紅鳳菜不同器官中黃酮類和奎寧酸類成分的HPLC法測定

鮮 新， 呂 寒， 孟秀花， 馬 麗， 劉 艷， 任冰如， 陳 劍

〔江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省抗糖尿病藥物篩選技術(shù)服務(wù)中心， 江蘇 南京 210014〕

紅鳳菜〔Gynurabicolor(Willd.) DC.〕隸屬于菊科(Asteraceae)菊三七屬(GynuraCass.)，為多年生草本植物，可作為藥食兩用植物被人們利用。紅鳳菜全草均可入藥[1]，含有豐富的黃酮類、奎寧酸類和萜類等次生代謝產(chǎn)物，具有良好的止血、降血糖和抗氧化等藥理活性[2-6]。目前，從紅鳳菜地上部分已經(jīng)分離鑒定出多種酚酸類[2，7]和黃酮類成分[8-9]，并對其總黃酮含量進行了分析[10]，但對紅鳳菜不同器官中黃酮類和酚酸類成分的差異尚缺乏深入了解。

作者采用HPLC法對紅鳳菜根、莖和葉片中7個黃酮類和奎寧酸類成分的含量進行了比較和分析，以期明確紅鳳菜的最佳藥用部位，為紅鳳菜資源的合理利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試紅鳳菜于2014年引種自海南，現(xiàn)栽種于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所苗圃地，由江蘇省中國科學(xué)院植物研究所任冰如研究員鑒定。于2019年8月16日采集紅鳳菜全株1 kg，將根、莖和葉片分開；分別自然陰干，粉碎后過20目篩，備用。

主要儀器和試劑：戴安Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Dionex公司)，GL Science-Inert Sustain C18色譜柱(日本島津公司)，Mili-QTMAdvantage A10TM超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)，F(xiàn)G-24固相萃取儀(天津市富城達科技有限公司)，Welchrom?C18E固相萃取柱〔月旭科技(上海)股份有限公司〕。新綠原酸(純度99%，批號MUST-17011001)對照品購自成都曼斯特生物科技有限公司；綠原酸(純度大于98%，批號L-007-160504)、異槲皮苷(純度大于98%，批號Y-076-180517)、山奈酚-3-O-蕓香糖苷(純度大于98%，批號S-065-180314)、3，5-二咖啡?？鼘幩?純度大于98%，批號Y-068-160726)和4，5-二咖啡?？鼘幩?純度大于98%，批號Y-070-161102)對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；蘆丁(純度大于98%，批號C2/H30016)對照品購自南京春秋生物工程有限公司；其他試劑均為分析純或色譜純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 GL Science-Inert Sustain C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相為乙腈(A)和磷酸緩沖鹽(B)，梯度洗脫：0～20 min，體積分數(shù)90%B；20～25 min，體積分數(shù)90%～82%B；25～65 min，體積分數(shù)82%B；65～70 min，體積分數(shù)82%～75%B；70～75 min，體積分數(shù)75%B；75～80 min，體積分數(shù)75%～10%B；80～85 min，體積分數(shù)10%B；85～90 min，體積分數(shù)10%～90%B；90～95 min，體積分數(shù)90%B。流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，蘆丁、異槲皮苷和山奈酚-3-O-蕓香糖苷的檢測波長為254 nm，新綠原酸、綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡酰奎寧酸的檢測波長為325 nm。

1.2.2 對照品溶液制備和標準曲線繪制 精密稱取蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、新綠原酸、綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩釋φ掌愤m量，用甲醇溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為1.990、1.155、1.840、0.752、1.930、1.980和2.590 mg·mL-1的對照品溶液。蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、新綠原酸、綠原酸和3，5-二咖啡?？鼘幩岚?、10、25、50和100倍進行梯度稀釋，異槲皮苷按2、20、50和100倍進行梯度稀釋，4，5-二咖啡?？鼘幩岚?、25、250、500和1 000倍進行梯度稀釋。按照上述色譜條件進樣測定，以峰面積為縱坐標(Y)、各對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線。

蘆丁回歸方程為Y=195.940X-0.218(r=0.998 7)，線性范圍0.020～1.990 mg·mL-1；異槲皮苷回歸方程為Y=43.126X+1.062(r=0.999 3)，線性范圍0.016～2.310 mg·mL-1；山奈酚-3-O-蕓香糖苷回歸方程為Y=160.560X+3.332(r=0.999 4)，線性范圍0.018～1.840 mg·mL-1；新綠原酸回歸方程為Y=155.930X-0.212(r=0.997 3)，線性范圍0.007～0.752 mg·mL-1；綠原酸回歸方程為Y=346.460X+0.169(r=0.999 5)，線性范圍0.019～1.930 mg·mL-1；3，5-二咖啡?？鼘幩峄貧w方程為Y=458.480X-8.604(r=0.999 5)，線性范圍0.020～1.980 mg·mL-1；4，5-二咖啡酰奎寧酸回歸方程為Y=337.230X+23.133(r=0.995 1)，線性范圍0.002～2.590 mg·mL-1。

1.2.3 樣品提取和測定 分別精密稱取根、莖和葉片粉末各3份，每份約2.0 g，各加入體積分數(shù)85%乙醇70 mL，回流提取1 h，過濾；將濾液蒸至無醇味，用體積分數(shù)50%乙醇超聲溶解，蒸干；用體積分數(shù)50%甲醇復(fù)溶樣品，離心，取上清液進Welchrom?-C18E固相萃取柱，用體積分數(shù)50%甲醇洗脫；合并洗脫液，用體積分數(shù)50%甲醇洗脫，蒸干，用甲醇(色譜純)溶解，0.45 μm濾膜過濾，定容至5 mL，即為樣品溶液。按上述色譜條件進樣測定，并根據(jù)峰面積和標準曲線計算根、莖、葉樣品中7種成分的質(zhì)量濃度。根據(jù)公式“某器官某成分含量=(該器官該成分質(zhì)量濃度×稀釋體積)/該器官質(zhì)量”計算紅鳳菜不同器官中各成分含量。

1.2.4 方法學(xué)考察 精密度考察：精密吸取7個對照品溶液并混勻，按上述色譜條件重復(fù)進樣測定5次。各對照品峰面積的RSD值為0.34%～0.81%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性考察：取葉片樣品溶液，分別于0、2、4、6、8、12和24 h按上述色譜條件進樣測定。各成分峰面積的RSD值為0.67%～1.62%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性考察：稱取葉片粉末5份，按照上述方法制備樣品溶液，并按上述色譜條件進樣測定。各成分峰面積的RSD值為0.84%～1.87%，表明本方法重復(fù)性良好。

加樣回收率考察：精密稱取葉片粉末1.0 g，分別加入質(zhì)量濃度0.199 mg·mL-1蘆丁、0.231 mg·mL-1異槲皮苷、0.184 mg·mL-1山奈酚-3-O-蕓香糖苷、0.075 mg·mL-1新綠原酸、0.193 mg·mL-1綠原酸、0.396 mg·mL-13，5-二咖啡?？鼘幩岷?.259 mg·mL-14，5-二咖啡?？鼘幩岣? mL，按照上述方法平行制備6份樣品溶液，并按上述色譜條件進樣測定。計算各成分的加樣回收率和RSD值，加樣回收率為96.57%～103.60%，RSD值為0.62%～2.24%。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用EXCEL 2016和GraphPad Prism 7軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理和方差分析(two-way ANOVA)。

2 結(jié)果和分析

紅鳳菜根、莖和葉片中7個黃酮類和奎寧酸類成分的含量見表1。紅鳳菜葉片中能檢出7個黃酮類和奎寧酸類成分，其中異槲皮苷和綠原酸的含量較高，分別達到4.804和4.041 mg·g-1，蘆丁和新綠原酸含量較低；根和莖中僅能檢出綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩?，新綠原酸和黃酮類成分均未檢出。葉片中綠原酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸和4，5-二咖啡酰奎寧酸的含量顯著(P<0.05)高于根和莖，莖中這3種成分的含量也高于根，但差異不顯著。葉片中綠原酸含量分別為莖和根中的15.7和61.2倍，3，5-二咖啡?？鼘幩岷糠謩e為莖和根中的16.5和19.9倍，4，5-二咖啡?？鼘幩岷糠謩e為莖和根的34.9和41.4倍。

表1 紅鳳菜不同器官中7個黃酮類和奎寧酸類成分含量的比較

3 討論和結(jié)論

植物次生代謝產(chǎn)物對植物的生理活動有重要作用，但同種植物不同器官中次生代謝產(chǎn)物的類型和含量存在差異，如：在長葉榧(TorreyajackiiChun)不同器官中，鞣質(zhì)和黃酮等次生代謝產(chǎn)物的總含量在葉片中最高，為莖中的7.2倍[11]；在七子花(HeptacodiummiconioidesRehd.)不同器官中，次生代謝產(chǎn)物總含量在老根中最高，且主要為木質(zhì)素，而葉片中則以黃酮和總生物堿等為主[12]；同樣，在紅鳳菜不同器官中，葉片中黃酮類和奎寧酸類成分的含量最高，顯著高于根和莖。由于植物的次生代謝產(chǎn)物合成與其代謝途徑、基因表達和調(diào)控及生長環(huán)境有關(guān)[13]，因而，植物次生代謝產(chǎn)物的合成和分布通常在種屬、器官、組織以及生長發(fā)育期間存在差異。

由于植物不同器官中藥用活性成分的類型和含量不同，導(dǎo)致其不同入藥部位的藥效存在差異。本研究結(jié)果表明：在紅鳳菜葉片中能檢出7個黃酮類和奎寧酸類成分，而在根和莖中只能檢出3個奎寧酸類成分，且葉片中黃酮類和奎寧酸類成分含量均較高，因此，從藥用成分角度考慮，建議選擇紅鳳菜葉片作為藥用部位。

本研究僅以產(chǎn)自南京的紅鳳菜為研究材料，由于藥用植物的藥效還與其生境、物候期及栽培管理措施等因子密切相關(guān)，因而，后續(xù)將以不同產(chǎn)地、不同季節(jié)的紅鳳菜為研究對象，進一步明確紅鳳菜次生代謝產(chǎn)物合成和積累的影響因子，為其藥用資源的有效利用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。