茶樹(shù)隱花色素基因CsCRY1和CsCRY2的克隆及表達(dá)模式分析

唐千惠， 王佳欣， 孫 康，c， 曾 亮，c， 吳致君，c，①

(西南大學(xué)： a. 食品科學(xué)學(xué)院， b. 食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， c. 茶葉研究所， 重慶 400715)

茶樹(shù)〔Camelliasinensis(Linn.) Kuntze〕隸屬于山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaLinn.)，為多年生常綠木本植物，是中國(guó)重要的葉類(lèi)經(jīng)濟(jì)作物。茶葉中富含茶多酚、茶氨酸和咖啡堿等物質(zhì)，在抗癌、抗衰老、抗炎癥和預(yù)防心腦血管疾病等方面發(fā)揮一定作用[1-2]。茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)與茶樹(shù)的生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)，光照是其重要的影響條件之一。如：采摘前適當(dāng)遮光可提高茶葉中茶氨酸等鮮爽類(lèi)物質(zhì)含量，降低黃酮等苦澀味物質(zhì)含量；長(zhǎng)日照條件可延長(zhǎng)茶芽可采周期；光質(zhì)的差異化可影響茶葉多酚類(lèi)和香氣組分[3-5]。目前，盡管憑借種植經(jīng)驗(yàn)可通過(guò)改變光照環(huán)境調(diào)節(jié)茶樹(shù)的生長(zhǎng)，但茶樹(shù)受光調(diào)控機(jī)制不明確阻礙了園藝措施精細(xì)化和育種定向化[6-7]。

植物中存在一系列的光受體，如光敏色素(phytochromes，PHYs)、向光素(phototropins，PHOTs)、隱花色素(cryptochromes，CRYs)和紫外抗性位點(diǎn)8(UV resistance locus 8，UVR8)，通過(guò)感知光質(zhì)特征和光的強(qiáng)弱以及改變光周期調(diào)節(jié)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性[8-9]。研究表明：茶樹(shù)在光照環(huán)境中的發(fā)育和代謝受到光受體的調(diào)控[3-4，10]。因此，進(jìn)一步開(kāi)展茶樹(shù)光受體基因研究對(duì)于茶園園藝措施改進(jìn)和茶樹(shù)品種改良具有重要意義。

隱花色素是一種類(lèi)似于光裂解酶的藍(lán)光/近紫外光的光受體蛋白[11-12]。植物中的Plant CRY和CRY-DASH類(lèi)隱花色素屬于光裂解酶/隱花色素超級(jí)家族(photolyase/cryptochrome superfamily)[13]。有關(guān)植物中Plant CRY類(lèi)隱花色素的研究較多，其生物學(xué)功能較為明確[13]。Plant CRY類(lèi)隱花色素具有N端的光裂解酶同源區(qū)域(photolyase homology region，PHR)以及長(zhǎng)度和序列多變的C端隱花色素延伸域(cryptochrome C-terminal extension，CCE)2個(gè)結(jié)構(gòu)域[11，13]。Plant CRY類(lèi)隱花色素通過(guò)傳導(dǎo)藍(lán)光信號(hào)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和物質(zhì)代謝，如抑制下胚軸生長(zhǎng)[14]、開(kāi)花[15]、氣孔發(fā)育[16]、子葉發(fā)育[17]和類(lèi)黃酮合成[18]等。目前，Plant CRY類(lèi)隱花色素基因已在多種植物中被分離和鑒定，如擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕[14]、水稻(OryzasativaLinn.)[19]、小麥(TriticumaestivumLinn.)[20]、番茄(SolanumlycopersicumLinn.)[21]、高粱〔Sorghumbicolor(Linn.) Moench〕[22]、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)[23]、大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕[24]和胡楊(PopuluseuphraticaOliv.)[25]等。Liu等[3]和Zheng等[4]利用茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組和代謝組對(duì)其受單色光調(diào)控的機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示：藍(lán)光促進(jìn)茶葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的積累，推測(cè)這可能與隱花色素基因介導(dǎo)調(diào)控有關(guān)。然而，茶樹(shù)中隱花色素基因尚未被克隆鑒定，其生物學(xué)功能還需進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)同源序列比對(duì)茶樹(shù)基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[26-27]，克隆到2個(gè)茶樹(shù)隱花色素基因，對(duì)其編碼蛋白序列的功能結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、二級(jí)結(jié)構(gòu)和PHR結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，對(duì)這2個(gè)基因啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了這2個(gè)隱花色素基因在不同組織以及不同光照和激素處理下的表達(dá)模式，較為系統(tǒng)地闡述了茶樹(shù)隱花色素結(jié)構(gòu)和功能特征，以期為進(jìn)一步開(kāi)展其在光照環(huán)境中網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用機(jī)制的研究提供幫助。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為茶樹(shù)品種‘福鼎大白茶’(‘Fuding Dabaicha’)1年生扦插苗，購(gòu)自南京雅潤(rùn)茶葉有限公司。

1.2 方法

1.2.1 處理方法 于2020年4月選取長(zhǎng)勢(shì)一致的茶樹(shù)幼苗種植于花盆(直徑16.5 cm,高17.5 cm)中，栽培基質(zhì)為體積比1∶1的草泥土和蛭石，然后置于RDN-300B-4人工氣候光照培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司)中，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、光照時(shí)間16 h·d-1、光照強(qiáng)度180 μmol·m-2·s-1，白光。培養(yǎng)2周后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

組織表達(dá)分析：分別選用茶樹(shù)幼苗頂部向下數(shù)第3枚葉片、嫩莖、花和嫩根。

光照處理：將茶樹(shù)幼苗分別置于白光、黑暗、藍(lán)光和紅光的培養(yǎng)箱中，分別于處理0和4 h采摘頂部向下數(shù)第3枚葉片。每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3株。實(shí)驗(yàn)用光源(白光、紅光和藍(lán)光)均為L(zhǎng)ED燈，光照強(qiáng)度均為180 μmol·m-2·s-1，其他培養(yǎng)條件與前期培養(yǎng)條件一致。

激素處理：將茶樹(shù)幼苗置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件與前期培養(yǎng)條件一致。設(shè)置0.1 mmol·L-1脫落酸(ABA)、1.0 mmol·L-1吲哚乙酸(IAA)、1.0 mmol·L-1赤霉素(GA3)和1.0 mmol·L-1的茉莉酸甲酯(MeJA)4個(gè)激素處理，其中，ABA用蒸餾水配制，IAA、GA3和MeJA用體積分?jǐn)?shù)2%乙醇配制。ABA處理以等體積蒸餾水為對(duì)照，IAA、GA3和MeJA處理以等體積的體積分?jǐn)?shù)2%乙醇為對(duì)照。每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3株。每株幼苗葉片正、反面一次性均勻噴灑20 mL處理液，分別于處理0、4、12和24 h采摘頂部向下數(shù)第3枚葉片。

所有樣品采摘后迅速浸入液氮中，然后置于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 總RNA提取、cDNA合成及基因克隆 按照Quick RNA Isolation Kit試劑盒(北京華越洋生物科技有限公司)操作說(shuō)明提取葉、莖和花中總RNA，根中總RNA提取采用Trizol提取法。采用GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit試劑盒(北京擎科生物科技有限公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)CsCRY1和CsCRY2基因的克隆引物，其中，CsCRY1-CF引物序列為5′-ATGTCAGGACGTGGGTGTAGCATAG-3′，CsCRY1-CR引物序列為5′-TTACCCAGTTTGAGAAAGCCGCCTC-3′；CsCRY2-CF引物序列為5′-ATGGGTAGCAATTCAAAAACCATTG-3′，CsCRY2-CR引物序列為5′-TTAACCTCCCACAGCTCCATTTTTG-3′。CsCRY1基因的PCR擴(kuò)增體系總體積為50 μL，包括金牌Mix(green)(北京擎科生物科技有限公司)45 μL，10 μmol·L-1CsCRY1-CF和CsCRY1-CR引物各2 μL，1 ng·μL-1模板cDNA 1 μL；CsCRY2基因的PCR擴(kuò)增體系總體積為50 μL，包括金牌Mix(green)45 μL，10 μmol·L-1CsCRY2-CF和CsCRY2-CR引物各2 μL，1 ng·μL-1模板cDNA 1 μL?；驍U(kuò)增模板cDNA來(lái)自光照處理0 h葉片。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。用1.2 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物。采用pClone007平末端載體連接PCR產(chǎn)物(北京擎科生物科技有限公司)，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，培養(yǎng)、鑒定后送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 基于茶樹(shù)基因組和轉(zhuǎn)錄組[26-27]，通過(guò)擬南芥AtCRY1(登錄號(hào)AT4G08920)和AtCRY2(登錄號(hào)AT1G04400)基因堿基序列進(jìn)行同源序列比對(duì)，檢索茶樹(shù)隱花色素基因。BLASTn和BLASTp序列檢索在NCBI(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)和BioEdit軟件中完成。使用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。采用MEGA 5.1軟件中的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用SOPMA(https：∥prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)在線軟件預(yù)測(cè)CsCRY1和CsCRY2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用SWISS-MODEL(https：∥swissmodel.expasy.org/)在線軟件預(yù)測(cè)CsCRY1和CsCRY2蛋白PHR結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用PlantCARE(http：∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線軟件分析CsCRY1和CsCRY2基因上游1 500 bp內(nèi)啟動(dòng)子順式作用元件。

1.2.4 基因的表達(dá)模式分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)在CFX96TMReal-Time System(美國(guó)Bio-Rad公司)上進(jìn)行。設(shè)計(jì)用于CsCRY1基因檢測(cè)的CsCRY1-JF引物序列為5′-TAGGGCTGAAGTGCCAACGAATGTC-3′，CsCRY1-JR引物序列為5′-TGTGGTGGAGTTGCGTTGCTTTGGA-3′；設(shè)計(jì)用于CsCRY2基因檢測(cè)的CsCRY2-JF引物序列為5′-ATCATTGCTGGGAAGCCTGAAACAT-3′，CsCRY2-JR引物序列為5′-GCATCAACCAAAGGGTAACCAGTCC-3′。擴(kuò)增體系總體積為20.0 μL，包括2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green Ⅰ)(北京擎科生物科技有限公司)10.0 μL，10 μmol·L-1正向和反向檢測(cè)引物各0.8 μL，0.05 ng·μL-1模板cDNA 2.0 μL和ddH2O 6.4 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性10 s、60 ℃退火5 s、72 ℃延伸5 s，40個(gè)循環(huán)。

組織表達(dá)和光照處理的內(nèi)參基因采用ACT基因，其CsACT-F引物序列為5′-GAGATTCCGTTGCCCTGAAGTCCTG-3′，CsACT-R引物序列為5′-TCCTTGCTCATACGGTCTGCGATAC-3′；激素處理內(nèi)參基因采用TBP，其CsTBP-F引物序列為5′-GGCGGATCAAGTGTTGGAAGGGAG-3′，CsTBP-R引物序列為5′-ACGCTTGGGATTGTATTCGGCATTA-3′[28]。采用Pfaffl[29]的方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果和分析

2.1 茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2基因的克隆與分析結(jié)果

經(jīng)序列同源比對(duì)，在茶樹(shù)中獲得2個(gè)隱花色素基因，登錄號(hào)分別為CSS0033306.1和CSS0018720.1。根據(jù)這2個(gè)基因序列設(shè)計(jì)克隆引物，以茶樹(shù)品種‘福鼎大白茶’cDNA為模板，擴(kuò)增獲得2條長(zhǎng)度約2 000 bp的明亮條帶(圖1)。經(jīng)切膠回收和連接轉(zhuǎn)化后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，將2個(gè)基因分別命名為CsCRY1和CsCRY2。CsCRY1基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為2 055 bp，編碼684個(gè)氨基酸；CsCRY2基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 944 bp，編碼647個(gè)氨基酸。CsCRY1和CsCRY2基因堿基序列的相似度較低，一致性為55.30%。與茶樹(shù)基因組比對(duì)，CsCRY1基因序列包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，CsCRY2基因序列包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。

2.2 茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2蛋白的生物信息學(xué)相關(guān)分析結(jié)果

2.2.1 功能結(jié)構(gòu)域分析 利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)CsCRY1蛋白與擬南芥AtCRY1蛋白(登錄號(hào)AAB28724)氨基酸序列的一致性為75.97%，CsCRY2蛋白與AtCRY2蛋白(登錄號(hào)NP_849588)氨基酸序列的一致性為61.54%。CsCRY1和CsCRY2蛋白氨基酸序列的N端最為保守，具有明顯的PHR結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與擬南芥對(duì)應(yīng)氨基酸序列的一致性較高(圖2-A)。此外，CsCRY1和CsCRY2蛋白氨基酸序列的C端均具有CCE結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與擬南芥對(duì)應(yīng)氨基酸序列的差異較大(圖2-A)。

M： DL5000 DNA marker； 1： CsCRY1基因CsCRY1 gene； 2： CsCRY2基因CsCRY2 gene.

截取CCE結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列片段重新進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)CsCRY1和CsCRY2蛋白的氨基酸序列均含有保守的DAS(DQXVP-Acidic-SXAESSS)基序(圖2-B)。

上述研究結(jié)果表明：茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2蛋白可能具有與擬南芥中相似的藍(lán)光信號(hào)調(diào)控機(jī)制。

2.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選取了滇山茶(CamelliareticulataLindl.)、中華獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)、蘋(píng)果〔Malusdomestica(Suckow) Borkh.〕、毛果楊(PopulustrichocarpaTorr. et A. Gray ex Hook.)、擬南芥、可可(TheobromacacaoLinn.)、葡萄(VitisviniferaLinn.)、水稻、節(jié)節(jié)麥(AegilopstauschiiCoss.)和玉米(ZeamaysLinn.)10種植物以及石果衣真菌(Endocarponpusillum)的光裂解酶/隱花色素超級(jí)家族成員序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果(圖3)顯示：在光裂解酶/隱花色素超級(jí)家族中，茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2蛋白與其他10種植物和石果衣真菌中的家族成員分為6個(gè)亞族，分別是Plant PHR2、 CRY-DASH、 (6-4)PHR、 Plant CRY、 CPD class Ⅰ PHR和CPD class Ⅱ PHR。CsCRY1和CsCRY2蛋白被分在了Plant CRY亞族中，說(shuō)明茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2蛋白屬于Plant CRY類(lèi)隱花色素。Plant CRY亞族包括Plant CRY1和Plant CRY2 2個(gè)分支，CsCRY1和CsCRY2蛋白分別分布于這2個(gè)分支。在進(jìn)化樹(shù)分支距離上，茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2蛋白與滇山茶和中華獼猴桃較近，與單子葉植物較遠(yuǎn)。

色塊顏色越深表示相似度越高The darker the color blocks， the higher the similarity.

2.2.3 二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 利用SOPMA在線軟件對(duì)茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2蛋白氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果(圖4)顯示：CsCRY1蛋白中無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)(43.13%)和α螺旋(α-helix)(41.96%)所占比例較高，β折疊(β-sheet)(9.21%)和β轉(zhuǎn)角(β-turn)(5.70%)所占比例較低；CsCRY2蛋白中也是無(wú)規(guī)則卷曲(48.84%)和α螺旋(37.71%)所占比例較高，β折疊(8.96%)和β轉(zhuǎn)角(4.48%)所占比例較低。

以擬南芥AtCRY1的PHR晶體結(jié)構(gòu)1u3d.1.A為參照模型，利用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測(cè)茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2蛋白PHR結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果(圖5)顯示：茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2蛋白的PHR結(jié)構(gòu)域與參照模型相似，主要由α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和β折疊組成，且在N端具有α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)域，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合。

分支上數(shù)據(jù)代表自展值The datums on the branches represent the bootstrap values. Cr： 滇山茶Camellia reticulata Lindl.； Cs： 茶樹(shù)Camellia sinensis (Linn.) Kuntze； Ac： 中華獼猴桃Actinidia chinensis Planch.； Vv： 葡萄Vitis vinifera Linn.； Pt： 毛果楊Populus trichocarpa Torr. et A. Gray ex Hook.； Tc： 可可Theobroma cacao Linn.； Md： 蘋(píng)果Malus domestica (Suckow) Borkh.； At： 擬南芥Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.； Ata： 節(jié)節(jié)麥Aegilops tauschii Coss.； Os： 水稻Oryza sativa Linn.； Zm： 玉米Zea mays Linn.； Ep： 石果衣真菌Endocarpon pusillum.

： α螺旋α-helix； ： β折疊β-sheet； ： β轉(zhuǎn)角β-turn； ： 不規(guī)則卷曲Random coil.

圖5 茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2蛋白PHR結(jié)構(gòu)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2.4 啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)分析 利用PlantCARE軟件對(duì)茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2基因上游1 500 bp內(nèi)啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2。

由表1可見(jiàn)：茶樹(shù)CsCRY1基因上游1 500 bp區(qū)域中主要含60個(gè)核心啟動(dòng)子元件(TATA-box)、28個(gè)啟動(dòng)子增強(qiáng)子區(qū)域元件(CAAT-box)以及多個(gè)參與光響應(yīng)的調(diào)控元件(AT1-motif、G-box、chs-CMA1a、GATA-motif和Box 4)。此外，還包括赤霉素響應(yīng)元件(P-box)、脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)、低溫響應(yīng)元件(LTR)和厭氧誘導(dǎo)必需順式作用調(diào)控元件(ARE)等。

表1 茶樹(shù)CsCRY1基因啟動(dòng)子的順式作用元件及其功能預(yù)測(cè)

表2 茶樹(shù)CsCRY2基因啟動(dòng)子的順式作用元件及其功能預(yù)測(cè)

由表2可見(jiàn)：在茶樹(shù)CsCRY2基因上游1 500 bp區(qū)域中主要含33個(gè)啟動(dòng)子增強(qiáng)子區(qū)域元件(CAAT-box)、25個(gè)核心啟動(dòng)子元件(TATA-box)以及多個(gè)參與光響應(yīng)的調(diào)控元件(ATCT-motif、AE-box和Box 4)。此外，還包括參與茉莉酸甲酯響應(yīng)的元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)、水楊酸響應(yīng)順式作用調(diào)控元件(TCA-element)、赤霉素響應(yīng)元件(TATC-box)、干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)(MBS)和厭氧誘導(dǎo)必需順式作用調(diào)控元件(ARE)等。

預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：CsCRY1和CsCRY2基因啟動(dòng)子均含有參與光響應(yīng)、赤霉素響應(yīng)和厭氧誘導(dǎo)的調(diào)控元件。CsCRY1基因啟動(dòng)子含有特有的參與脫落酸和低溫響應(yīng)元件，而CsCRY2基因啟動(dòng)子含有特有的參與茉莉酸甲酯和水楊酸響應(yīng)元件以及干旱誘導(dǎo)元件。

2.3 茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2基因的表達(dá)模式

2.3.1 不同組織中的表達(dá)模式 結(jié)果(圖6)顯示：茶樹(shù)根中CsCRY1和CsCRY2基因的相對(duì)表達(dá)水平均最高，葉中的相對(duì)表達(dá)水平次之，花中的相對(duì)表達(dá)水平較低，莖中的相對(duì)表達(dá)水平最低，且不同組織間的相對(duì)表達(dá)水平差異顯著。

2.3.2 不同光照處理的表達(dá)模式 結(jié)果(圖7)顯示：處理4 h，藍(lán)光處理下，茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2基因的相對(duì)表達(dá)水平顯著升高。白光、黑暗和紅光處理下，CsCRY1基因的相對(duì)表達(dá)水平差異不大；白光和紅光處理下，CsCRY2基因的相對(duì)表達(dá)水平無(wú)明顯變化，但較黑暗處理有所降低。

2.3.3 不同激素處理的表達(dá)模式 結(jié)果(表3)顯示：不同激素處理茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2基因的表達(dá)模式基本一致。0.1 mmol·L-1ABA處理下，CsCRY1和CsCRY2基因的相對(duì)表達(dá)水平呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，分別于處理12和4 h達(dá)到最高；1.0 mmol·L-1GA3和1.0 mmol·L-1MeJA處理下，2個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，并于處理12 h達(dá)到最高；1.0 mmol·L-1IAA處理下，2個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水呈“升高—降低—升高”的變化趨勢(shì)，于處理4 h達(dá)到最高。

： CsCRY1基因CsCRY1 gene； ： CsCRY2基因CsCRY2 gene.

： CsCRY1基因CsCRY1 gene； ： CsCRY2基因CsCRY2 gene.

表3 不同激素處理茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2基因的相對(duì)表達(dá)水平

3 討 論

盡管植物缺少感光器官，但光受體的發(fā)現(xiàn)證明植物具有感知光信號(hào)和適應(yīng)光環(huán)境的能力[30]。植物隱花色素基因最早在擬南芥的hy4突變體中分離獲得，即AtCRY1基因[14]。隨后從擬南芥中陸續(xù)獲得AtCRY2和AtCRY3基因[31-32]。AtCRY1和AtCRY2蛋白屬于Plant CRY類(lèi)隱花色素，僅存在于植物中，而AtCRY3蛋白屬于CRY-DASH類(lèi)隱花色素，廣泛分布于原核和真核生物中[13]。本研究以茶樹(shù)品種‘福鼎大白茶’為材料，克隆獲得2個(gè)隱花色素基因，分別命名為CsCRY1和CsCRY2。序列分析結(jié)果顯示：茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2蛋白與擬南芥AtCRY1和AtCRY2蛋白結(jié)構(gòu)相似，其氨基酸序列均在N端有1個(gè)光裂解酶同源區(qū)域(PHR)，在C端有1個(gè)隱花色素延伸域(CCE)，屬于Plant CRY類(lèi)隱花色素典型結(jié)構(gòu)特征[11，13，33]，推測(cè)CsCRY1和CsCRY2基因?yàn)橹参锾赜械谋Ｊ鼗颍赡茉陧憫?yīng)光信號(hào)中發(fā)揮重要作用。茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其PHR結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果同樣證明其與擬南芥AtCRY1和AtCRY2蛋白相似。

在植物中，保守的低拷貝基因常用作構(gòu)建物種系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)的有效標(biāo)記[34]。利用茶樹(shù)與其他10種植物和真菌構(gòu)建的光裂解酶/隱花色素超級(jí)家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，顯示亞族的分支區(qū)別明顯，且Plant CRY類(lèi)隱花色素的分支與APG Ⅳ系統(tǒng)中綱、目分類(lèi)相互對(duì)應(yīng)[35]，表明隱花色素基因在植物中具有保守度較高且拷貝較低的特點(diǎn)，可用于開(kāi)發(fā)植物系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)標(biāo)記。茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2蛋白在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中與同目的滇山茶和中華獼猴桃處于同一小分支，這3種植物在植物學(xué)分類(lèi)上同屬于真雙子葉植物中杜鵑花目(Ericales)，其中，滇山茶與茶樹(shù)最近，二者均隸屬于山茶科，而中華獼猴桃隸屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)，其植物學(xué)分類(lèi)和基因組進(jìn)化樹(shù)距離與茶樹(shù)較近[36]，表明Plant CRY類(lèi)隱花色素構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可用作植物屬的分類(lèi)標(biāo)記。Plant CRY類(lèi)隱花色素的生物學(xué)功能在不同植物中有所分化，是否與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分支距離有關(guān)仍有待考證。如大麥(HordeumvulgareLinn.)HvCRY1a和HvCRY1b基因通過(guò)介導(dǎo)表達(dá)脫落酸生物合成相關(guān)基因來(lái)誘導(dǎo)谷物休眠[37]；番茄隱花色素介導(dǎo)了番茄紅素在其果實(shí)中的積累[38]；茶樹(shù)隱花色素表達(dá)與光處理中多酚形成相關(guān)[4]。

隱花色素對(duì)于植物根的發(fā)育具有調(diào)控作用，如擬南芥AtCRY1基因通過(guò)參與生長(zhǎng)素的調(diào)節(jié)，促進(jìn)初生根的延長(zhǎng)以及限制側(cè)根的發(fā)育，但AtCRY2基因?qū)Ω鸬揭种谱饔肹18，39]。組織表達(dá)結(jié)果顯示：茶樹(shù)根中CsCRY1和CsCRY2基因的相對(duì)表達(dá)水平最高，其后依次為葉、花、莖，推測(cè)2個(gè)基因可能在茶樹(shù)根的發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用。該結(jié)果與胡楊PeCRY1基因的組織表達(dá)情況相似，PeCRY1基因在根和葉中的表達(dá)量最高[25]。此外，有研究表明甘菊〔Chrysanthemumlavandulifolium(Fisch. ex Trautv.) Makino〕根中ClCRY1a/b基因的表達(dá)量最低[40]，該結(jié)果與茶樹(shù)中得到的結(jié)果相反。隱花色素基因的表達(dá)與光照條件有關(guān)，其在不同植物根中的表達(dá)高低不一，推測(cè)可能與激素調(diào)節(jié)或者取樣部位有關(guān)[25，39]。

茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2基因的啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)分析顯示：在上游1 500 bp區(qū)域序列中主要存在多種光響應(yīng)和激素響應(yīng)元件，如AT1-motif、Box 4、P-box和TATC-box等元件。藍(lán)光條件下，茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2基因的相對(duì)表達(dá)水平顯著提高。擬南芥AtCRY1和AtCRY2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)不受光條件的調(diào)控，盡管其蛋白通過(guò)接受和傳導(dǎo)藍(lán)光信號(hào)調(diào)節(jié)光適應(yīng)生理活動(dòng)[41]?？梢?jiàn)，與擬南芥不同，藍(lán)光可能具有引起茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2基因轉(zhuǎn)錄以及蛋白光信號(hào)傳導(dǎo)的雙重調(diào)控作用。外源激素ABA、GA3、IAA和MeJA均能引起CsCRY1和CsCRY2基因相對(duì)表達(dá)水平的上調(diào)。啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)分析表明：ABA響應(yīng)元件和MeJA響應(yīng)元件分別為CsCRY1和CsCRY2基因啟動(dòng)子特有元件，然而ABA和MeJA均能誘導(dǎo)CsCRY1和CsCRY2基因的表達(dá)。已有研究結(jié)果表明：光信號(hào)和激素信號(hào)均處于植物信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，二者具有協(xié)同作用[42]。其中，隱花色素在光信號(hào)傳導(dǎo)中與多種激素共同調(diào)控下胚軸生長(zhǎng)、根發(fā)育和避蔭等生物學(xué)過(guò)程[18，43-44]。在茶樹(shù)中，同樣發(fā)現(xiàn)光信號(hào)與激素信號(hào)互相關(guān)聯(lián)[4]。因此，外源激素可能直接或者間接調(diào)控茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

綜上所述，本研究克隆到茶樹(shù)CsCRY1和CsCRY2基因，CsCRY1和CsCRY2蛋白具有典型的Plant CRY類(lèi)隱花色素結(jié)構(gòu)特征；可利用隱花色素高保守度、低拷貝的特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)用于構(gòu)建物種系統(tǒng)發(fā)育的分類(lèi)標(biāo)記；藍(lán)光介導(dǎo)了CsCRY1和CsCRY2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)并可能在蛋白光信號(hào)傳導(dǎo)上發(fā)揮作用；外源激素介導(dǎo)了CsCRY1和CsCRY2基因的轉(zhuǎn)錄，激素信號(hào)可能與光信號(hào)互相關(guān)聯(lián)調(diào)節(jié)生物學(xué)過(guò)程。