃酮類化合物，異甘草素、4，4′-O-二乙酰基異甘草素和4-O-乙?；惛什菟貫椴闋柾惢衔铮什菟?、甘草苷和4′-O-乙酰基甘草素為黃酮類化合物。

從抑菌活性可以看出，4′-O-甲基光甘草定、hispaglabridin B和光甘草定對大部分供試植物病原菌都有較好的抑菌活性；異甘草素僅對植物病原細菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性；4，4′-O-二乙酰基異甘草素對植物病原細菌具有一定的抑菌活性；4-O-乙?；惛什菟爻龑χ参锊≡毦哂幸志钚酝?，對部分供試植物病原真菌也具有一定的抑菌活性；其他化合物對植物病原菌無抑菌活性或抑菌活性較弱。

4′-O-甲基光甘草定、hispaglabridin B和光甘草定為光甘草定或其類似物，具有異黃酮類化合物母核結(jié)構(gòu)。在所有供試化合物中，光甘草定的抑菌活性最強，4′-O-甲基光甘草定的抑菌活性次之，二者對部分植物病原真菌的抑菌活性顯著優(yōu)于對照藥劑甲基硫菌靈或與之相當(dāng)；hispaglabridin B雖然也具有廣譜的抑菌活性，但其抑菌活性總體上低于4′-O-甲基光甘草定和光甘草定，以上數(shù)據(jù)表明異黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中B環(huán)上取代基結(jié)構(gòu)增大，可導(dǎo)致其抑菌活性降低。此外，楊春平等[8]發(fā)現(xiàn)，光甘草定對姜瘟病菌(Ralstoniasolanacearum)、番茄青枯病菌(Pseudomonassolanacearum)、大白菜軟腐病菌(Erwinacarotovora)和獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.actinidae)等植物病原細菌具有強烈的抑菌作用，對番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥赤霉病菌、馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、稻瘟病菌和茶葉炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)等植物病原真菌或卵菌的孢子萌發(fā)也具有強烈的抑制活性，與本研究的結(jié)果互為補充。何橋[12]合成了光甘草定類似物，發(fā)現(xiàn)部分類似物在高濃度時對姜瘟病菌、草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)、馬鈴薯早疫病菌(Alternariasolani)、煙草赤星病菌(Alternariaalternata)和西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)等植物病原菌有一定的抑制作用。上述研究結(jié)果顯示：光甘草定及其類似物具有開發(fā)成生物農(nóng)藥的潛力。

異甘草素、4，4′-O-二乙?；惛什菟睾?-O-乙?；惛什菟貫楫惛什菟鼗蚱溲苌?，具有查爾酮類化合物母核結(jié)構(gòu)，其抑菌活性總體上弱于光甘草定及其類似物。然而，異甘草素雖然對供試植物病原真菌未表現(xiàn)出明顯的抑菌活性，但是對供試植物病原細菌具有較高的抑菌活性，與對照藥劑噻枯唑無顯著差異，并且明顯優(yōu)于其他8個黃酮類化合物，說明異甘草素具有開發(fā)成植物細菌病害防治藥劑的潛力。4，4′-O-二乙?；惛什菟乇M管保留了對水稻白葉枯病菌的抑菌活性，但抑菌活性較異甘草素明顯下降。與異甘草素相比，4-O-乙酰基異甘草素對水稻白葉枯病菌的抑菌活性有所下降，但對水稻紋枯病菌和小麥赤霉病菌卻表現(xiàn)出一定的抑菌活性。上述研究結(jié)果顯示：在查爾酮類化合物的A、B環(huán)上引入取代基，會導(dǎo)致其抑菌活性降低。其原因可能是該化合物經(jīng)乙?；?，分子體積變大，在與靶點作用時，較大的取代基團不利于化合物深入靶點的活性腔，從而減弱化合物與靶點的作用，進而減弱抑菌活性。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)甘草素、甘草苷和4′-O-乙酰基甘草素在10 μg·mL-1時對所有供試病原菌的抑菌活性較弱。

綜合3個類型化合物的抑菌活性，對植物病原真菌的抑制效果由高到低依次為異黃酮類化合物、查爾酮類化合物、黃酮類化合物，對植物病原細菌(水稻白葉枯病菌)的抑制效果由高到低依次為查爾酮類化合物、異黃酮類化合物、黃酮類化合物。

綜上所述，從甘草中分離得到的4′-O-甲基光甘草定、hispaglabridin B和光甘草定對供試植物病原菌具有廣譜的抑菌活性，可作為新型生物農(nóng)藥先導(dǎo)化合物進行開發(fā)，異甘草素對供試細菌水稻白葉枯病菌具有較好的抑菌活性，可作為先導(dǎo)化合物開發(fā)細菌病害防治藥劑。